基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信號通路探究芪黃蓯蓉通便散貼敷對腎衰竭大鼠腸道菌群及腎功能的影響

黃賀明 于賀美 韓晴

(衡水市中醫醫院,河北 衡水 053000)

慢性腎衰竭(CRF)主要是因為代謝產物與毒物在腎組織中積累,使機體內水、電解質及酸堿平衡被打破,生理功能發生異常,直接或間接引起腎臟損害,其特征為腎功能緩慢下降,從而導致不可逆腎硬化和腎單位丟失〔1〕。胃腸道是腎臟疾病“被遺忘的器官”,有研究結果慢性腎功能不全可導致腸道菌群改變和腸屏障功能受損,而腸道微生態失調又可以誘導其進展及發生并發癥〔2〕。研究提出〔3〕慢性腎功能不全“腸-腎軸”概念,著重強調腸道微生態失調在慢性腎功能不全患者炎癥狀態中所扮演的重要作用。中醫學認為,CRF患者表現出的胃納下降、惡心、嘔吐等消化道癥狀及常見的一些腸道器質性病變的發生是與脾胃功能失調密切相關,且脾胃功能失調貫穿于CRF病變的始終。有研究表明〔4〕,CRF與腸道微生態紊亂及腸黏膜屏障功能的損傷相互影響,CRF患者會使體內尿酸積累于體液中,使得大部分廢棄物從腸道釋放,在腸道中以廢棄物為營養物質的菌群增加,使得腸道菌群失衡。大黃、黃芪為治療CRF的常用藥材。大黃、黃芪歸大腸經,用于CRF可能是通過腸-腎軸實現。本研究運用自擬芪黃蓯蓉通便散治療CRF大鼠,該方的主要組成包括黃芪、大黃及肉蓯蓉等,具有健脾益腎、祛瘀降濁的功效。此外,在CRF產生及發展過程中還有多種信號通路參與其中。細胞外信號調節激酶(ERK)1/2-糖原合成酶激酶(GSK)3β-核因子(NF)κB信號通路中,ERK1/2是細胞內信號轉導的重要通路,參與炎癥和纖維化等的過程;GSK3β磷酸化后可調控代謝等多種蛋白表達,還可轉錄激NFκB等因子水平,促進炎癥反應。研究證實〔5〕,磷酸化的GSK3β可調控NFκB及下游靶分子,參與免疫反應和炎癥調節反應。但該通路在CRF中的具體作用尚未有相關文獻報道。本研究基于ERK1/2-GSK3β-NFκB信號通路探究芪黃蓯蓉通便散貼敷對腎衰竭大鼠腸道菌群及腎功能的影響。

1 材料和方法

1.1實驗動物 40只SD大鼠購自長沙市海天勤公司提供〔許可證號:SCXK(湘)-2020-0120〕,體質量200～300 g,自由飲食飲水,適應性喂養1 w后進行實驗。本實驗已通過醫院醫學倫理委員會審批。

1.2實驗試劑 芪黃蓯蓉通便散外用穴位貼敷、復元四紅散中藥材(安國市御顏坊中藥材有限公司),腎功能及氧化應激相關指標試劑盒(武漢賽培生物科技有限公司),蘇木素-伊紅(HE)染色液(南京生航生物技術有限公司),ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相關蛋白一抗(北京百奧思科生物醫學技術有限公司),辣根過氧化物酶二抗(上海李記生物科技有限公司)。

1.3實驗藥物 芪黃蓯蓉通便散外用穴位貼敷:生黃芪、大黃、大黃炭各30 g,酒蓯蓉20 g,厚樸15 g,冰片6 g。諸藥研為細末,過200目細篩,充分混勻,以蜂蜜80 g調為膏狀。復元四紅散:丹參 50 g,生大黃、紅花 、紅藤 、赤芍、川芎、川烏各30 g,乳香、沒藥各15 g,生甘草 10 g。

1.4模型建立及干預 在40只中隨機抽取10只作為健康組進行對照,剩余30只采用經典5/6腎切除術制造模型,將30只大鼠運用4%戊巴比妥鈉麻醉,俯臥位固定鼠臺上,備皮,消毒,從左肋骨下緣,脊柱旁開1.5 cm處縱向切口,長約1.5 cm,暴露左側腎臟,減掉左腎上、下極2/3腎實質。1 w后切去右腎,手術過程同上。以血肌酐(Scr)高于正常值,腎臟組織有炎性細胞浸潤、腎間質纖維化等為建模成功〔6〕。大鼠全部建模成功,將模型大鼠隨機分為模型組、治療組、藥物對照組。健康組與模型組常規飼養;治療組用75%乙醇棉簽清潔貼敷穴位,將芪黃蓯蓉通便藥糊每1 g外敷在神闕穴、雙側天樞穴、大腸俞上,外用防過敏且透氣的貼敷固定,6～8 h后取下,1次/d,共治療28 d。藥物對照組每次取0.5～1.0 g復元四紅散,置于紗布上,敷在大鼠雙腎俞,固定后12 h取下,1次/d,共治療28 d。

樣品采集:給藥結束12 h后,麻醉各組大鼠,腹主動脈取血,3 000 r/min 離心15 min(離心半徑13 cm)取上清,-20 ℃保存備用。同時收集各組腎臟組織,磷酸鹽緩沖液(PBS)清洗后,部分置于4%多聚甲醛固定,部分保存于-80 ℃超低溫冰箱,用于后續實驗。稱取0.1 g標本制成勻漿,進行細菌培養。

1.5酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測腎功能、氧化應激相關指標水平 取各組血液樣本,以3 000 r/min離心10 min,離心半徑為12 cm,將上清凍存于-20 ℃冰箱,ELISA檢測腎功能指標尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、血肌酐(Scr)水平,氧化應激指標脂質氧化丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)水平,實驗嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.6腎組織形態學 將各組大鼠麻醉后,取腎組織,手術刀剪成小塊,漂洗后用4%多聚甲醛固定24 h,流水沖洗1 h用10%乙二胺四乙酸(EDTA)脫鈣液脫鈣2個月,脫水,浸蠟,包埋制成石蠟塊,常規切片,行HE、Masson染色后,中性樹膠封固,顯微鏡下觀察腎組織病理形態。

1.7檢測大鼠腸道菌群 釆集糞便檢測大腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌計數并鑒定。選取典型菌落數15～150 CFU、無蔓延菌落生長的平板,只計數典型菌落數。菌落計數以菌落形成單位表示。鑒定方法采用革蘭染色法。

1.8Western印跡檢測ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相關蛋白 取各組腎組織,剪碎,勻漿,離心后取上清,測定蛋白濃度。將組織裂解產物進行電泳,硝酸纖維素膜轉印,5%脫脂奶粉封閉2 h,加入ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、單核細胞趨化蛋白(MCP)-1、細胞間黏附分子(ICAM)-1一抗(1∶500)孵育4 h,加入辣根過氧化物酶二抗(1∶1 200)孵育4 h,雜交沖洗。后將膜浸入ECL工作液,后進行檢測并獲取圖像。化學發光試劑盒檢測蛋白含量。本研究另選取10只大鼠建立腎衰竭模型后每周給予大鼠尾部注射ERK1/2-GSK3β-NFκB通路抑制劑TDZD-8 1 mg/kg,共28 d,分為抑制劑組,進一步為芪黃蓯蓉通便散貼敷治療腎衰竭提供依據。

1.9統計學分析 采用GraphPad Prism8.0軟件進行單因素方差分析、t檢驗。

2 結 果

2.1各組BUN、Scr、UA水平比較 模型組BUN、Scr、UA水平顯著高于健康組(P<0.05);治療組與藥物對照組顯著低于模型組(P<0.05);且藥物對照組顯著高于治療組(P<0.05),見表1。

表1 各組BUN、Scr、UA水平比較

2.2各組SOD、CAT、MDA水平比較 模型組較健康組SOD、CAT水平顯著降低,MDA水平顯著升高(P<0.05);治療組與藥物對照組較模型組SOD、CAT水平顯著升高,MDA水平顯著降低(P<0.05);與治療組相比,藥物對照組SOD、CAT水平顯著降低,MDA水平顯著升高(P<0.05),見表2。

表2 各組SOD、MDA、CAT水平及腸道菌群菌落總數比較

2.3芪黃蓯蓉通便散貼敷對各組腎組織形態學的影響 HE染色:健康組腎組織結構正常;模型組腎小球變形,腎小管擴張,大量炎性細胞浸潤;與模型組相比,治療組與藥物對照組均有所改善。Masson染色:健康組結構正常;模型組出現腎組織腎小管發生變性、萎縮、破壞及再生等病理改變,間質中單核與淋巴細胞浸潤及膠原纖維表達最多;治療組與藥物對照組腎小管、間質的病理改變得到有效改善,藍色膠原纖維沉積也呈下降趨勢,見圖1。

圖1 各組腎組織形態學(×200)

2.4芪黃蓯蓉通便散貼敷對腸道菌群的影響 模型組較健康組腸球菌、腸桿菌雙歧桿菌顯著增加,乳酸桿菌顯著減少(P<0.05);與模型組相比,治療組與藥物對照組腸球菌、腸桿菌顯著減少,雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著增加(P<0.05);與治療組相比,藥物對照組腸球菌、腸桿菌顯著增加,雙歧桿菌、乳酸桿菌顯著減少(P<0.05),見表2。

2.5芪黃蓯蓉通便散貼敷對ERK1/2-GSK3β-NFκB通路蛋白表達的影響 與健康組相比,模型組ERK1/2、p-ERK1/2、GSK3β、p-GSK3β、NFκBp65、p-NFκBp65、MCP-1、ICAM-1水平顯著升高(P<0.05);與模型組相比,治療組、藥物對照組與抑制劑組以上指標均顯著降低(P<0.05),治療組與抑制劑組以上指標差異無統計學意義(P>0.05);與抑制劑組比較,藥物對照組以上指標均顯著升高(P<0.05)。見表3、圖2。

圖2 各組ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相關蛋白表達

表3 各組ERK1/2-GSK3β-NFκB通路相關蛋白表達

3 討 論

多項實驗證實抑制GSK3β可抑制炎癥反應,對機體起到保護作用〔7,8〕。研究表明〔9〕,GSK3β支持NFκB的轉錄活性,NFκB介導MCP-1、ICAM-1炎癥因子的表達需要GSK3β的高效表達。相關因子磷酸化ERK1/2后,促使胞外的信號轉移至胞內,發揮調控細胞生物學行為的作用。研究表明〔10〕,ERK1/2的持續活化是T細胞增殖、T1細胞分化及腎臟細胞纖維表型轉化的重要信號通路。研究表明〔11〕磷酸化ERK1/2上調可磷酸化下游GSK3β分子,調控心肌細胞線粒體通透性轉換孔的閉合,阻斷ERK1/2-GSK3β可保護心肌免受再灌注損傷。當腎功能減退時,肌肉代謝產物 Scr、血漿含氮化合物 BUN 和嘌呤代謝終產物UA會累積于血液而作為腎功能損傷的重要指標。周琴〔12〕研究提示,通過抑制磷酸化ERK1/2水平,抑制GSK3β磷酸化水平,進而抑制NFκB的轉錄活性,從而抑制其下游炎癥因子MCP-1、ICAM-1水平,發揮抑制腎纖維化及降低炎癥水平、保護腎功能的作用。趙凱亮等〔13〕研究表明,通過抑制GSK3β水平,降低GSK3β磷酸化的表達,進而抑制NFκB水平,降低BUN、Scr活性,改善腎功能。這提示抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路具有改善腎功能的作用。在中醫學將CRF歸屬于“水腫”“癃閉”等范疇,多為其他慢性疾病或并發癥發展而來。其病因病機為脾腎虧虛,濕濁蘊結,病臟為脾腎,并與腸相關。“久病多瘀”,近年醫家認為,CRF的進展里“瘀”伴隨腎虛貫穿于腎臟疾病的始終,隨其產生而又加重其進程。方中生黃芪性味甘,微溫,歸肺,脾經。用生黃芪以健脾補中,益衛固表。生大黃性寒,善于瀉火解毒、逐瘀通經。大黃瀉下作用峻猛,脾胃虛弱者慎用,但將大黃炭化不僅可降低其苦寒之性,減少對脾胃的損傷,而且可增強大黃的活血化瘀療效,促進降濁排毒功能的發揮。故大黃、大黃炭合用,祛邪而不傷正。肉蓯蓉味甘,咸,性溫,歸腎、大腸經,具補腎助陽等功效,久治后能活血通絡效果更佳。厚樸性溫,味苦、辛,下氣除滿和燥濕是其主要功效。其主入脾胃經,為調節脾胃升降,通降胃氣之要藥。冰片可協助藥物透過人體屏障,使多種藥物更好地通過皮膚吸收,具有長效且穩定的優點,作為佐藥幫助其他藥物更好地發揮療效。以上幾種藥物具有健脾益腎、祛瘀降濁之效,用蜂蜜調和可增加藥物溫中健脾的作用,避免藥物對脾胃的損傷。諸藥穴位貼敷外用很容易通過淺表皮膚滲入皮下,此方法避免了肝臟的首過效應和消化酶對藥物成分的分解破壞,使藥物最大程度發揮其主要功效。研究提示〔14～16〕,大黃、黃芪、肉蓯蓉可改善腎功能。此外研究證實〔17〕,復元四紅散對CRF具有一定的治療效果,本研究與上述研究結果相似,提示芪黃蓯蓉通便散貼可改善CRF大鼠腎功能。此外,Western印跡結果顯示,芪黃蓯蓉通便散貼可抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB相關蛋白的表達,且其抑制水平與抑制劑組接近。因此,本研究認為芪黃蓯蓉通便散貼可能是通過抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路的激活,從而發揮腎功能的保護作用。

CRF嚴重危害人類的健康,可引起各大器官疾病甚至衰竭,其發生機制可能與炎癥狀態下腸道菌群結構穩定性發生改變有關〔18〕。人體腸道為不同腸道微生態群落提供了一個穩定且營養豐富的內環境,正常機體腸道微生物可抵抗炎癥及病毒入侵,當在疾病刺激下,腸道微生態被打破,導致腸道菌群失衡,通過調節腸道失調下腸道所產生的內毒素和其他有害細菌的存在決定CRF的整體炎癥狀態,還會影響營養吸收、新陳代謝、免疫反應、炎癥和對病原體的反應,導致感染和慢性疾病〔19〕。CRF患者腸道菌群失調的表現為乳酸桿菌、雙歧桿菌等益生菌減少,大腸桿菌、腸球菌等致病菌增加。由于進行性腎衰竭,代謝毒物不能有效通過腎臟充分排泄,滯留體內導致產生尿毒癥毒素,進入腸腔從而損傷腸道上皮屏障結構和功能,致使腸壁通透性增加,釋放大量炎癥因子等,加重腸黏膜屏障本身的炎性損傷。已有研究證實〔20〕,在尿毒癥狀態下大鼠的腸道菌群會發生改變,同時伴有炎癥因子高表達。鐘瑜萍等〔21〕研究提示,大黃、黃芪可改善CRF大鼠腸黏膜損傷及通透性,從而改善腸道菌群。腸道菌群紊亂會促進炎癥增加,ERK1/2-GSK3β-NFκB具有抑制炎癥的作用,本文認為,芪黃蓯蓉通便散貼可能是通過抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路,減少炎癥水平,從而改善腸道菌群微環境。

綜上,芪黃蓯蓉通便散貼可能是通過抑制ERK1/2-GSK3β-NFκB通路激活,改善CRF大鼠腸道菌群及腎功能。