基于網絡藥理學和分子對接探討小承氣湯治療慢性腎臟病的有效成分和作用機制

宋志欣，孫尚萍，廖書恒，甘元偉

（1.貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550000；2.遵義市中醫院腎病風濕科，貴州 遵義 563000）

近年來慢性腎臟?。╟hronic kidney disease，CKD）患病率呈明顯上升趨勢，影響著全球8%～10%的人口，美國每年產生約480 億美元的醫療費用[1]。我國18 歲以上人群CKD 患病率約為10.8%，在20年間,全球CKD 相關的死亡數量上升82.3%[2]。CKD的治療強調積極治療原發病，避免和糾正腎功能惡化的危險因素，防止發展至終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）[3]。目前臨床主要治療方法是腎臟替代治療，當患者處于圍透析期時，由于疾病負擔重、并發癥多、影響疾病進展的因素復雜，導致死亡風險增高[4]。腎移植是目前最佳的腎臟替代療法，但因腎源的稀缺和昂貴的醫療費用，以及腎移植后相關的排斥反應、免疫抑制劑治療、感染等，嚴重影響患者生活質量[5]。故探索新的治療方法來延緩CKD的進展，提高患者生存期和生存質量具有重要意義。小承氣湯是古代經典名方，配伍精煉主治明確，常被作為主方進行加減運用，可治療急性呼吸窘迫綜合征[6]、改善脾虛小鼠的胃腸動力不足[7]。研究表明[8，9]，小承氣湯加減灌腸聯合血液透析可改善腎功能、糾正電解質紊亂、降低炎癥因子水平。另有研究根據CKD 濕毒、濁毒的特點，認為運用小承氣加減可通腑利濕泄濁[9]。且網絡藥理學探究小承氣湯治療粘連性腸梗阻的機制中發現[10]，其可能與抗癌、炎癥性腸病等通路有關。為了揭示小承湯治療CKD 的潛在作用機制，本研究運用網絡藥理學以挖掘小承氣湯治療CKD 的理論依據，現報道如下。

1 材料與方法

1.1 小承氣湯藥物組分挖掘、篩選、潛在成分靶點預測 Herb（http://herb.ac.cn）數據庫提取大黃、枳實、厚樸的成分，化合物符合Lipinski、Ghose、Veber、Egan、Muegge 中2 種及以上的類藥性原則，則具有較好的成藥潛力[11]；腸胃吸收（gatrointestinal absortion，GI absortion）結果為“High”，則該化合物具有較好的口服生物利用度。將有效活性成分Smile式導入SwissTargetPrediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）數據庫，活性成分取“probability”值大于0 作為潛在作用靶點。

1.2 “中藥復方網絡圖”的構建 Cytoscape3.9.2 軟件構建網絡圖，并依據中藥復方網絡中的degree 值，選出核心成分。

1.3 CKD 疾病靶點的篩選及靶點圖的制作 以“Chronic kidney diseases”為關鍵詞在DrugBank（https://www.disgenet.org）搜索CKD 的疾病潛在靶點。將疾病靶點與成分靶點取交集，運用Venny2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es）繪制韋恩圖。

1.4 PPI 網絡的構建 交集靶點導入String（https://cn.string-db.org/），進行蛋白互作（protein protein interaction，PPI）分析，將物種類型選擇為“Homo sapiens”，最小互相作用閾值設定為“highest co-nfidence＞0.4”。結果文件導入Cytoscape3.9.2 中進行可視化分析，CytoNCA 插件篩選出核心靶點。

1.5 KEGG 通路富集及GO 功能分析 交集靶點導入DAVID 數據庫（https://david.ncifcrf.gov），選擇物種為“Homo sapiens”，設置P＜0.01，GO 功能分析選取細胞組分（cellular Component，CC）、生物過程（biological processes，BP）、分子功能（molecular function，MF），分別選前10 個條目，微生信平臺（http://www.bioinformatics.com.cn）繪制小承氣湯治療CKD 所參與的主要信號通路和CC、BP、MF 氣泡圖。

1.6 分子對接驗證 根據以上研究結果，CytoNCA 插件選出排名前3 的核心基因作為受體與排名前3 的核心成分作為配體進行分子對接，分析受體與配體的結合能和相互作用模式。Pubchem（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載配體的2D 結構，Chem3D 軟件最小化，使配體處于最低勢能；在Uniport（https://www.uniprot.org/）獲取受體3D 結構，使用Pymol 軟件去水、去殘余配體。AutoDockTools1.5.6把蛋白質去水、加氫選為受體，小分子加氫設為配體，檢測扭轉中心及扭轉鍵，文件設置為對接格式，AutoDock Vina 軟件進行分子對接。Discovery Studio 2021 Clien 軟件進行可視化處理。

2 結果

2.1 藥物活性成分大黃57 種、枳實48 種、厚樸62 種活性成分，對應靶點共704 個，根據中藥調控網絡中有效成分的count 值得到排名前3 的活性成分見表1。

表1 排名前3 核心成分

2.2 中藥復方網絡圖 將篩選后3 味中藥活性成分和對應的靶點進行映射，構建藥物、活性成分、靶點作用關系，將結果文件導入Cytoscape3.9.2 軟件建立中藥復方網絡調控圖，CytoNCA 插件計算每個節點degree 值，該網絡共有711 個節點，3180 條網絡，見圖1。

圖1 中藥復方網絡圖

2.3 “藥物-疾病”靶點圖 CKD 靶點基因1074 個，交集靶點共169 個，見圖2。

圖2 “疾病-藥物”靶點圖

2.4 PPI 網絡的構建 交集靶點導入String 數據庫后得到PPI 網絡文件。該網絡節點數169 個，邊數2331，平均節點度27.6，平均局部聚類系數0.565，P＜0.05。另將String 數據庫中得到的文件導入Cytoscape3.9.2 中進行可視化分析，見圖3。

圖3 PPI 蛋白網絡可視化

2.5 KEGG 通路富集及GO 功能分析 KEGG 分析顯示，脂質與動脈粥樣硬化、PI3-Akt 信號通路、NF-κB 信號通路、腫瘤壞死因子信號通路、IL-7、胰島素抵抗、Toll 樣受體信號通路、趨化因子信號通路、腎素-血管緊張素系統、甲狀旁腺激素的合成及分泌等可能參與了小承氣湯治療CKD 的過程，見圖4；GO 分析顯示，BP 有RNA 聚合酶Ⅱ啟動子轉錄的正調控、基因表達的正調控、對細胞凋亡的負面監管、細胞增殖的正調控、信號轉導、蛋白質磷酸化炎癥反應等；MF 有蛋白質結合、ATP 結合、酶結合、蛋白質同二聚體活性等；CC 有質膜、胞漿、細胞外區等，見圖5。

圖4 KEGG 通路富集分析

圖5 GO 功能分析

2.6 分子對接 對排名前3 的核心基因和核心成分進行分子對接，結合能＜-5 kcal/mol 表示對接成功[12]，結合能越低，受體與配體的親和力越高，構象越穩定[13]。VEGFA 與magnolignan a 結合能最低，結合高度穩定。受體與配體結合能見表2，分子對接可視化圖見圖6。

圖6 VEGFA 與Magnolignan-a 對接圖

表2 受體與配體結合能

3 討論

根據CKD 的臨床表現，祖國醫學將其歸屬于“關格”“癃閉”“水腫”“溺毒”“腎勞”等范疇。現代中醫學將其統稱為腎衰病，指因腎臟疾病日久、病情遷延所致腎氣漸衰，氣化失司，開闔失常，濕濁、溺毒不得下泄，以少尿甚或無尿，或以精神萎靡，面色無華，惡心納差，肢體浮腫為主要癥見的一類病證[14]。清代李用粹《證治匯補》提出關格的病機為“濁邪壅塞三焦，正氣不得升降……陰陽閉絕”[15]。CKD 本虛多考慮為肺、脾、腎三臟的虛損，標實是指濕濁、水濕、氣滯、瘀血等病理產物[16]。王自敏教授將CKD 中醫病機概括為“虛、濁、瘀、毒”[17]。脾腎虧虛，脾失輸布，水濕運化失權，水濕內停，蘊結生熱，以致濕熱內蘊；肺失宣降，通調水道失職而加重濕邪的停滯，濕邪久停成濁而為濁毒之患，濁毒為穢濁之性，困阻中焦，氣機痞塞，濁陰不降，濁毒上泛而見惡心、嘔吐、口粘，甚至口臭或有尿味[18]。

國醫大師鄒燕勤認為在腎衰病長期病變過程中，脾腎虧虛不斷加重濕熱、濁毒、瘀血等病理產物的產生，三者作為致病因素又使脾腎虛損愈重，相互影響，形成惡性循環；且脾腎虛損為本，濕熱、濁毒、瘀血既是病理產物，又是致病因素，病久濕濁、瘀血相互膠結、纏綿難解，形成本虛標實、虛實互見的錯綜復雜的病理機制[19]。腎衰病的病因病機雖復雜，總屬濕濁毒內蘊、脾腎虧虛。段光堂教授認為本虛為脾腎虧虛，標實為濕濁、濁毒、瘀血等濁邪阻滯，在治療上通腑泄濁，化瘀通絡等祛邪法貫穿始終[20]。郭恩綿教授治療上以泄濁解毒為先，注重通腑泄濁解毒，扶正次之，強調不可過度滋補，以防留邪之弊[21]。張寧教授主張在補益脾腎的同時，應注重活血通絡，祛濕泄濁法的運用[22]。根據CKD 濕濁毒的特點，臨床提出運用小承氣加減降濁排毒。

本研究結果顯示，小承氣湯治療CKD 的主要成分可能為厚樸中的木蘭木脂素a、木蘭水楊素和大黃中的3，4，5 三羥基苯甲酸。厚樸可以通過阻止PI3K/Akt 信號通路，抑制炎性因子的表達，從而實現抗炎的作用[23]，并通過減輕炎癥反應、氧化應激以及抑制凋亡改善腎缺血再灌注[24]。內毒素刺激的人腎小球系膜細胞模型中，厚樸通過抑制炎性因子水平，有效保護腎損傷[25]。TGF-β 產生炎癥反應并誘導生成腎纖維化，大黃通過抑制TGF-β 表達，降低尿素和肌酐[26]。在糖尿病腎病大鼠模型，p38 MAPK 信號通路被大黃抑制，纖維連接蛋白表達下調，并阻止了腎小球的纖維化[27]。此外，大黃通過下調脂多糖誘導的Toll 樣受體4 活化的表達，使TNF-α 與IL-6調整合成，保護腎臟細胞，減少腎臟纖維化[28]?？傊?，大黃和厚樸通過不同的通路保護腎臟，但目前對于相關成分的研究仍欠缺，故經典名方小承氣湯治療CKD 的作用機制需進一步探索。

GO 分析顯示，基因表達的正調控、對細胞凋亡的負面監管、細胞增殖的正調控、信號轉導、炎癥、蛋白質磷酸化等生物過程參與疾病靶點和信號通路的作用過程。在腎缺血再灌注中，JAK2/STAT3 信號通路通過上調細胞間黏附分子和單核細胞趨化蛋白的表達，促進內皮與白細胞相互作用，導致腎臟中性粒細胞和巨噬細胞的積累[29，30]。腎炎模型大鼠腎組織中STAT3mRNA 表達明顯增強，下調腎炎大鼠STAT3 表達，下游產物的表達因此降低，繼而系膜增殖程度下降，平滑肌肌動蛋白表達減少[31]。纖維化啟動的重要因素是炎癥因子，持續的炎癥刺激，激發炎癥細胞浸潤和腎小管上皮細胞活化[32，33]。蛋白質磷酸化通過其下游目的蛋白特定的氨基酸位點，調控細胞分化、生長、凋亡和增殖等一系列復雜的生物過程[34]。

KEGG 通路富集分析顯示，小承氣湯治療CKD是多通路參與的過程?；|金屬蛋白酶、血管生成素2 是動脈粥樣硬化相關生物標志物，基質金屬蛋白酶可干預腎纖維化從單核細胞浸潤到細胞增殖和瘢痕形成的所有階段?；|金屬蛋白酶和相關家族蛋白酶參與的過程均會導致腎功能的進行性下降[35]。CKD 患者血液循環中的血管生成素2 水平與C 反應蛋白水平相關，血管生成素2 水平升高是CKD 患者遠期死亡率的預測指標[36]。而CKD 患者的尿毒癥環境、氧化應激和促炎因子的失衡等共同作用促進了動脈粥樣硬化[37]。PI3K-AKT 通路在腎組織調節自噬中發揮著不可或缺的作用[38]。PI3KAkt 通路是一種重要的細胞內信號通路，與細胞增殖、遷移、生存、足細胞自噬調節等廣泛的生理事件相關。Li D 等[39]研究表明，阻斷PI3K-Akt 通路有助于恢復足細胞粘附能力損傷和自噬活性。NF-κB 信號通路參與腎組織的炎癥反應[40]。TNF-α、TGF-β1、IL 等炎性細胞因子和炎癥介質，通過銜接蛋白最終激活IκB 激酶復合物，使IκB 磷酸化及降解，然后激活NF-κB，在核內調控相應靶基因的轉錄或表達，活化的NF-κB 又可誘導多種炎癥介質，如IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α、單核細胞趨化因子-1等，誘導炎癥反應導致腎臟損害及腎纖維化[41，42]。

PPI 結果顯示，小承氣湯治療CKD 的關鍵靶點有AKT1、TNF、V-EGFA 等。AKT1 是蘇氨酸蛋白激酶，為細胞增殖、遷移、凋亡、血管生成和代謝的關鍵調控因子[43]。有研究證明[44]，在未行對側腎切除術的小鼠模型中，AKT1 基因缺失導致在急性腎損傷進展過程中腎間質纖維化和腎小管脫分化的衰減。TNF 途徑刺激細胞損傷和凋亡，來募集炎癥細胞，引起腎小管間質變化[45]。VEGFA 通過影響內皮細胞的凋亡、增殖和分化，在維持腎小球濾過屏障中發揮關鍵作用。VEGFA 還通過增加血管通透性、白細胞黏附、細胞間黏附分子1 和血管細胞黏附分子1 的表達參與炎癥級聯反應在糖尿病腎病中[46]。

分子對接可預測蛋白質與小分子結合位點，并評估結合親和力，是藥物發現中常用的方法。本研究中分子對接結果顯示，VEGFA 和magnolignan a結合能最低。受體和配體相互作用的關鍵殘基顯示，受體GLN 上L 鏈的38 號位和THR 上L 鏈的85 號位通過常規氫鍵相互作用；受體PRO 上的H 鏈的41 號位和VAL 上的40 號位通過Pi-烷基相互作用；受體GLN 上H 鏈的39 號位通過碳氫鍵相互作用，故受體和配體因此而結合。

綜上所述，小承氣湯治療CKD 的作用機制具有多成分、多通路、多靶點的特點。本研究初步探索了小承氣湯治療CKD 的理論依據，為今后研究小承氣湯治療CKD 的臨床觀察和動物物研究中提供了證據和思路。此研究的源自于各大數據庫，存在一定的空間和時間限制，故只能提供理論基礎，后期將進一步通過實驗證實。