miR-30b通過抑制NLRP3炎癥小體激活降低心肌缺血再灌注損傷研究

杜佩珊, 姜愛雯, 田艷珍, 趙東坡, 毛建云, 宋永建

(1.河北省張家口市第一醫院, 河北 張家口 075000 2.河北北方學院附屬第一醫院藥學部, 河北 張家口 075000)

心肌缺血再灌注損傷(Myocardial Ischemia reperfusion injury,MIRI)是臨床中常見缺血性心血管疾病的病理生理表現,大約有40%的心肌組織壞死由心肌再灌注損傷引起,改善MIRI損傷可為心血管疾病的治療帶來益處[1]。miRNAS被證實在MIRI的發展進程中發揮重要作用,miR-30b屬于miR-30家族中的重要成員,其在心臟表達中高度保守,研究指出[2],miR-30b在心力衰竭患者中表達下降,且與主動脈炎、心肌肥厚小鼠病理密切相關,但是其在MIRI中的調控機制尚未闡明。炎癥小體被證實是心肌缺血再灌注損傷的重要成分。炎性小體由NLRP、Caspase-1、細胞凋亡相關斑點促蛋白(ASC)等組成,上述物質相互作用,共同激活炎癥反應,促進炎癥級聯反應,參與心肌細胞損傷,介導MIRI進程[3]。據報道,miR-30b通過靶向NLPR3炎癥小體信號通路來介導肺纖維進程,二者在MIRI進程中是否具有調控機制有待研究[4]。基于上述討論,本研究進一步探究了miR-30b、NLRP3炎癥小體之間的關系以及二者在MIRI進程中的作用機制。

1 材料與方法

1.1.1實驗對象:選取12周SPF級SD大鼠50只作為研究對象,體重范圍250～300g,均購自河北省實驗動物中心,實驗動物許可證號:SCXK(冀)2022-7-001。大鼠進行分籠飼養,晝夜交替,室內溫度控制在23～25℃,相對濕度50～70%,可自由進食水;本研究涉及動物實驗均由倫理委員會批準;實驗過程中對大鼠的處理方式均參照《關于善待動物的指導性意見》中相關要求及標準進行。

1.1.2主要實驗試劑:胰蛋白酶購自上海玉博生物科技有限公司;胎牛血清(FBS)、甘油明膠封片劑、BCA蛋白濃度測定盒、SDS-PAGE凝膠設備、電泳緩沖液、PVDF膜、ECL化學發光檢測試劑盒等均購自美國Gibco公司;鼠抗人NLRP3、ASC、Caspase-1抗體、GAPDH抗體購自美國ABC公司;辣根過氧化化物酶(HRP)標記二抗購自上海碧云天有限公司;NLRP3炎癥小體信號通路抑制劑CY-09購自上海工程有限公司;CK-MB、LDH、cTnI ELISA檢測試劑盒購自阿拉丁化學試劑有限公司;蘇木精-伊紅染色液、TUNEL檢測試劑盒均購自美國ABC公司。

1.1.3主要實驗儀器:RT-PCR檢測儀、Mini PRO型電泳儀及轉膜儀、電泳槽、凝膠成像系統、超凈工作臺、倒置顯微鏡均購自美國Beckman公司;超聲心動圖檢測儀、流式細胞儀、臺式高速離心機、微量可調節儀器、生物組織石蠟包埋機等均購自美國Beckman公司。

1.2方 法

1.2.1動物分組及藥劑干預:各組大鼠在適應性喂養1周后,隨機將其分為五組,分別為Sham組、MIRI組、miR-30b mimics組、CY-09組、miR-30b mimics+CY-09組;其中Sham組大鼠僅僅做開胸進行動脈穿線處理;MIRI組大鼠進行開胸處理,并且行做灌裝動脈前降支的結扎以及再灌注造模處理;miR-30b mimics組大鼠首先進行miR-30b過表達腺病毒轉染,在其大鼠左心室的前壁采用六點法注射腺病毒載體(miR-30b mimics,1×109PFU);CY-09組大鼠亦首先進行NLRP3信號通路抑制劑CY-09注射,在其大鼠左心室的前壁采用六點法注射CY-09(miR-30b mimics,50μg/100g);miR-30b mimics+CY-09組大鼠分別在對應位置注射miR-30b mimics、CY-09;在其轉染后的3d后構建MIRI模型。

1.2.2MIRI模型制備及造模成功標準[9]: 大鼠腹腔注射1%戊巴比妥(40mg/kg),麻醉后采取仰臥位,頸部切口分離氣管,連接微型人工呼吸機,四肢下固定電極檢測心電圖。沿著大鼠胸骨正中位置將皮膚、胸骨切開,暴露心臟,定位左冠狀動脈的前降支,采用醫用縫合線進行結扎,45min后進行再灌注30min處理。后續在心電圖上觀察到出現室性期前收縮、室性心動過速、心室顫動等再灌注心率失常等表現,超聲心動圖以抬高的ST段下降以及T波恢復為再灌注成功的標準。

1.3檢測指標

序列結果用NCBI在線工具Blast在Gene Bank內與標準菌株比對，并用MEGA5.0軟件構建系統發育樹。

1.3.1超聲心動圖檢測心功能因子:各組大鼠在MIRI模型建立后進行超聲心動圖檢測,麻醉后固定仰臥在37℃的恒溫加熱板內,胸部處理后加少量耦合劑,設定檢測頻率為12.00MHz,探頭10s,檢測各組大鼠左心室舒張末壓(Left ventricular end diastoilc pressur,LVEDP)、左心室內壓峰值(Left ventricular sustolic pressure,LVSP)、壓力上升最大變化速率(+dp/dtmax)及壓力下降最大變化速率(-dp/dtmax),每個數值連續測量3個完整的心動周期后取平均值。

1.3.2ELISA檢測心肌損傷因子水平:處死大鼠,取腹部主動脈血,精確配置相關實驗用工作液、洗滌液,采用標準濃度樣本配制出具有濃度梯度的標準品,將其添加到對應的反應孔內,設置空白對照孔。采用PBS溶液洗滌3次后添加相應生物素CK-MB、LDH、cTnI抗體,在37℃下反應1.5h;加入酶結合物工作液進行二抗反應;將顯色底物加入,反應30mins后加入終止液;在450nm的波長下測定各個孔的吸光度,繪制標準曲線,最終計算CK-MB、LDH、cTnI的水平。

1.3.3HE染色評估大鼠心肌組織病理形態:心肌組織石蠟塊切片均在4μm厚,經二甲苯脫蠟、乙醇梯度濃度脫水后進行蘇木精染色5min后,經純水洗滌、1%鹽酸乙醇分化2s后進行返藍、伊紅染色2min;經過純水洗滌、梯度乙醇脫水、二甲苯透明、切片風干以及中性膠封片后,在光學顯微鏡下觀察心肌組織的病理形態。

1.3.4TUNEL檢測大鼠心肌組織凋亡情況:心肌組織石蠟塊切片均在4μm厚,經二甲苯脫蠟、乙醇梯度濃度脫水后放入包埋劑進行低溫成型處理,冷凍切片機連續切片。采用TUNEL凋亡檢測試劑盒檢測各組大鼠心肌組織細胞凋亡情況。

1.3.5QRT-PCR檢測大鼠心肌組織內miR-30b的mRNA表達:取心肌組織制備懸浮液,Trizol法提取總RNA,采用紫外分光光度計測定RNA濃度,參照反轉錄試劑盒將RNA合成cDNA,miR-30b正向引物:5-TGCTGGACCTTTCGGACTCT -3,反向引物:5-ATGGCTGGACCTGGATGCC -3,上述引物均由上海生物工程有限公司提供。嚴格按照qRT-PCR檢測試劑盒說明書的配置反應體系,將其置于ABI實時熒光定量PCR檢測儀檢測;qRT-PCR反應條件為95℃預變性5min,循環1次,95℃預變性15s,在60℃下退火60s,72℃延伸30s,循環40次,以U6為內參,采用2-ΔΔCt法計算miR-30b的相對表達量。

1.3.6Western-blot檢測NLRP3、ASC、Caspase-1蛋白表達取材后加入RIPA裂解液進行心肌組織懸浮液裂解處理,提取蛋白質,上樣蛋白緩沖溶液,進行SDS-PAGE電泳分離蛋白,將檢測蛋白轉移到PVDF膜上,采用5%的脫脂牛奶封閉2.5h,TBST清洗3次;將PVDF膜與一抗在5℃下孵育過夜,采用TBST清洗;PVDF膜與熒光二抗孵育1.5h,經TBST清洗后采用紅外成像系統進行掃描,采用Image軟件進行灰度分析;其中一抗稀釋比例NLRP3(1∶1500)、ASC(1∶1000)、Caspase-1(1∶1500)、GAPDH(1∶1500)。

2 結 果

2.1各組大鼠心肌組織內miR-30b的mRNA表達分析:結果顯示,與Sham組相比,MIRI模型建立可以下調大鼠心肌組織內miR-30b的mRNA表達(P<0.05);miR-30b的過表達質粒轉染可以明顯上調大鼠心肌組織內miR-30b的mRNA表達(P<0.05);為下文的研究提供基礎,結果詳見圖1。

2.2各組大鼠心功能參數比較:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調心功能參數LVEDP數值,下調LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax數值(P<0.05);miR-30b過表達質粒轉染及NLRP3信號通路被阻斷均可以下調LVEDP數值,上調LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax數值(P<0.05);二者聯合體現出最低LVEDP數值,最高LVSP、+dp/dtmax、-dp/dtmax數值(P<0.05);miR-30b過表達及NLRP3信號通路被阻斷均可以提升MIRI大鼠心臟功能,結果詳見表1。

表1 超聲心動圖檢測各組大鼠心功能參數比較分析

2.3各組大鼠心肌損傷因子水平比較:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調心肌損傷因子(CK-MB、LDH、cTnI)水平(P<0.05);miR-30b過表達質粒轉染及NLRP3信號通路被阻斷均可以下調血清CK-MB、LDH、cTnI因子水平(P<0.05);二者聯合組大鼠血清內體現出最低CK-MB、LDH、cTnI因子水平(P<0.05);miR-30b過表達及NLRP3信號通路被阻斷均可以抑制MIRI大鼠心肌損傷,結果詳見表2。

表2 ELISA法檢測各組大鼠心肌損傷因子水平比較

2.4各組大鼠心肌組織病理形態分析:Sham組大鼠心肌形態較為正常;MIRI模型的建立可以導致心肌組織排列紊亂,出現心肌纖維斷裂、心肌細胞空泡化及炎性細胞浸潤的現象;miR-30b過表達質粒轉染及NLRP3信號通路被阻斷均可以改善MIRI大鼠心肌組織病理形態,二者聯合組大鼠心肌形態改善力度最大,心肌細胞空泡化及炎性細胞浸潤現象得到大幅度降低;miR-30b過表達及NLRP3信號通路被阻斷均可以改善MIRI大鼠心肌組織損傷狀態,結果詳見圖2。

圖2 HE染色分析各組大鼠心肌組織病理形態分析(×100)

2.5各組大鼠心肌細胞凋亡程度比較:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調大鼠心肌組織凋亡程度(P<0.05);miR-30b過表達質粒轉染及NLRP3信號通路被阻斷均可以下調大鼠心肌組織凋亡能力(P<0.05);二者聯合可以進一步降低大鼠心肌組織凋亡程度(P<0.05);miR-30b過表達及NLRP3信號通路被阻斷均可以抑制MIRI大鼠心肌組織凋亡程度,結果詳見圖3。

圖3 TUNEL法檢測各組大鼠心肌組織細胞凋亡能力分析(×50)

2.6miR-30b對NLRP3炎癥小體信號通路活性的影響:與Sham組相比,MIRI模型的建立可以上調大鼠心肌組織內NLPR3炎癥小體信號通路關鍵蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(P<0.05);miR-30b過表達質粒轉染及NLRP3信號通路被阻斷均可以下調大鼠心肌組織內NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(P<0.05);二者聯合可以進一步降低大鼠心肌組織內NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(P<0.05);miR-30b可以靶向抑制MIRI大鼠心肌組織內NLRP3炎癥小體信號通路活性,結果詳見圖4、表3。

表3 Western-blot檢測各組大鼠心肌組織內NLRP3炎癥小體信號通路活性

圖4 Western-blot檢測各組大鼠心肌組織內NLRP3信號通路關鍵蛋白活性表達

3 討 論

心血管疾病目前已經成為嚴重危害人類健康的關鍵因素。MIRI病理現象可以導致機體心肌代謝紊亂及結構的重塑,加重心臟功能的障礙及結構的紊亂性,使得心血管疾病的臨床治療遇到重重阻礙[5];目前大量的科研人員致力于探索MIRI發生發展的分子機制,已經取得了實質性進展,炎癥級聯反應、細胞凋亡、鈣離子紊亂等均在MIRI發生發展進程中發揮了重要的作用。研究指出,miRNAs在心血管疾病中發揮了重要價值,miR-30家族被證實在機體炎癥級聯反應及細胞凋亡中扮演了重要角色,同時與多種缺血性疾病的進程密切相關,研究發現miR-30a在心肌梗死大鼠中的表達明顯降低,同時隨著其表達水平的降低,機體心肌纖維化、心功能衰退現象逐漸明顯[6-7]。miR-30b作為miR-30家族中另外一個重要成員,被證實了炎癥類疾病、缺血缺氧性腦部疾病中均發揮重要作用,但是其在MIRI進程中的作用機制值得進一步研究[8]。

本研究采用結扎左冠狀動脈前降支再恢復血流的經典方式構建了MIRI大鼠心肌損傷模型,進一步確定了miR-30b表達對MIRI大鼠心肌損傷的影響。在腺病毒過表達轉染中我們發現MIRI模型的建立可以明顯降低miR-30b的表達,證實了miR-30b在心肌缺血再灌注損傷后表達下調,通過轉染miR-30b過表達腺病毒發現miR-30b在心肌組織內的表達再次提升,為后續研究其對缺血再灌注損傷的心肌組織的保護作用提供基礎。

研究表明,心臟功能參數LVDEP、LVSP、±dp/dtmax等指標可以較好的反應機體的心臟功能,其中LVDEP可以充分反應機體左心室的負荷情況,間接反映左心室的舒張功能;LCSP則主要反映心肌組織的收縮能力,±dp/dtmax可以對心臟室壁張力的變化速度進行反應,可以用來評估心肌組織收縮期、舒張期的收縮能力大小[9]。在本研究中,結果顯示,MIRI模型的建立可以明顯上調LVDEP指標,下調LVSP、±dp/dtmax等指標,miR-30b的過表達可以逆轉上述現象,再次降低LVDEP指標,上調LVSP、±dp/dtmax等指標。進一步對各組大鼠的心肌損傷標志物進行了分析,研究顯示cTnI、CK-MB、LDH等均屬于心肌細胞特異性損傷的分子標志物,外周血中cTnI、CK-MB、LDH升高主要來源之一為心肌細胞的損傷。在本次的研究中我們得出,miR-30b的過表達可以明顯逆轉MIRI組大鼠外周血中cTnI、CK-MB、LDH水平提升的趨勢,再次下調MIRI組大鼠外周血中cTnI、CK-MB、LDH的水平[10]。病理學結果分析顯示,MIRI模型的建立可以導致心肌組織排列紊亂,出現心肌纖維斷裂、心肌細胞空泡化及炎性細胞浸潤現象,心肌組織凋亡程度明顯提升,而miR-30b過表達質粒轉染可以改善MIRI大鼠心肌組織病理形態,降低心肌組織的凋亡程度。綜上可以看出,miR-30b可以改善缺血再灌注損傷所引起的心臟功能低下的表現,對缺血再灌注損傷的心肌組織具有保護作用。

NLRP3炎癥小體在機體諸多炎癥反應中發揮重要作用,屬于炎癥類型疾病中最為廣泛涉及的炎癥小體類型,其關鍵的蛋白體系主要有感受器蛋白NLRP3、凋亡相關斑點樣蛋白(Apoptosis-related speck protein,ASC)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-1(Cysteinyl aspartate specific proteinase,Caspase-1)等[11]。數據顯示,NLRP3炎癥小體復合物的激活與缺血再灌注損傷密切相關,心肌缺血再灌注過程中大量的白細胞會向心肌組織募集,進而參與到炎癥反應并且釋放出炎癥因子,加劇心臟功能的紊亂性[12]。在心腦血管疾病中,NLRP3炎癥體被激活且表達水平提升,進而介導血管內皮細胞功能障礙,加速病理進展。本研究顯示,當NLRP3信號通路被抑制后,MIRI大鼠的心肌損傷得到一定改善,大鼠心臟功能LVSP、±dp/dtmax指標得到明顯上調,心肌損傷因子cTnI、CK-MB、LDH水平降低,同時心肌組織排列紊亂,出現心肌纖維斷裂、心肌細胞空泡化及炎性細胞浸潤現象亦得到較大程度的緩解,可見,NLRP3炎癥小體信號通路活性在MIRI建立后被激活,且參與到MIRI病理進展中。

研究指出,miRNAs對心血管疾病的調控機制與下游的靶向基因密切相關,NLRP3炎癥小體在諸多炎癥性疾病中受到miRNAs分子的靶向調控[13]。為了證實在miR-30b與NLRP3在改善MIRI大鼠缺血再灌注心肌損傷中的作用機制,我們將二者聯合應用到MIRI大鼠中,結果顯示,miR-30b的過表達可以明顯抑制NLRP3炎癥小體信號通路關鍵蛋白NLRP3、ASC、Caspase-1的表達,其與信號通路抑制劑聯合應用可以進一步降低NLRP3、ASC、Caspase-1的表達;且miR-30b、NLRP3信號通路抑制劑聯合應用可以進一步提升MIRI大鼠的心臟功能,改善心肌組織細胞的病理損傷。綜上可以看出,miR-30b通過靶向抑制MLPR3炎癥小體的激活改善缺血再灌注損傷所引起的心臟功能低下、心肌細胞損傷加劇的表現,對缺血再灌注損傷的心肌組織起到保護作用,值得臨床進一步研究。