間充質干細胞對糖尿病腎病小鼠lncRNA的干預及腎臟保護的可能機制

凡洋 李亞玲 雷蕾 白彝華

(昆明醫科大學第二附屬醫院腎臟內科,云南 昆明 650101)

糖尿病腎病(DN)是糖尿病一種嚴重的并發癥,其特點是尿白蛋白排泄增加或腎小球濾過率(GFR)降低,或兩者兼而有之〔1〕。DN目前是導致終末期腎病(ESRD)的主要原因,目前DN的臨床治療重點主要是控制血壓、血糖及蛋白尿,這些措施可減緩而不是預防DN進展,因此許多接受臨床治療的患者最終仍可能進展為ESRD〔2〕。所以,DN作為威脅人類健康的常見疾病,急需對其治療方法及其機制進行深入的探究,以更好地干預疾病進展。

間充質干細胞(MSC)來源于中胚層,是一類具有較強的自我更新能力和多項分化潛能的成體干細胞〔3〕。骨髓MSC(BMSC)已在DN治療中得到廣泛研究。動物模型中,顯示出BMSC改善腎功能及抑制纖維化的能力,但其機制尚不清楚〔4〕。長鏈非編碼RNA(lncRNA)是一類長度大于200 nt的非編碼RNA,參與復雜而精確的基因調控網絡,也與多種疾病的炎癥發生相關。有研究報道,lncRNA與DN的纖維化有關〔5〕。

我們在前期對DN小鼠模型轉錄組測序(RNAseq)數據和正常小鼠進行篩選,篩選出在DN小鼠中表達異常增高的lncRNA,其中lncRNA NONMMUG023935升高最為顯著,但是lncRNA NONMMUG023935與DN的腎小管間質纖維化之間的關系及lncRNA NONMMUG023935在MSC治療DN過程中扮演的角色如何,目前尚未見文獻報道,因此本研究的目標是探索MSC干預對DN小鼠中表達上調的lncRNA的影響及MSC作用下對小鼠腎小管上皮細胞中lncRNA NONMMUG023935表達變化的影響及其對腎臟保護可能機制。

1 材料與方法

1.1主要試劑與儀器 C57BL/6小鼠(南京東極生物),DMEM/F12(Hyclone,SH30023 ),胎牛血清(FBS,Hyclone,SH30070),磷酸鹽緩沖液(PBS,南京生興生物,SN331),Triton X-100(Alladin,T109027),牛血清白蛋白(BSA,Sigma-aldrich,V900933),流式細胞儀(BD,AccuriC6),α-MEM(Hyclone,SH30265.01B/500 ml),Tween-20(Solarbio,T8220),FITC-CD44(eBioscience,11-0441-82),FITC-CD45(eBioscience,11-0451-82),FITC-CD90(eBioscience,MA5-17752),噻唑藍(MTT,beyotime,C0009),CO2培養箱(Thermo fisher,3131),MEM(Hyclone,SH30023),Trizol試劑(Takara,9108),分光光度儀Nano drop 2000(Thermo fisher,ECS000282),熒光定量 PCR儀(Applied Biosystems,Stepone plus),RIPA溶液(Thermo Fisher Scientific,Waltham,MA,USA),十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)儀(Bio-Rad,Mini Protean 3),聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Millipore,ISEQ00010),化學發光檢測系統(Tanon,5200),碧天云二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測定試劑盒。

1.2lncRNA的篩選 將基因表達綜合數據庫(GEO)中的ID為GSE95376的表達數據下載,STZ建模的糖尿病小鼠,取腎臟組織,流式細胞術分離近端腎小管上皮細胞(PTCs),提取RNA,采集腎臟組織細胞在不同時間點進行RNAseq檢測,時間點分別為2、4、8 w,n=2;對照為0 w,n=2。對不同時間點的小鼠RNAseq數據與正常小鼠進行篩選,根據樣本中的基因,依據矯正P值<0.05和基因表達差異倍數(FC)>1.5或<-1.5,選擇上調基因的前20位,得到差異非編碼RNA基因列表。數據分析采用Tophat和cufflink軟件比對(比對基因組為NONCODE v4.0)和分析。

1.3小鼠腎小管上皮細胞(mRTECs)的分離培養及鑒定 ①分離培養。取正常雄性C57BL/6小鼠1只,小鼠頸椎脫臼處死,浸泡在體積分數為75%的乙醇中5 min。無菌取腎,置于盛有4 ℃PBS培養皿中,用鑷子仔細去除腎蒂及包膜,分離、剪碎腎皮質,移置于網篩上,用注射器栓芯輕輕研磨腎組織,并用PBS充分沖洗,將網篩倒扣于培養皿中,再次用PBS充分沖洗,收集網篩上的腎小管節段,1 000 r/min離心5 min,棄上清。向沉淀中加入質量分數為0.2%Ⅱ型膠原酶消化液5 ml,37 ℃水浴振蕩消化15 min,加入含體積分數為10%的胎牛血清的DMEM/F12完全培養液終止消化,獲得的細胞懸液過網篩后1 000 r/min離心5 min,棄上清。加入5 ml含體積分數為10%的FBS的DMEM/F12完全培養液,充分吹打混勻,接種于T25培養瓶中進行原代培養。定期觀察細胞生長狀態,于第3天更換培養基,以后隔天換液。當細胞生長至70%融合時可進行傳代。去除培養基,加入PBS洗1～2次,去除PBS后,加入1 ml胰酶消化1～3 min后,加入3 ml完全培養基中和胰酶終止消化,將消化的細胞轉移至15 ml離心管中,1 000 r/min離心10 min。倒掉上清后,加入3 ml培養基重懸細胞,1∶3傳代至培養瓶中。1 w后,用于后續實驗。②mRTECs鑒定。將細胞從培養箱中取出,去除培養基,加入預冷的 PBS 輕輕將細胞洗2次。加入4%多聚甲醛常溫固定10 min,將多聚甲醛去除,加入預冷的PBS洗3次,每次5 min。加入含0.5% Triton X-100的PBS,在冰上將細胞膜穿刺10 min。去除PBS-Triton,加入預冷的PBS洗3次,每次5 min。加入PBS-3% BSA,常溫封閉30 min。將CK18抗體按照1∶100比例稀釋在PBS-1%BSA溶液中,去除封閉液后,加入一抗,室溫孵育2 h或4 ℃孵育過夜。去除一抗,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5 min。將熒光二抗分別按照1∶400比例稀釋在 PBS-1%BSA溶液中,去除PBS-T后,加入二抗,室溫避光孵育1 h。去除二抗,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5 min。加入100 ng/ml 4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)溶液,室溫避光孵育10 min。去除DAPI,加入PBS-0.35%Tween20,洗3次,每次5 min。加入防熒光淬滅溶液,4 ℃避光放置或直接在熒光顯微鏡拍照。

1.4BMSC分離培養及鑒定 ①分離培養。取C57小鼠1只,頸椎脫臼法處死,浸泡于75%乙醇中5～10 min,無菌手術器械取出雙側股骨及脛骨,去除附著肌肉,將其浸泡于適量PBS中。取5 ml針筒,吸取適量PBS插入一端干骺端,將骨髓中細胞沖至培養皿中,反復幾次,直至股骨和脛骨發白,收集此細胞懸液,用200目濾網過濾去除稍大的雜質,將過濾的細胞懸液收集至離心管中1 000 r/min,5 min離心,棄上清,加入適量α-MEM培養基混勻,接種于培養瓶中,培養在37 ℃含5%CO2細胞培養箱中,2～3 d后全量更換培養基。當細胞長至80%～90%時,去除培養基,加入PBS洗1～2次,去除PBS后,加入1 ml胰酶消化1～3 min后,加入3 ml完全培養基中和胰酶終止消化,將消化的細胞轉移至15 ml離心管中,1 000 r/min離心5 min。倒掉上清后,加入3 ml培養基重懸細胞,1∶3傳代至培養皿中培養。②BMSC鑒定。BMSC培養在MEM培養基中,含10%胎牛血清,100 U/ml的青霉素,100 μg/ml的鏈霉素,培養在37 ℃含5%CO2的細胞培養箱中。當P1代細胞長至80%～90%時,去除培養基,加入PBS洗1～2次,去除PBS后,加入1 ml胰酶消化1～3 min后,加入3 ml完全培養基中和胰酶終止消化,將消化的細胞轉移至15 ml離心管中,1 000 r/min離心5 min。倒掉上清后,加入3 ml培養基重懸細胞,1∶3傳代至6孔板中培養。細胞用胰酶消化后,用PBS洗2次,用PBS將細胞沉淀重懸,將細胞調整成2×107個細胞/ml。1 500 r/min離心5 min,去除上清。取100 μl PBS重懸細胞,按照抗體說明書推薦濃度加入一抗,冰上避光孵育20 min。用PBS將細胞洗3次,每次1 000 r/min,4 ℃離心5 min。加入500 μl PBS將細胞重懸,上流式細胞儀檢測。

1.5細胞處理及分組 按文獻〔6〕方法將mRTECs細胞在DMEM培養基中培養24 h,DMEM中含有體積分數為10%的胎牛血清和5.5 mmol/L(對照組)或30 mmol/L(高糖組)葡萄糖。mRTECs分組:Control(Ctrl)組、高糖組(HG組)、高糖+BMSC(HG+BMSC,transwell 非接觸,即將高糖處理后的mRTECs與BMSC共同在transwell小室中再培養24 h)組。

1.6MTT檢測mRTECs細胞增殖率 將長到培養皿80%～90%的mRTECs細胞用胰酶消化下來,1 000 r/min離心5 min,去除上清,加入完全培養基重懸細胞,將細胞分別種在48孔板中,每孔種10 000個細胞。待細胞貼壁后,HG組和HG+BMSC組更換高糖培養基,HG+BMSC組放置transwell小室,小室內接種BMSC細胞,共同培養24 h后,加入20 μl MTT(5 mg/ml),在細胞培養箱中繼續培養約3 h。去除培養基,每孔加入150 μl 二甲基亞砜(DMSO),搖晃均勻,在570 nm波長測定吸光度。實驗重復3次。

1.7熒光定量PCR檢測 Trizol試劑用于提取各組mRTECs細胞RNA,使用Nanodrop2000對樣品進行定量。RNA純度根據Nanodrop檢測的濃度和OD230、OD260、OD280決定,并進行逆轉錄操作,獲取cDNA,逆轉錄實驗步驟按照逆轉錄試劑盒(takara,RR047)說明書操作。以cDNA為模板,進行熒光定量PCR。引物序列:合成的上皮標志蛋白E-鈣黏蛋白(cadherin)上游5′-CAGTTCCGAGGTCTACACCTT-3′、下游5′-TGAATCGGGAGTCTTCCGAAA A-3′;纖維化指標α-平滑肌肌動蛋白(SMA)上游5′-CCCAGACATCAGGGAGTAATGG-3′、下游5′-TCTAT CGGATACTTCAGCGTCA-3′;vimentin上游5′-CGTCCACACGCACCTACAG-3′、下游5′-GGGGGATGAGGAATAGAGGCT-3′;Ⅰ型膠原(collagenⅠ)上游5′-GCTCCTCTTAGGGGCCACT-3′、下游5′-ATTGGGGACCCTTAGGCCAT-3′,lncRNA NONMMUG023935上游5′-GACCTGGAATATGGCGAGAAA-3′,下游5′-CACGTCCTA CAGTGGACATTT-3′;lncRNA NONMMUG030287上游5′-GGCCATCTCCACTTCTTAACTC-3′,下游5′-CGTGTCTCATGCTCCTTCTTAG-3′;lncRNA NONMMUG004302上游5′-GATGCCACCATCAAGTGAGATA-3′,下游5′-AGGGACTCCACTC CTGTAAA-3′;GAPDH上游5′-AGGTCGGTGTGAA CGGATTTG-3′,下游5′-GGGGTCGTTGATGGCAACA-3′。反應體系20 μl:cDNA模板2.0 μl,上下游引物各0.4 μl,SYBR?Premix Ex Taq(Takara,RR820A,即SYBR green溶液)10.0 μl,滅菌雙蒸水7.2 μl。以GAPDH為內參。實驗重復3次。

1.8lncRNA NONMMUG023935 siRNA干擾及lncRNA NONMMUG023935過表達實驗表達 根據lncRNA NONMMUG023935的NM序列,采用BLOCK-iTTMRNAiDesigner 設計至少3條siRNA:①si-lncRNA NONMMUG023935-1:CTGAAAAAGGTGGAATATTTA;②si-lncRNA NONMMUG023935-1:ACGGAAAATGAGAAATACACA;③si-lncRNA NONMMUG023935-1:ATCATGGAAAATGAGAAACAT。通過脂質體轉染siRNA,驗證敲減效率和轉染的劑量。構建正確的pcDNA3.1(+)-NONMMUG023935質粒擴大培養,si-NC:GAAATCCTCGGCAATCTAACG,用去內毒素質粒提取試劑盒抽提質粒,同時構建空載體作對照組使用。實驗重復3次。mRTECs分組(9組):對照(ctrl)組、過表達對照(NC)組、lncRNA-NONMMUG023935過表達(lncRNA組)組;si-NC組、si-NONMMUG023935(si-lncRNA)組、高糖(HG)組、高糖+si-NONMMUG023935(HG+si-lncRNA)組;高糖+BMSC(HG+BMSC)組、高糖+BMSC+NONMMUG023935過表達(HG+BMSC+lncRNA)組。

1.9Western印跡實驗 采用RIPA溶液提取上述各組蛋白,根據碧云天BCA測定試劑盒說明書操作測定,SDS-PAGE電泳儀分離等量蛋白質并轉移到PVDF膜上,將膜用TBS從下向上浸濕后,移至含有封閉液(質量分數為5 %的脫脂奶粉TBST溶液)的平皿中,室溫下脫色搖床上搖動封閉1 h。將一抗用含質量分數為1%的牛血清白蛋白的TBST溶液按照1∶1 000稀釋于4 ℃孵育過夜,將二抗用TBST按照1∶5 000 稀釋,室溫下孵育2 h后,用TBST在室溫下脫色搖床上洗3次,每次10 min;進行化學發光反應。采用Tanon ECL進行化學發光,按照試劑盒說明書操作,于Tanon5200化學發光成像儀下拍照,獲取圖片,觀察免疫印跡。實驗重復3次。

1.10統計學方法 采用SPSS26.0軟件進行兩獨立樣本的t檢驗、單因素方差分析。

2 結 果

2.1DN小鼠模型中表達上調前3名的lncRNA 前期篩選得到與糖尿病腎病相關的上調前20 lncRNA,分別為:NONMMUG023935(logFC8.51)、NONMMUG030287(logFC6.73)、NONMMUG043418(logFC3.03)、NONMMUG009828(logFC3.41)、NONMMUG042010(logFC3.74)、NONMMUG037567(logFC4.40)、NONMMUG043216(logFC3.55)、NONMMUG001757(logFC2.50)、NONMMUG031457(logFC3.16)、NONMMUG031454(logFC3.36)、NONMMUG018351(logFC3.10)、NONMMUG001726(logFC2.51)、NONMMUG017883(logFC2.48)、NONMMUG016531(logFC2.63)、NONMMUG027387(logFC4.07)、NONMMUG016619(logFC3.46)、NONMMUG004302(logFC4.78)、NONMMUG011245(logFC2.65)、NONMMUG010209(logFC3.99)、NONMMUG035948(logFC3.82)。其中表達上調前3位的lncRNA為NONMMUG023935、NONMMUG030287、NONMMUG004302。

2.2mRTECs鑒定 免疫鑒定呈抗細胞角蛋白(Cytokeration)18抗體染色陽性,細胞角蛋白18是主要在上皮細胞中表達的中間絲蛋白。這些數據表明細胞是mRTECs。見圖1、圖2。

圖1 mRTECs、BMSC細胞白光(×100)

圖2 mRTECs鑒定免疫熒光(×100)

2.3BMSC鑒定 BMSC 細胞CD45陰性,CD44和CD90表達陽性,陽性率分別為97.1%和95.3%,實驗中使用的細胞鑒定為BMSC細胞。見圖1、圖3。

圖3 PDSC細胞流式鑒定

2.4HG刺激及BMSC對mRTECs細胞增殖率的影響 與ctrl組相比,HG組mRTECs細胞增殖率顯著升高(P<0.05);與HG組相比,HG+BMSC組mRTECs 細胞增殖率顯著降低(P<0.05)。說明高糖促進mRTECs細胞增殖能力,加入BMSC后抑制增殖。見表1。

表1 各組mRTECs細胞增殖率、E-cadherin、α-SMA、vimentin 、collagenⅠ及lncRNA NONMMUG023935、NONMMUG030287、NONMMUG004302表達水平比較

2.5HG刺激及BMSC對mRTECs中collagenⅠ、α-SMA、vimentin、E-cadherin、lncRNA NONMMUG023935、lncRNA NONMMUG030287、lncRNA NONMMUG004302表達的影響 PCR檢測結果顯示,相比ctrl組,HG組collagenⅠ、α-SMA 和 vimentin、lncRNA NONMMUG023935、lncRNA NONMMUG030287、lncRNA NONMMUG004302表達水平均顯著上升,E-cadherin表達水平顯著下降(P<0.05),而HG+BMSC組對比HG組,collagenⅠ、α-SMA和vimentin、lncRNA NONMMUG023935、lncRNA NONMMUG030287、lncRNA NONMMUG004302表達水平均顯著下降,E-cadherin表達顯著上升(P<0.05)。說明BMSC細胞共培養可以緩解高糖引起的纖維化作用,在BMSC細胞共培養緩解高糖引起的纖維化作用時,其中lncRNA NONMMUG023935變化最為明顯,后續選用該lncRNA進行后續研究。見表1。

2.6siRNA干擾mRTECs中lncRNA-NONMMUG 023935的表達 ctrl組、si-NC組、si-lncRNA NONMMUG 023935①組、si-lncRNA NONMMUG023935②組、si-lncRNA NONMMUG023935③組lncRNANONMMUG 023935表達分別為:1.00±0.14、0.99±0.10、0.63±0.06、0.68±0.08、0.27±0.07。轉染si-lncRNA NONMMUG023935后,相對應的lncRNA-NONMMUG023935表達降低(F=188.276,P=0.000,n=3),說明si-lncRNA NONMMUG023935在細胞中起到預期的作用。

2.7lncRNA NONMMUG023935對BMSC干預HG刺激的mRTECs中collagenⅠ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達的影響 Western印跡結果顯示,與NC組相比,lncRNA組collagenⅠ、α-SMA、vimentin蛋白表達均顯著上升,E-cadherin蛋白表達水平顯著下降(P<0.05),見表2、圖4,說明lncRNA NONMMUG023935過表達促進腎小管上皮細胞纖維化。與HG組相比,si-NC組、si-lncRNA組、HG+si-lncRNA組collagenⅠ、α-SMA、vimentin蛋白表達均顯著下降,E-cadherin表達顯著上升(P<0.05),提示通過siRNA干擾lncRNA NONMMUG023935表達抑制腎小管上皮纖維化發生。而與HG+BMSC組相比,HG+BMSC+lncRNA組中collagenⅠ、α-SMA、vimentin蛋白表達均顯著上升,E-cadherin蛋白表達顯著下降(P<0.05),見表2、圖4,說明BMSC可能是通過影響lncRNA NONMMUG023935表達從而抑制腎小管上皮纖維化發生。

表2 mRTECs不同處理后collagenⅠ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達比較

圖4 各組mRTECs中collagenⅠ、E-cadherin、α-SMA和vimentin蛋白表達

3 討 論

糖尿病引起的腎臟疾病是全球疾病負擔的主要原因,1990～2012年,因DN導致的死亡人數增加了94%〔7〕。在歐洲、美國、日本,DN已成為ESRD主要病因,而在中國大陸,2015年,它已經超過腎小球腎炎成為住院人群中慢性腎臟病(CKD)主要病因〔8〕。

研究表明,上皮-間充質轉化(EMT)是腎小管間質纖維化發生發展的重要機制,也是DN發展中重要的過程〔9〕。DN發展過程中存在的高脂血癥及蛋白尿均可觸發EMT〔10〕。研究發現,通過不同途徑干預EMT的表達可以改善腎臟纖維化從而控制DN進展〔10,11〕。近年來,MSC作為治療DN的一種可行的手段被廣泛關注并成為研究熱點。有研究表明MSC注射可抑制白蛋白尿和腎小管上皮細胞的損傷及延緩DN的進展〔12〕。這與本研究結果相同,說明高糖促進mRTECs細胞增殖能力,加入BMSC后抑制增殖。MSC延緩DN進展主要是通過修復腎損傷、調節免疫應答、抗炎、抗纖維化實現的〔13〕。在DN細胞模型中,MSC通過不同機制來緩解腎纖維化,減輕DN相關的腎功能損害〔14〕。

有證據表明,lncRNAs可以調節多種生物過程,包括參與DN發病機制和進展〔15,16〕。如高糖環境中通過上調lncRNA MALAT1可誘導人近端小管細胞的EMT和損傷〔17〕。

DN的特征是細胞外基質的積累及微炎癥〔18〕。腎小管間質細胞外基質成分過度沉積是腎纖維化的進展的特征〔19〕。而EMT則被確定是腎臟纖維化的促發因素〔20〕。通過調節E-cadherin和a-SMA的表達可以改善EMT〔21〕。在EMT期間,E-cadherin表達下調,vimentin、α-SMA、 collagenⅠ表達上調〔21,22〕。本研究表明高糖可誘導EMT;lncRNA NONMMUG023935過表達促進腎小管上皮細胞纖維化;通過siRNA干擾lncRNA NONMMUG023935表達可以抑制腎小管上皮纖維化發生。

有研究表明,MSC可改善DN腎臟纖維化及延緩EMT進程〔23〕。本研究結果說明BMSC可以緩解高糖引起的腎小管上皮細胞EMT;MSC抑制小管細胞EMT的作用在過表達lncRNA NONMMUG023935時候減弱了,進一步證實lncRNA NONMMUG023935在MSC抑制EMT過程中發揮作用。

綜上所述,MSC可能是通過下調DN腎小管上皮細胞中lncRNA NONMMUG023935的表達而改善腎臟纖維化,從而延緩DN的進程,這可能為治療DN提供新靶點新思路。但是目前對于lncRNA NONMMUG023935的研究尚不夠多,它與EMT的因果關系及與DN中的炎癥等關系尚不清楚,需更進一步實驗探討。