真核翻譯起始因子4G1在老年子宮內膜樣癌患者中表達及臨床意義

彭秀娟 胡玉紅 張丹鳳

(佳木斯大學附屬第一醫院婦產科,黑龍江 佳木斯 154000)

子宮內膜癌(EC)又稱子宮體癌,是女性生殖系統三大惡性腫瘤之一〔1〕。國際癌癥機構最新數據顯示,2020年,全球EC新發病例417 367例,新增死亡97 370例,且發病率及死亡率逐年上升〔2〕。子宮內膜樣癌是EC最常見的病理亞型,約占EC總病例的80%,組織學上多呈絨毛腺管狀或腺性內膜樣結構,并伴有復雜而密集的分支〔3〕。EC起病隱匿,多數早期患者可通過手術及放化療獲益,預后較好,但晚期及復發性患者的疾病管理與治療方案選擇有限,5年生存率僅為15%～17%〔4〕。真核翻譯起始因子(eIF)4G1是翻譯起始復合物eIF4F的亞基之一,該因子于1981年由Tahara等〔5,6〕從核糖體鹽液的蛋白復合物(eIF4F)中分離得出,并曾被稱為P220、eIF4G和eIF4γ。eIF4G1是一種關鍵的支架蛋白,在蛋白質翻譯起始階段,可作為起始因子及蛋白結合橋梁促進核糖體與mRNA的結合〔7〕。研究表明,eIF4G1可在多種翻譯機制和細胞進程中扮演重要角色,與細胞生長、增殖、惡性轉化及侵襲密切相關,是腫瘤診斷及治療的潛在靶標〔8,9〕。既往研究證實,eIF4G1過表達可參與多種腫瘤的發生發展,如肺癌、前列腺癌、乳腺癌和鼻咽癌等,并與患者的不良預后緊密相關〔10,11〕。然而,eIF4G1在子宮內膜樣癌中的表達、臨床意義及作用機制尚未見相關報道。因此,本研究旨在分析eIF4G1在子宮內膜樣癌與癌旁組織中的表達,同時進一步探討其與患者臨床病理特征之間的關系,以闡明eIF4G1在子宮內膜樣癌疾病診斷及病情評估中生物標志物的潛在臨床價值。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集佳木斯大學附屬第一醫院婦科2019年1月至2023年8月診治的62例子宮內膜樣癌組織蠟塊標本。平均年齡(57.08±7.91)歲。根據國際婦產科聯盟(FIGO,2009年)分期:Ⅰ期35例,Ⅱ～Ⅲ期27例。收集同期行診刮術或子宮切除術的26例正常子宮內膜組織、30例非典型增生子宮內膜組織作為對照組。正常子宮內膜組:年齡44～72歲,平均(54.00±6.79)歲;非典型增生子宮內膜組:年齡41～73歲,平均(55.47±8.29)歲。3組年齡差異無統計學意義(F=1.53,P=0.22)。另選取同期-80 ℃凍存的20例新鮮子宮內膜樣癌組織及癌旁3 cm正常組織進行實時熒光定量聚合酶鏈反應(Real-time PCR)和Western印跡檢測,患者年齡43～76歲,平均(58.35±8.22)歲。納入標準:①符合WHO子宮體腫瘤分類(2020年)中子宮內膜樣癌的診斷標準,且經組織病理學證實;②臨床資料完整;③術前未接受過放化療或靶向治療等相關治療。排除標準:①合并凝血功能障礙;②合并重要臟器功能不全;③合并免疫系統疾病或嚴重感染。本研究經醫院倫理委員會批準,患者均簽署知情同意書。

1.2實驗試劑 免疫組化PV-6000、乙二胺四乙酸(EDTA)修復液和二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒購自中杉金橋生物有限公司(中國),兔抗人eIF4G1多抗、β-actin抗體購自Proteintech公司(美國),放射免疫沉淀(RIPA)總蛋白裂解液購自代軒生物科技有限公司(中國),二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購于碧云天生物技術有限公司(中國),PCR引物由捷瑞生物工程有限公司(中國)合成,Trizol總RNA抽提試劑盒購自Invitrogen公司(美國)。

1.3免疫組化實驗 采用免疫組化PV-6000法檢測組織中eIF4G1蛋白表達。組織標本均經10%甲醛溶液固定,石蠟包埋,4 μm厚度連續切片。切片常規脫蠟、水化,加入3%H2O2阻斷內源性過氧化物酶,再行高壓熱修復抗原,持續4.0 min。滴加一抗,eIF4G1稀釋至1∶200,4 ℃孵育過夜;磷酸緩沖液(PBS)沖洗,加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠/兔IgG二抗,在室溫下孵育50 min;DAB顯色,蘇木素復染,梯度酒精進行脫水后封片。以PBS代替一抗作為陰性對照,光鏡下觀察組織染色情況。

1.4Western印跡檢測eIF4G1蛋白表達水平 配制RIPA蛋白裂解液,提取組織總蛋白,BCA定量試劑盒檢測蛋白濃度。將蛋白進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)后,膠內蛋白轉移至0.2 μm聚偏氟乙烯(PVDF)膜上。5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,一抗eIF4G1(1∶200)、β-actin 4 ℃孵育過夜,Tris鹽酸緩沖液 (TBST)洗滌3次后,室溫孵育二抗1 h,滴加電化學發光(ECL)顯色。β-actin作為內參,用凝膠成像系統分析目的蛋白的相對表達水平。

1.5Real-time PCR實驗 采用Real-time PCR對eIF4G1 mRNA進行定量檢測。使用Trizol試劑提取30對子宮內膜樣癌與癌旁內膜組織總RNA,紫外分光光度計檢測其濃度。用逆轉錄試劑盒生成cDNA,按Real-time PCR試劑說明書進行PCR,β-actin基因作為內參。PCR體系:上、下游引物各0.4 μl,DNA模板2.0 μl,SYBR Premix Ex Taq Ⅱ 10 μl,添加焦碳酸二乙酯(DEPC)水至總體積20 μl。反應條件:95 ℃預變性60 s;95 ℃ 15 s,60 ℃退火延伸34 s,循環40次。Primer Premier5軟件設計eIF4G1引物,eIF4G1上游序列:5′-TATTCCAGCCAACTTGTCTC-3′,下游:5′-CAACAGCCTCCTTCTTATTTAG-3′;β-actin上游:5′-AAGGTGACAGCAGTCGGTT-3′,下游:5′-TGTGTGGACTTGGGAGAGG-3′。比較eIF4G1 mRNA表達差異,相對表達倍數用2-ΔΔCt值表示。

1.6染色結果判定 兩位主治及以上職稱的病理科醫師以雙盲方式進行切片判讀,eIF4G1陽性表達定位為細胞質,表現為棕黃色或黃褐色顆粒。每張切片將隨機選擇5個高倍視野(×400),計數每個視野中的200個細胞,細胞的染色強度和密度將作為評分標準。①細胞染色強度評分:0分(無染色或染色不清)、1分(淺黃色)、2分(棕黃色)、3分(深褐色)。②陽性細胞百分比評分:無陽性細胞為0分,陽性細胞數25%≤為1分,26%～50%為2分,51%～75%為3分,>75%為4分。將陽性細胞染色強度評分與表達百分比相乘:0～3分為陰性(-),>3分為陽性(+)。

1.7統計學分析 采用SPSS26.0軟件進行χ2檢驗、t檢驗,使用Graphpad Prism7.0繪圖。

2 結 果

2.13組子宮內膜組織中eIF4G1蛋白表達 eIF4G1陽性表達定位于細胞質,呈棕黃色或黃褐色顆粒。在正常子宮內膜組、非典型增生子宮內膜組及子宮內膜樣癌組eIF4G1陽性表達率分別為19.2% (5/26)、53.3% (16/30)和80.6%(50/62),組間差異具有統計學意義 (χ2=29.614,P<0.05)。正常子宮內膜組陽性率明顯低于非典型增生子宮內膜組(χ2=6.912,P<0.05),非典型增生子宮內膜組明顯低于子宮內膜樣癌組(χ2=7.439,P<0.05),正常子宮內膜組明顯低于子宮內膜樣癌組(χ2=29.479,P<0.05)。見圖1。

圖1 eIF4G1在各組子宮內膜組織中表達(PV-6000法,×400)

2.2子宮內膜樣癌組織中eIF4G1蛋白表達與臨床病理特征的關系 eIF4G1與患者年齡、淋巴結轉移及絕經狀態無關(P>0.05),與組織分化程度、FIGO分期、肌層浸潤深度及脈管癌栓相關,差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 子宮內膜樣癌患者eIF4G1陽性表達與臨床病理資料的相關性〔n(%)〕

2.3子宮內膜組織中eIF4G1蛋白與mRNA表達差異 Real-time PCR檢測結果顯示,癌組織中eIF4G1 mRNA表達水平(1.84±0.21)明顯高于癌旁組織(0.99±0.13;t=12.755,P<0.001)。同時,Western印跡分析eIF4G1在子宮內膜樣癌與癌旁組織中的蛋白表達水平提示,在癌組織中,eIF4G1蛋白表達水平(0.44±0.04)明高于對應的癌旁內膜組織(0.26±0.06;t=7.488,P<0.001)。見圖2。

圖2 Western印跡檢測eIF4G1蛋白表達

3 討 論

EC是女性癌癥死亡的主要原因之一。不孕癥、肥胖、癌癥家族史、糖尿病、年齡和雌激素水平升高均被確定為該疾病的重要危險因素〔12〕。近年來,隨著EC診斷方式和治療策略的不斷改進,規范的手術、化療或放療己成為在早期患者中常用且有效的治療手段,普遍預后良好,然而,對于晚期及復發型病例,該病的治療選擇仍然有限,需要尋找更有效的臨床診治策略〔13〕。

蛋白質的合成包含4個主要環節:起始、延伸、終止及核糖體回收,其中,起始階段是其翻譯調控的主要靶點及限速步驟〔14〕。eIF4G1是eIF4G家族的主要成員,在真核生物mRNA翻譯起始過程中,可作為啟動因子與蛋白對接位點,與eIF4A、eIF4E組裝形成翻譯起始復合物eIF4F,進而調控核糖體亞基與mRNA結合,啟動翻譯機制〔15,16〕。

腫瘤的發生和發展是一個復雜的過程,涉及多種因素的協同作用。選擇性mRNA翻譯和信號傳導通路的紊亂被廣泛認為是導致細胞分化異常和惡性轉變的主要原因〔17,18〕。研究表明,翻譯起始因子的功能失調可以促進蛋白質翻譯的重編程,進而對細胞的生存、增殖、轉移和新生血管形成產生影響〔19,20〕。Silvera等〔21〕在乳腺癌中發現,eIF4G1可對蛋白質合成機制進行重編程,以增加具有內部核糖體進入位點(IRES)的mRNA的翻譯,從而促進乳腺癌瘤栓形成和腫瘤細胞存活(如p120 mRNA),沉默eIF4G1可對癌栓形成明顯抑制。Li等〔8〕研究也證實,eIF4G1過表達與乳腺癌的預后不良密切相關,是其潛在的預后生物標志物。eIF4G1在非小細胞肺癌(NSCLC)的發病機制中同樣發揮重要作用。Del Valle等〔10〕通過免疫組化發現,eIF4G1在NSCLC腫瘤組織中的表達明顯高于癌旁及正常組織,并與NSCLC中的PD-1/PD-L1等免疫檢查點分子具有顯著相關性,應用eIF4G1抑制劑可有效抑制細胞培養和動物模型中 NSCLC的生長。證明了eIF4G1在NSCLC中的臨床相關性、免疫調節功能和治療潛力。Jaiswal等〔22〕在前列腺癌中觀察到,eIF4G1的基因表達與PCa腫瘤分級和分期呈正相關,其蛋白過表達亦與腫瘤進展及轉移有緊密關系,敲低PCa細胞中eIF4G1可引起細胞周期阻滯、增殖抑制及遷移減少。此外,eIF4G1還被認為參與多種疾病及腫瘤的發生發展,是其病情程度判斷及預后評估的重要生物標志物〔22～24〕。然而,eIF4G1在子宮內膜樣癌中表達及與臨床病理參數的關系仍缺少相關報道。

本研究提示,eIF4G1可能參與調控子宮內膜樣癌的發生發展,并與腫瘤的惡性生物學行為相關。eIF4G1因子高陽性表達可能與腫瘤進展、侵襲性增加及不良預后相關。

綜上,eIF4G1有望成為子宮內膜樣癌臨床治療靶點和早期診斷標志物,并為患者病情和預后評估提供參考依據。但是,本實驗也存在不足,如樣本數量有限,可能導致實驗結果偏差,且該因子在子宮內膜樣癌發病中具體作用機制尚未明確,因此,下一步還需擴大樣本規模以提高實驗結果的統計功效及通過離體和在體實驗模型,進一步探索eIF4G1在子宮內膜樣癌發生發展中作用及分子機制。