利用CRISPR/Cas9構建敲除小鼠模型研究PPP2R3A基因對心臟功能的影響

李潔 崔曉花 梁媛 李小鳳 宋貴波

(1昆明醫科大學第一附屬醫院醫學檢驗科,云南 昆明 650032;2云南省檢驗醫學重點實驗室;3云南省醫學檢驗臨床醫學研究中心)

蛋白磷酸酶(PP)2以前稱為 PP2A,是一種重要的絲氨酸(Ser)/蘇氨酸(Thr)蛋白磷酸酶。PP2調節細胞周期和信號傳導中的各個磷酸化反應,因而在細胞增殖、分化、凋亡中起重要作用,并與腫瘤和神經退行性疾病的發生相關〔1〕。PP2全酶由一個65 kD的結構亞基A(PR65)、一個36 kD的催化亞基C和一個調節亞基B組成。調節亞基B包括至少26種結構與功能各不相同的成員,可分為4個家族:B(PR55)、B′(PR61)、B″(PR72/PR130)及B?(PR93/PR110)。PPP2R3A即蛋白磷酸2調節亞基B″家族α亞型(PP2A-B″α)〔2〕。

以上研究表明,PPP2R3A參與心臟的發育。PR72 和 PR130 是PPP2R3A的兩種不同轉錄本。同源性比對發現它們在人、小鼠、大鼠和斑馬魚中是高度保守的〔3〕。當敲除PR130或PR72基因后,斑馬魚出現了心臟發育缺陷,表現為心肌細胞減少、心肌細胞凋亡增加、心室擴大和心臟功能下降(射血面積減少和射血分數縮短)〔3,4〕PPP2R3A定位于心肌細胞的 Z 線和 M 線,并在缺血性心力衰竭患者心肌樣本中表達升高〔5〕。簡而言之,PPP2R3A缺失會影響心臟發育,導致心臟疾病的發生。然而,PPP2R3A參與心臟發育異常的分子調控網絡尚未完全清楚。大部分的蛋白都是和分子伴侶作用或是與其他蛋白質形成復合物來表征其功能,而PPP2R3A也不例外。在前期研究中,本課題組已通過酵母雙雜交篩選出與PPP2R3A潛在作用的19種蛋白〔6〕,本研究擬以CRISPR/Cas9技術敲除C57BL/6小鼠中PPP2R3A基因,以揭示該基因及其互作蛋白在心臟發育中的影響,并為機制研究提供信息。

1 材料和方法

1.1C57BL/6-PPP2R3A小鼠模型的構建 基因敲除小鼠(雄性3只和雌性2只)的構建委托廣州賽業生物科技有限公司完成,簡述如下:根據Gebank上報道的小鼠PPP2R3A序列3號外顯子設計sgRNA靶向序列,并以此為依據合成一對引物(gRNA1:CCGGCTGGGGACTACTTGGAAGG,gRNA2: GATCTGTTCATGGTTACTGCAGG)進行重組質粒構建。待體外轉錄為RNA后,與Cas9 mRNA一起原核顯微注射獲得測序鑒定陽性的F0代陽性小鼠;F0代陽性小鼠與野生型小鼠進行交配,獲得聚合酶鏈反應(PCR)和測序鑒定陽性的F1代雜合子鼠。

1.2敲除小鼠基因型鑒定 剪取出生1 w新生小鼠尾巴,加入消化液后進行小鼠基因組DNA提取,具體提取方法按試劑盒說明書進行。取1.5 μl基因組DNA進行PCR和Sanger測序以鑒定小鼠基因型。鑒定后,基因PPP2R3A缺失型小鼠為KO組,野生型C57BL/6小鼠為WT組(雄性3只,雌性2只)。PCR引物跨越靶位點,序列為:PPP2R3A上游引物:5′-CATTCCCTAGAAACATGCTTACTGCC-3和PPP2R3A下游:5′-AACCTGTGCTTAACGCCAG AGC-3′。PCR條件為94 ℃預變性3 min,94 ℃ 30 s,60 ℃ 35 s,72 ℃ 35 s,72 ℃ 5 min,共35個循環。測序引物為PCR下游。

1.3敲除小鼠的有效性驗證 蘇木素-伊紅(HE)染色:通過頸椎脫臼法處死小鼠,取出心臟并切成厚度約0.5 cm的組織塊,浸入4%多聚甲醛液中固定后依次放入由低到高濃度乙醇(50%、70%、80%、95%和100%)中逐漸脫去組織中的水分,再將組織塊置于二甲苯中透明后浸蠟包埋,隨后放入冰凍切片機箱內切片,切片切出后利用該組織切片與載玻片的溫差立即貼片并烘干后進行HE染色,光鏡下觀察。熒光定量PCR(qPCR):取心臟組織勻漿后提取總RNA,反轉錄后以qPCR進行PPP2R3A表達檢測。引物序列為PPP2R3A上游引物:5′-GACATCTTTGCGAAGGGACC-3′;下游:5′-GACTTCAG CCTCTTCTTAAACCG-3′;磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為內部對照。Western印跡:將心臟組織放入RIPA緩沖液中冰上勻漿,4 ℃離心15 min以除去不溶性物質。使用二喹啉甲酸(BCA)TM蛋白質測定試劑盒對蛋白質進行定量后放入-80 ℃冰箱中下凍存備用。蛋白樣品通過8%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離蛋白,隨后轉移到0.45 μm的聚偏氟乙烯(PVDF)膜上,5%脫脂奶粉在Tris鹽酸緩沖液吐溫(TBST)中室溫封膜2 h。用稀釋的一抗(兔抗鼠PPP2R3A 1∶500稀釋)在4 ℃孵育膜過夜后添加二抗(羊抗兔IgG 1∶1 000稀釋),室溫孵育1.5 h后觀察蛋白。選用β-actin(1∶1 000稀釋)作為內部對照。

1.4G蛋白信號轉導調控因子(RGS)19表達檢測 免疫組織化學染色(直接熒光法):心臟組織的石蠟切片常規脫蠟后用酶消化處理后水化,用0.01 mol/L pH7.4磷酸鹽緩沖液(PBS)洗5 min,冷風吹干,放入濕盒中滴加經稀釋的熒光抗體(1∶2 000,PA5-23210),置于37 ℃孵育60 min,PBS沖洗后用50%甘油緩沖液封片,熒光顯微鏡下檢查。Western印跡:蛋白質樣品通過SDS-PAGE分離,然后轉移到PVDF膜上。用5%脫脂牛奶封閉1 h后,將膜與靶蛋白通過其特異性一抗和辣根過氧化物酶綴合的二抗進行檢測。

1.5統計學分析 采用SPSS25.0軟件進行獨立樣本t檢驗。

2 結 果

2.1CRISPR/Cas9微注射法成功建立PPP2R3A敲除小鼠模型 為了構建PPP2R3A基因敲除小鼠模型,設計了靶向PPP2R3A序列3號外顯子翻譯起始密碼子的sgRNAs,并將sgRNA及Cas9 mRNA一起顯微注射到小鼠胚胎中;所選擇的小鼠系擁有一個113 bp的缺失突變,發現113 bp的差異足以區分WT組和KO組PCR產物。Sanger測序證實了基因PPP2R3A的敲除。見圖1～3。

圖1 生成KO小鼠的CRISPR/Cas9靶向策略:靶向位點用黑色箭頭表示

圖2 PPP2R3A WT和F1代雜合子KO小鼠的PCR基因分型

圖3 KO小鼠基因組 DNA的測序鑒定

2.2敲除小鼠心臟組織中PPP2R3A表達降低 從胚胎發育到成年,PPP2R3A在人類心臟中都有強烈表達,這表明PPP2R3A可能在它們的成熟和功能中發揮重要作用。與WT組相比,KO組心臟組織中PPP2R3A mRNA及蛋白表達顯著降低(P<0.05)。見表1、圖4。

表1 兩組RGS19蛋白相關表達、PPP2R3 mRNA及蛋白相對表達比較

圖4 Western印跡檢測兩組心臟組織中PPP2R3A、RGS19蛋白相對表達

2.3參與心臟發育的調節蛋白RGS19在心肌細胞中表達上調 蛋白RGS19廣泛表達于正常的心肌細胞胞質內,呈均勻的棕褐色;但在PPP2R3A蛋白表達受損的心肌細胞胞質內,RGS19表達量增高,顏色變深,局部呈灶狀分布。與WT組相比,KO組心肌細胞RGS19蛋白水平顯著上調(P<0.05)。見表1、圖4、圖5。

圖5 兩組心臟組織及心肌細胞RGS19蛋白表達(×200)

2.4PPP2R3A敲除引起心臟組織病理變化 HE染色顯示,KO組心肌細胞肥大,排列紊亂,而WT組未見明顯變化。見圖5。表明在PPP2R3A敲除突變體中,PPP2R3A蛋白表達受損引起心臟組織病理學變化。

3 討 論

本研究觀察到敲除PPP2R3A后,小鼠心臟組織出現心肌細胞肥大,排列紊亂等形態學異常。心肌細胞這種病理改變可能是因為PPP2R3A基因的敲除可以抑制心肌細胞增殖并輕度增加心肌細胞的早期凋亡〔6〕。本研究還觀察到PPP2R3A缺失后,受損的心肌細胞內RGS19表達上調,與過表達RGS1轉基因小鼠觀察到的結果相似(室間隔缺損和室壁變薄)〔7〕。此外,有研究報道了RGS19可通過滅活Galpha(o)亞基,進而抑制散亂蛋白(Dsh或Dvl)磷酸化、β-連環蛋白(catenin)聚集和Wnt應答基因轉錄,從而阻斷小鼠F9畸胎瘤細胞中Wnt/β-catenin通路誘導的細胞分化〔8〕。表明RGS19影響心臟發育并對心臟功能產生負面影響。本課題組前期已成功構建人心肌細胞cDNA文庫,通過酵母雙雜交篩選及陽性克隆鑒定、測序比對,發現PPP2R3A與參與調控心臟發育的Wnt信號通路靶向調節蛋白RGS19存在體外相互作用〔4〕。由此本文推測PPP2R3A可能通過RGS19調控Wnt通路影響心臟發育和功能,將來本研究會繼續闡明PPP2R3A與RGS19是如何通過Wnt/β-catenin 信號通路影響心臟發育和功能的機制,為心臟疾病的診療及心臟再生策略提供新的思路和方向。