SPHK1調控M2巨噬細胞極化對膀胱癌細胞上皮間質轉化的機制研究

王晨靜, 郭曉丹, 馬振禹, 黃秀英, 張 偉

(河北省保定市第二醫院病理科, 河北 保定 071000)

膀胱癌屬于泌尿系統易發腫瘤,發病率及病死率均較高[1]。脂類生物因子在腫瘤遠處擴散進程中發揮重要作用,其中鞘胺醇激酶1(Sphingosine kinascs-1,SPHK1)可以通過調控鞘脂代謝的平衡在腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲及EMT等諸多生物學活動中發揮重要作用[2]。據報道,SPHK1通過調控腫瘤的微環境以及對EMT來誘導肝細胞癌的遷移侵襲能力,促進腫瘤轉移,由SPHK1參與介導的信號通路在食管癌、結直腸癌及肝癌的遠處擴散進程中發揮重要作用[3]。腫瘤微環境相關巨噬細胞(Tumor-associated macrophage,TAMs)與腫瘤細胞活性密切相關,其中M2型巨噬細胞屬于腫瘤間質中的非腫瘤性質的細胞亞群,發揮促進腫瘤轉移的作用[4];目前SPHK1、M2型巨噬細胞極化與惡性腫瘤發展密切相關,但是二者在膀胱癌中的機制尚未闡明。本研究探討SPHK1對M2巨噬細胞極化作用的調控以及對膀胱癌細胞EMT的影響機制,為臨床研究提供基礎。

1 資料與方法

1.1實驗對象:選取小鼠巨噬細胞系Raw264.7及膀胱癌細胞系T24進行原代培養,選取P3代單層細胞納入研究。

據調查發現，鄉村女教師在教育目的、學生、課程、教師角色四個維度的信念得分均略高于鄉村男教師，而男教師在教學信念方面的得分略高于女教師。從整體來看，男女教師的教育信念在五個維度上的差異均不顯著(p>0.05)，說明其沒有性別差異。

1.2主要實驗試劑:杜氏改良培養基(DMEM)、胰蛋白酶購自上海玉博生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)、甘油明膠封片劑、BCA蛋白濃度測定盒、SDS-PAGE凝膠設備、電泳緩沖液、PVDF膜、ECL化學發光檢測試劑盒等均購自美國Gibco公司;鼠抗人SPHK1、CD206、ArgI、Survivin、MMP-2、MMP-9、E-Cadherin、Vimentin、N-Cadherin抗體、GAPDH抗體購自美國ABC公司;辣根過氧化化物酶(HRP)標記二抗購自上海碧云天有限公司;Transwell染色劑、免疫熒光相關試劑、MTT檢測試劑盒均購自美國ABC公司;LV-SPHK1、si-SPHK1慢病毒載體及陰性對照組病毒均購自上海吉凱基因有限公司。

檢測到缸套內壁的表面粗糙度約Ra1.6（Rz6.3），活塞環外壁的表面粗糙度為Ra0.4（Rz1.6）。經過8h的磨合后，檢測到缸套內壁的表面粗糙度約Ra0.4（Rz1.6），峰值減少值為：

1.3主要實驗儀器:RT-PCR檢測儀、Mini PRO型電泳儀及轉膜儀、電泳槽、凝膠成像系統、超凈工作臺、倒置顯微鏡均購自美國Beckman公司,流式細胞儀、臺式高速離心機、微量可調節儀器、生物組織石蠟包埋機、流式細胞儀等均購自美國Beckman公司。

本文對我館的讀者類型從兩個維度進行分類：首先是不同層次的讀者，包括本專科生、研究生與教職工等；其次是不同學院的讀者，包括國際經貿學院、國際商務外語學院、金融管理學院、會計學院等。借助Matlab等工具對不同的讀者借閱人數分布在2014—2018年的變化狀況進行分析，得到的結果如圖3和圖4所示。

1.4.1巨噬細胞Raw264.7培養:Raw264.7置于DMEM培養基中,向培養基中添加10%胎牛血清、10mmoL/LPBS緩沖溶液及100U/mL的青霉素和鏈霉素,在37℃、5%CO2、適宜飽和濕度環境的細胞培養箱內進行傳代培養,2～3d更換培養液,選取傳代培養到第三代對數生長期的Raw264.7細胞,計數備用。

2.2SPHK1表達對巨噬細胞極化類型的影響

2.1SPHK1在巨噬細胞內轉染分析:與Control-NC組相比,SPHK1在巨噬細胞內得到成功過及沉默表達,LC-SPHK1組SPHK1蛋白表達提升,si-SPHK1組SPHK1蛋白表達下調(P<0.05),見圖1。*P<0.05,與Control-NC組相比。

2.3.3腫瘤細胞內增殖、侵襲相關蛋白表達:與Control-NC組相比,SPHK1過表達會提升T24細胞內Survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05);SPHK1沉默則會降低T24細胞內Survivin、MMP-2、MMP-9蛋白表達(P<0.05);SPHK1過表達可以促進膀胱癌T24細胞的遷移及侵襲能力,見圖6。

采用單隱含層的BP神經網絡結構，其中輸入層和輸出層均采用2個神經節點，隱含層采用20個神經節點。隱含層與輸入層之間的傳遞函數為Sigmoid函數，輸出層與隱含層之間的傳遞函數為Purelin函數。神經網絡采用的訓練函數為trainlm函數，最大訓練歷元為5 000，訓練精度要求為1.0 e-8。誤差曲線見圖1，計算精度統計見表1。

2 結 果

1.4.3巨噬細胞Raw264.7與膀胱癌細胞系T24進行共培養:選取傳代培養到第三代對數生長期的T24細胞與各組巨噬細胞系Raw264.7進行共培養,時間為48h。

圖1 Western-blot檢測各組巨噬細胞內SPHK1蛋白表達

1.4.2SPHK1過表達、沉默質粒轉染巨噬細胞系Raw264.7:取上述第三代Raw264.7細胞系,反復吹打細胞完全消化;在3000rpm/min下離心5min后重懸處理;巨噬細胞接種到6孔板內,接種量為2mL,在37℃下培養24h,直到細胞匯合度達到30%及以上,各個孔內加入感染增強液A、P各40μL,接著加入載體SPHK1過表達(LV-SPHK1)、沉默質粒(si-SPHK1)及空白質粒(NC),均勻振蕩后將放置在恒溫培養箱內。12h后更換為10%的胎牛血清的DMEM培養基,慢病毒轉染72h后進行項目分析。

2.2.1Western-blot檢測:與Control-NC組相比,SPHK1過表達質粒轉染可以上調M2巨噬細胞標志物CD206、ArgI蛋白表達(P<0.05);SPHK1沉默質粒轉染可以下調M2巨噬細胞標志物CD206、ArgI蛋白表達(P<0.05),見圖2。

圖2 Western-blot檢測各組巨噬細胞內M2型巨噬細胞標志物蛋白表達

2.3SPHK1調控M2巨噬細胞極化對膀胱癌細胞生物活性的影響

圖3 免疫熒光化學分析各組巨噬細胞內M2型巨噬細胞標志物蛋白熒光強度(×200)。

2.2.2免疫熒光強度分析:與Control-NC組相比,SPHK1過表達質粒轉染可以上調M2巨噬細胞標志物CD206、ArgI蛋白熒光強度;SPHK1沉默質粒轉染可以下調M2巨噬細胞標志物CD206、ArgI蛋白熒光強度;提示SPHK1可以促進巨噬細胞向M2巨噬細胞極化類型轉變,見圖3。

2.3.1腫瘤細胞增殖活性:隨著細胞培養時間的延長,各組膀胱癌T24細胞均體現出增殖活性提升趨勢(P<0.05);細胞培養24h、48h以后,與Control-NC組相比,SPHK1過表達會提升T24細胞增殖活性,SPHK1沉默則會降低T24細胞增殖活性(P<0.05)見表1、圖4。

表1 MTT法檢測各組膀胱癌T24細胞增殖活性

圖4 MTT檢測各組膀胱癌細胞增殖活性

2.3.2腫瘤細胞遷移、侵襲能力分析:與Control-NC組相比,SPHK1過表達會提升T24細胞的遷移能力及侵襲能力,SPHK1沉默則會降低T24細胞遷移能力及侵襲能力(P<0.05);SPHK1過表達可以促進膀胱癌T24細胞的遷移及侵襲能力,見圖5。

圖5 劃痕實驗、Transell實驗檢測各組膀胱癌細胞的遷移及侵襲能力

1.4.4觀察指標:①免疫熒光檢測M2型巨噬細胞標志物表達:采用多聚甲醛(45g/L)固定細胞,PBS溶液進行清洗,之后加入封閉液體封閉1h,組成為0.30g BSA+5mL PBS+2.5μL Triton后將其甩干;加入1.5μL一抗(CD206:1∶1000,ArgI:1∶1000),在4℃的冰箱內孵育過夜,PBS溶液清洗三次,加入CD206、ArgI二抗(1∶500)孵育1h,采用DAPI進行染色5min,后經PBS溶液清洗后置于熒光顯微鏡下觀察誘導結果。②Western-blot檢測巨噬細胞內蛋白表達:取材后加入RIPA裂解液進行細胞懸浮液裂解處理,進行SDS-PAGE電泳分離蛋白,將檢測蛋白轉移到PVDF膜上,采用5%的脫脂牛奶封閉2.5h,TBST清洗3次;將PVDF膜與一抗在5℃下孵育過夜,采用TBST清洗;PVDF膜與熒光二抗孵育1.5h,,經TBST清洗后采用紅外成像系統進行掃描,采用Image軟件進行灰度分析;一抗稀釋比例SPHK1(1∶1500)、CD206(1∶1500)、Arg-I(1∶1000)、GAPDH(1∶1500)。③MTT法檢測T24細胞增殖能力:將處于對數生長期的T24細胞接種到96孔細胞培養板中,每孔約含1×104個細胞,培養24h后加入20μL(5mg/mL)MTT液,在37o室溫下內培養4h,棄掉培養液;加入DMSO 150μL,震蕩培養,采用酶標儀對其光密度OD(波長450nm)進行檢測,計算細胞增殖能力。④劃痕實驗檢測細胞遷移能力:移取10mg已滅菌處理的蒸餾水,將蒸餾水定容于規格為100mL的容量瓶后,獲得1mg per m的5-氟尿嘧啶溶液;移液器獲取50mL劑量的5-氟尿嘧啶溶液,使單層細胞出現一字劃痕,加入預先配置獲得的5-氟尿嘧啶溶液;利用顯微鏡完成取圖,進行分析。⑤Transwell實驗檢測細胞侵襲能力:將處于對數生長期的細胞采用PBS漂洗三次,制備單細胞懸浮液,5×105個細胞/mL,臺盼藍染色。在Transwell培養板上接種100μL細胞懸浮液,加入無血清培養基200μL。培養24h后,采用濕棉簽擦去Matrigel凝膠和聚碳酯膜表面的細胞,取出上室,用線拴住,做好標記;蘇木素染色1min,梯度乙醇脫水(70～100%),二甲苯透明;在高倍鏡下隨機取6個視野,計算平均數。⑥Western-blot檢測細胞內相關蛋白表達:其中一抗稀釋比例Survivin(1∶1500)、MMP-2(1∶1500)、MMP-9(1∶1000)、E-Cadherin(1∶1500)、Vimentin(1∶1500)、N-Cadherin(1∶1500)、GAPDH(1∶1500),其余步驟同②所示。

圖6 Western-blot檢測各組膀胱癌T24細胞內凋亡相關蛋白表達

2.3.4腫瘤細胞內EMT相關蛋白表達:與Control-NC組相比,SPHK1過表達會提升T24細胞內Vimentin、N-Cadherin蛋白表達,降低E-Cadherin蛋白表達(P<0.05);SPHK1沉默則會降低T24細胞內Vimentin、N-Cadherin蛋白表達,提升E-Cadherin蛋白表達(P<0.05);SPHK1過表達可以促進膀胱癌T24細胞EMT進程,見圖7。

1.4方 法

圖7 Western-blot檢測各組膀胱癌T24細胞內EMT相關蛋白濃度表達

3 討 論

現代醫學腫瘤學的研究發現,膀胱癌的病理發展及遠處擴散是一個復雜的病理過程,受到諸多因素影響[5]。鞘磷脂的活性代謝產物鞘氨醇激酶1(SPHK1)屬于調節體內鞘磷脂代謝的關鍵酶類物質之一,在多種實體腫瘤中呈現高表達趨勢。腫瘤局部微環境可以調節巨噬細胞極化,進而促進TAMs向促腫瘤方向的M2型極化,在多種腫瘤組織中的TAMs均具有M2型巨噬細胞的特征[6]。SPHK1可以調控腫瘤微環境內細胞成分改變,但是否對巨噬細胞的極化類型及發展趨勢具有影響目前涉及較少[7]。本論文結果SPHK1在巨噬細胞內得到成功過表達或者沉默處理,SPHK1的過表達可以促進M2型巨噬細胞標志蛋白CD206及ArgI的表達及熒光強度,反之亦然,由此看出,SPHK1可以促進M2細胞的極化比例,對腫瘤細胞發揮相應的生物學作用。

狗蛋匆匆跑下山，任山谷里的野風在耳邊吟唱。他笑了，在外學習四年后終于毫不遮擋地笑了，那爽朗的笑聲和在風中更加悅耳。

腫瘤細胞的增殖、轉移是影響患者預后的關鍵因素之一,SPHK1的表達不僅可以改變脂類分子的動態平衡,亦可以影響腫瘤細胞的周期[8]。研究結果顯示,SPHK1的過表達可以促進膀胱癌細胞的增殖,反之亦然;SPHK1的過表達亦可以促進腫瘤細胞的遷移及侵襲能力,上調細胞遷移侵襲蛋白MMP-2、MMP-9的表達,可以總結到,SPHK1通過影響提升M2巨噬細胞的極化來促進膀胱癌細胞的增殖、遷移及侵襲能力,為膀胱腫瘤的遠處擴散提供病理基礎。

利用篩選出的13對引物，對缺齒蓑蘚11個居群106份樣品進行PCR擴增，獲得了150個位點，其中148個為多態位點。11個居群的多態位點百分率為45.95% ～ 81.08%，其中最高的是浙江溫州烏巖嶺居群，最低的是浙江金華大盤山居群，物種總多態位點百分率為98.67%。

轉移是癌癥進展的關鍵性標志之一,細胞外基質的降解、EMT、腫瘤血管的生成、腫瘤微環境的改善等均會導致腫瘤的進展[9]。EMT的存在使得癌細胞更加具有侵略性,進而體現出更加強烈的侵襲性。目前靶向EMT信號通路可以給與癌癥治療起到重要理論支持[10]。SIP信號通路可以對腫瘤細胞EMT做出應答,SPHK1可以通過加速E-Cadherin溶酶體的降解來促進肝癌細胞的侵襲及轉移,進而誘導EMT,同時SPHK1的過表達可以增強腫瘤的發生,刺激癌細胞的生長、血管的生成、增殖及存活進程[11]。本研究結果顯示,T24細胞內SPHK1的過表達可以促進腫瘤細胞的EMT,提升Vimentin、N-Cadherin蛋白表達,降低E-Cadherin蛋白表達;反之亦然;上述的數據再次提示SPHK1在膀胱癌EMT中發揮重要的作用,SPHK1通過促進EMT進程來促進腫瘤細胞的增殖、遷移及侵襲能力,最終促進腫瘤的遠處擴散能力。

綜上我們得出,SPHK1過表達可以提升M2型巨噬細胞極化程度,促進膀胱癌腫瘤細胞增殖、遷移、侵襲能力及EMT進程,最終提升膀胱癌的遠處擴散能力;在后續的研究中我們將致力于進一步探究表觀遺傳學-免疫因素與腫瘤進展中的作用機制,為更多的癌癥患者的臨床治療提供理論基礎。