CXCR4 MFAP2 KLF4在分化型甲狀腺癌中的表達及對預后的預測價值研究

顧占國, 李 軍, 梁金屏, 石福民

(河北省唐山市人民醫院頭頸外科, 河北 唐山 063000)

甲狀腺癌為內分泌惡性腫瘤中常見的一種,約占全身惡性腫瘤的1.0%～5.0%,甲狀腺癌可按組織學分類為未分化型以及分化型,其中大約90%為分化型甲狀腺癌(differentiated thyroid cancer,DTC),大部分DTC患者經規范化治療后能獲得良好預后,5年生存率可達90%,但仍有部分病例預后不良,故早期評估DTC預后有一定臨床指導意義[1]。近些年生物學分子標志物在DTC發生、疾病進展及預后評估中受到廣泛關注,趨化因子4受體(Chemokine 4 receptor,CXCR4)在細胞分化、增殖、侵襲、浸潤及腫瘤生長等過程中發揮重要作用,CXCR4異常表達與分化型甲狀腺癌的發生和進展有關[2]。微纖維相關蛋白2(microfibril associated protein 2,MFAP2)是一種在組織穩態、微纖維組裝中發揮關鍵作用的細胞外基質糖蛋白,其水平異常升高可促使細胞增殖、侵襲及遷移,并阻止細胞凋亡,是胰腺癌潛在的生物標志物[3]。Krüppel樣因子4(Krüppel like factor 4,KLF4)是一種鋅指轉錄因子,在不同腫瘤中充當抑癌或促癌基因,已有研究表明KLF4在肝癌、宮頸癌、腎癌、卵巢癌等腫瘤中呈低表達,KLF4低表達能促進腫瘤增殖[4]。目前國內關于CXCR4、MFAP2、KLF4與DTC的系統報道較少,本研究擬研究CXCR4、MFAP2、KLF4在DTC中的表達及對預后的預測價值,希望為臨床診治DTC提供指導,報道如下。

1 資料與方法

1.1一般資料:本研究取得本院倫理委員會批準。選擇我院2019年7月至2020年7月收治的113例DTC患者,術中留取其癌組織及癌旁正常組織(距腫瘤切緣≥2cm),其中男28例、女85例;年齡為19～72歲,平均(54.29±6.11)歲;病理類型:乳頭狀癌82例、濾泡狀癌31例;瘤灶直徑:<2cm 51例,≥2cm 62例;TNM分期:Ⅰ+Ⅱ期40例、Ⅲ期73例;淋巴結轉移75例;腫瘤分化程度:中高分化44例、低分化69例。納入標準:①原發性腫瘤且為初次手術,經術后病理證實;②意識清楚且認知功能正常;③病歷資料完整;④簽署知情同意。排除標準:①有其他部位惡性腫瘤;②有感染性或傳染性疾病;③良惡性結節并存;④入組前接受手術或放化療等;⑤合并終末期腎病、終末期肝病等影響生存期的疾病;⑥已出現遠端轉移;⑦有頸部手術史或嚴重凝血功能障礙;⑧妊娠、哺乳期女性;⑨生存時間預計小于3個月。

1.2方 法

1.2.1收集資料:包括癌灶直徑(<2cm/≥2cm)、年齡(<50歲/≥50歲)、性別(男/女)、病理類型(乳頭狀癌/濾泡狀癌)、淋巴結轉移(無/有)、腫瘤分化程度 (中高分化/低分化)、TNM分期(Ⅰ+Ⅱ期/Ⅲ期)等。

1.2.2采用蛋白免疫印跡法檢測DTC組織及癌旁正常組織中CXCR4、MFAP2、KLF4表達水平:術中留取癌組織及癌旁正常組織液氮下保存,放于-80℃冰箱中保存待測。取組織標本,RIPA裂解,提取總蛋白,BCA法測蛋白濃度,100℃下變性,SDS-PAGE電泳分離總蛋白,轉膜,脫脂牛奶封閉2h,TBST洗滌(5min/次,3次),將其放入對應的一抗(CXCR4、MFAP2、KLF4、GAPDH)以及一抗稀釋液(1∶500)混懸液中,4℃條件下孵育過夜,TBST洗滌(5min/次,3次),放入二抗以及二抗稀釋液(1∶2000)混懸液中,25℃條件下孵育120min,TBST洗滌(5min/次,3次),將超敏ECL發光液滴于膜上,行顯影、定影處理,以GAPDH為內參,Image J軟件分析各目標條帶灰度值。

1.2.3隨訪情況:DTC患者出院后,采用電話或者門診復查的方式隨訪3年,每半年隨訪1次,隨訪截止到2023年7月或死亡,統計DTC患者3年總生存情況。

2 結 果

2.1DTC組織及癌旁正常組織中CXCR4、MFAP2、KLF4表達情況:與癌旁正常組織比較,DTC組織CXCR4、MFAP2蛋白表達量顯著升高(P<0.05),KLF4蛋白表達量顯著降低(P<0.05)。見表1。

表1 DTC組織及癌旁正常組織中CXCR4 MFAP2 KLF4表達情況

2.2癌組織中CXCR4、MFAP2、KLF4表達水平與DTC臨床病理特征的關系:性別、年齡、病理類型、癌灶直徑不同者CXCR4、MFAP2、KLF4蛋白表達量差異無統計學意義(P>0.05),TNM分期Ⅲ期、發生淋巴結轉移、腫瘤低分化者CXCR4、MFAP2蛋白表達量顯著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未發生淋巴結轉移、腫瘤中高分化者(P<0.05),TNM分期Ⅲ期、發生淋巴結轉移、腫瘤低分化者KLF4蛋白表達量顯著低于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未發生淋巴結轉移、腫瘤中高分化者(P<0.05)。見表2。

表2 癌組織中CXCR4 MFAP2 KLF4表達水平與DTC臨床病理特征的關系

2.3CXCR4、MFAP2、KLF4對DTC預后的預測價值:113例DTC患者隨訪3年期間失訪8例,最終獲得隨訪者105例。死亡組患者CXCR4、MFAP2蛋白表達量顯著高于存活組(P<0.05),KLF4蛋白表達量顯著低于存活組(P<0.05)(表3)。繪制ROC曲線發現,CXCR4、MFAP2、KLF4單獨或聯合預測DTC預后的AUC(95%CI)分別為0.692(0.562～0.823)、0.729(0.590～0.869)、0.766(0.622～0.910)、0.832(0.690～0.975),聯合預測的效能顯著優于單項檢測(P<0.05)(表4、圖1)。

圖1 血清t-PA、CgA、LP-PLA2單獨或聯合預測PCI術后發生MACE的ROC曲線

表3 死亡組與存活組CXCR4 MFAP2 KLF4表達情況

表4 CXCR4 MFAP2 KLF4對DTC預后的預測價值

2.4Cox回歸模型單因素和多因素分析影響DTC預后的相關因素:Cox回歸分析顯示,淋巴結轉移、TNM分期Ⅲ期、腫瘤低分化、CXCR4表達升高、MFAP2表達升高、KLF4表達降低是DTC預后的危險因素(P<0.05)。見表5。

3 討 論

趨化因子是一類能夠激活并趨化白細胞的促炎性細胞因子,可參與惡性腫瘤疾病的發生發展,趨化因子的受體分別為CC受體、CXC受體、XC受體、CX3C受體。CXCR4屬于CXC受體,它的特異性配體為趨化因子基質細胞衍生因子1(stromal cell-derived factor,SDF-1)。CXCR4/SDF-1軸可以聚合癌細胞肌動蛋白絲,形成假偽足誘導癌細胞侵襲與轉移,同時還可促使腫瘤血管形成,影響腫瘤生長[5]。本研究結果顯示,DTC組織CXCR4蛋白表達量顯著高于癌旁正常組織,表明CXCR4在DTC中呈高表達,與Wilhelm A等[6]報道中CXCR4的變化趨勢基本相同。同時,TNM分期Ⅲ期、發生淋巴結轉移、腫瘤低分化者CXCR4蛋白表達量顯著高于TNM分期Ⅰ+Ⅱ期、未發生淋巴結轉移、腫瘤中高分化者,提示CXCR4可能參與了DTC進展過程。對其預后研究發現,死亡組患者CXCR4蛋白表達量顯著高于存活組,且CXCR4表達升高是DTC預后的危險因素,說明CXCR4在DTC預后評估方面有一定潛力。分析原因可能為CXCR4可能與其特異性配體結合,形成CXCR4/SDF-1軸,促使DTC生長、浸潤及轉移,致其進展和預后不良。

MFAP2也稱為微纖絲相關糖蛋白1,由183個氨基酸組成,它與細胞外基質內的微纖維有關,MFAP2缺陷將引起整合素-基質之間的相互作用減少。MFAP2可通過激活TGF-β/SMAD2/3通路誘導胃癌細胞上皮間質轉化[7]。MFAP2表達水平與超聲造影參數[達峰時間(time to peak,TTP)、峰值強度(peak intensity,PI)、平均通過時間(mean transit time,MTT)]有顯著關系,有助于早期評估甲狀腺癌預后[8]。本研究結果表明,分化型甲狀腺癌患者腫瘤組織中MFAP2呈高表達,其表達水平與淋巴結轉移、腫瘤分化程度、TNM分期及3年總生存率相關,結合Dong S Y等[9]的報道推測MFAP2可能通過促進甲狀腺癌細胞的增殖、集落形成、遷移和侵襲能力,降低細胞凋亡率,而促進DTC發生、發展及不良預后。

KLF4屬于Krüppel樣因子家族中的重要一員,分布于血管內皮、巨噬細胞等中,能夠參與細胞周期、細胞增殖、細胞侵襲和轉移等生物學進程,在多種腫瘤形成與發展中有重要作用。結直腸癌患者KLF4低表達與總生存率降低相關,KLF4可通過上調p21WAF1/Cip1以及下調細胞周期蛋白D1而抑制結直腸癌細胞增殖[10]。KLF4能參與胃腸道上皮的增殖、分化及腫瘤形成的調節,KLF4在胃癌中扮演抑癌基因角色。KLF4可通過抑制富含半胱氨酸的酸性分泌蛋白(Cysteine rich acidic secretory protein,SPARC)表達來抑制肺癌細胞侵襲。本研究結果顯示,DTC組織中KLF4蛋白表達量較癌旁正常組織低,且KLF4低表達與患者淋巴結轉移、腫瘤分化程度、TNM分期及3年總生存率均有關,提示KLF4參與DTC發生和發展,并推測KLF4在DTC病理過程中發揮抑癌作用,KLF4低表達可促進腫瘤細胞增殖,其機制可能與調節N-鈣粘蛋白、基質金屬蛋白酶2/9表達等有關[11]。

繪制ROC曲線發現,CXCR4、MFAP2、KLF4單獨或聯合預測DTC預后的AUC(95%CI)分別為0.692(0.562～0.823)、0.729(0.590～0.869)、0.766(0.622～0.910)、0.832(0.690～0.975),可見聯合預測的效能顯著優于單項檢測,提示CXCR4、MFAP2、KLF4聯合檢測有助于預測分化型甲狀腺癌預后。

綜上所述,分化型甲狀腺癌患者腫瘤組織中CXCR4、MFAP2呈高表達,KLF4呈低表達,其表達水平與淋巴結轉移、腫瘤分化程度、TNM分期及3年總生存率相關,三者聯合檢測有助于預測分化型甲狀腺癌預后。本研究也有一定缺陷,如隨訪時間比較短、樣本數較少等,未來待完善。