絞股藍總苷通過miR-210/ISCU途徑調節線粒體能量代謝對ApoE-/-AS小鼠的影響及機制

高浩 陳絲 王杰 王群 楊瑩 趙卓 王瑩 宋囡

(遼寧中醫藥大學,遼寧 沈陽 110847)

動脈粥樣硬化(AS)是一種慢性炎癥性血管疾病,在全球造成數百萬人死亡和財政負擔〔1〕。AS也是老年患者常見疾病,其中,AS是導致老年人死亡的主要原因〔2〕。AS病變主要累及大、中動脈,其病理過程十分復雜〔3〕,許多病理生理因素都有助于AS的發展,如異常的脂質代謝,內皮功能障礙,血管炎癥反應及血管平滑肌細胞的增殖和凋亡等,而AS發展的分子機制尚不完全清楚〔4〕。

miRs是一組長21～22個核苷酸的非編碼RNAs,其功能是通過與目標基因的3′非翻譯區(UTR)結合來抑制基因表達〔5～7〕。已有研究發現miR-210其下游為鐵硫簇組裝蛋白(ISCU)〔8〕,miR-210可以沉默ISCU,而ISCU又參與線粒體復合體Ⅰ酶(ComplexⅠ)中鐵硫簇的組裝和運輸,從而參與線粒體呼吸鏈的傳遞及能量代謝〔9〕。

絞股藍為葫蘆科多年生蔓生草本植物,味甘、苦、性寒,歸肺、脾、腎經,是我國的傳統中藥,其藥效的主要成分是絞股藍總苷。絞股藍總苷具有降血脂、降血糖、抗血栓形成、抑制血小板凝聚等作用〔10,11〕。中醫認為AS的病機為脾失健運,痰淤互結。而絞股藍的健脾補氣之功效較為顯著,能夠通過調節脂質代謝,抑制過氧化物產生;拮抗內皮素,保護內皮細胞等,可從多方面途徑起到拮抗 AS作用〔4〕。由此,本文以miR-210為切入點,探討絞股藍總苷防治AS的分子機制,為課題組后續研究拓展思路,為中西醫結合防治AS提供實驗依據,豐富中醫理論相關科學內涵。

1 材料與方法

1.1動物飼養及分組給藥 將30只健康ApoE-/-小鼠隨機分為模型組、絞股藍總苷組和辛伐他汀組,每組10只。10只C57BL/6J小鼠作為正常組,體質量(20±2)g,購買于北京維通利華實驗動物技術有限公司〔許可證號:SCXK(京)2016-0006〕。動物飼養于遼寧中醫藥大學實驗動物中心,SPF級,環境溫度為(22±1)℃,濕度(50±5)%,自然光照,正常飼料喂飼,自由飲食飲水,適應性喂養7 d后,AS模型小鼠每日給予高脂飼料(含:0.15%膽固醇、41%脂肪)喂飼12 w。造模12 w后,絞股藍總苷組及辛伐汀組分別采用絞股藍總苷〔2.973、2.275 mg/(kg·d)〕灌胃,正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,持續4 w。

1.2試劑、藥物與儀器 膽固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)測定試劑盒(四川邁克生物科技股份有限公司);絞股藍總苷(西安天豐生物科技有限公司);辛伐他汀(杭州默沙東制藥有限公司);蘇木素-伊紅(HE)染色液(北京索萊寶科技有限公司);二甲苯(國藥集團化學試劑有限公司);無水乙醇(天津市大茂化學試劑廠);線粒體呼吸鏈Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ試劑盒(蘇州科銘生物技術有限公司);TRIzon總RNA提取試劑(康為世紀生物科技有限公司);引物由大連TaKaRa公司合成,HiFi-Script gDNA Removal cDNA Synthesis反轉錄試劑盒、UltraSYBR Mixture(LowROX)擴增試劑盒、miRNA cDNA Synthesis反轉錄試劑盒、miRNA qPCR Assay擴增試劑盒(康為世紀生物科技有限公司)等實驗相關試劑。全自動生化分析儀(日本東藝公司);Thermo Scientific Multiskan FC型酶標儀(德國Thermo Scientific公司);BX51型熒光顯微鏡(日本Olympus公司);Wes全自動Western印跡定量分析系統(美國Protein Simple公司)

1.3取材方法 取材實驗前禁止進食12 h,不禁水,稱體質量,采用小鼠摘眼球法取血至EP管中,靜置1～2 h,3 000 r/min,4 ℃,離心15 min,分離上清-80 ℃保存。取小鼠主動脈組織于4%多聚甲醛固定及冷凍。

1.4血脂檢測 按生化試劑盒說明書采用全自動生化分析儀檢測小鼠血清中TC、TG、HDL-C、LDL-C含量。

1.5HE染色觀察主動脈病理形態 將主動脈在 4%多聚甲醛溶液中固定 24 h,按HE染色常規方法進行。70%～100% 梯度乙醇脫水、二甲苯透明,石蠟包埋、切片(切片厚度 5 μm) 、貼片、烤片后,用二甲苯脫蠟、70%～100% 梯度乙醇復水、蘇木素染色、70%鹽酸乙醇分色、伊紅復染后,再用70%～100% 梯度乙醇脫水、二甲苯透明,中性樹膠封片石蠟包埋,光學顯微鏡下觀察小鼠主動脈組織形態。

1.6透射電鏡觀察主動脈線粒體變化 主動脈經2.5%戊二醛固定后,用磷酸鹽緩沖液(PBS,pH7.2)漂洗10 min 3次,再放入1%餓酸(四氧化餓),固定2 h,再用PBS漂洗10 min 3次,50%～90%乙醇逐級脫水,丙酮脫水,環氧樹脂618包埋,38 ℃、45 ℃、60 ℃依次聚合36 h,LKB-V超薄切片機切片約70 nm,醋酸鈾-枸櫞酸鉛雙染色,在H-500型透射電子顯微鏡下觀察主動脈線粒超微結構的變化并拍照。

1.7小鼠主動脈線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ測定 按照線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ～Ⅴ試劑盒說明書測定。

1.8實時熒光定量聚合酶鏈反應(PCR)法檢測主動脈miR-210表達 取小鼠主動脈組織,用miR Neasy Minii試劑盒提取主動脈組織總RNA,按miSeript Ⅱ RT試劑盒說明進行基因組DNA去除后反轉錄,按miSeript SYBR Green PCR試劑盒配制擴增反應體系后進行40個循環的擴增反應。用ΔΔCt法進行相對定量分析。平均相對含量=2-ΔΔCt,為相對于空白對照組mRNA水平。

1.9實時熒光定量PCR法檢測ISCU、線粒體DNA(mtDNA)mRNA、管家基因(GAPDH)表達 用TRIzon試劑盒提取主動脈組織總RNA,基因組DNA去除后反轉錄為cDNA,加人擴增反應體系后進行40個循環的擴增反應。引物由大連TaKaRa公司合成,用ΔΔCt法進行相對定量分析?！鰿t值為目的基因Ct值與GAPDH 的Ct值差值,平均相對含量=2-ΔΔCt,為相對于空白對照組mRNA水平。引物序列(5′-3′):mtDNA上游:CAGCCGCTATTAAAGGTTCG,下游:AGAGTGCGTCATATGTTGTTC;ISCU上游:TGCGGTAGCCTTGTTTTTCG,下游:GAGTCTTCTGAAGTCCCCGT;GAPDH上游:GTGTTTCCTCGTCCCGTAGA,下游:CCTTGACTGTGCCGTTGAAT;miR-210上游:GGCAGTCCCTCCAGGCT,下游:CGCTGCCCAGGGACAGAT;U6上游:ACAGGACACTCCCAG AGAGA,下游:AGCTGGAGAGCTTGTGAGTT。

1.10Wes全自動Western印跡定量分析系統檢測線粒體能量相關蛋白表達 將5 ×master mix、樣品原液與0.1×上樣緩沖液按說明書比例配成上樣樣品,95 ℃,5 min變性。樣品制備后,按照樣品、封閉液、一抗、二抗、發光液及清洗緩沖液的順序分別加入板內,機器自檢后分別放入毛細管芯及板子,按事先設計好的板子布局,開始檢測,180 min完成檢測,進行結果分析。

1.11統計學方法 采用SPSS16.0軟件進行One-Way ANOVA分析及F檢驗。

2 結 果

2.1各組血脂水平變化比較 與正常組相比,模型組血清中 TG、TC、LDL-C 水平顯著升高,HDL-C 水平顯著下降(均P<0.01);與模型組相比,絞股藍總苷組、辛伐他汀組TG、TC、LDL-C 水平顯著降低(P<0.01),絞股藍總苷組與辛伐他汀組HDL-C 水平均無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組血脂水平及主動脈線粒體呼吸鏈變合物表達比較

2.2各組主動脈線粒體呼吸鏈復合物的變化 與正常組比較,模型組線粒體呼吸鏈復合體酶Ⅰ～Ⅴ含量明顯降低(P<0.01);與模型組比較,辛伐他汀組線粒體呼吸鏈復合體酶Ⅰ～Ⅴ含量明顯增加(P<0.05,P<0.01),絞股藍總苷組線粒體呼吸鏈復合體酶Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ含量明顯增加(P<0.05,P<0.01),Ⅱ、Ⅴ 含量無顯著差異(P>0.05)。見表1。

2.3各組主動脈HE染色 與正常組比較,模型組主動脈管腔中斑塊面積范圍較大、程度較重;與模型組比較,辛伐他汀組和絞股藍總苷組主動脈管腔中斑塊面積范圍明顯減小、程度明顯減輕,見圖1。

圖1 各組主動脈(HE染色,×200)

2.4透射電鏡觀察各組主動脈線粒體超微結構 正常組主動脈線粒體呈橢圓形結構,嵴完整且形態正常,粗面內質網較為豐富。與正常組對比,模型組主動脈線粒體形狀不規則,膜缺損,基質變淡,嵴模糊或者斷裂甚至消失。與模型組比較,經辛伐他汀和絞股藍治療后,主動脈線粒體形狀較規則,嵴較完整且未見明顯斷裂,見圖2。

圖2 各組主動脈線粒體電鏡形態(×15 000)

2.5各組主動脈miR-210表達 與正常組相比,模型組主動脈組織miR-210表達水平顯著升高(P<0.01);與模型組相比,絞股藍總苷組主動脈組織miR-210表達水平顯著降低(P<0.05),辛伐他汀組主動脈組織miR-210表達水平無統計學意義(P>0.05)。見表2。

表2 各組主動脈miR-210表達及ISCU、mtDNA mRNA比較

2.6實時熒光定量PCR法檢測主動脈ISCU、mtDNA mRNA表達水平 與正常組相比,模型組主動脈組織ISCU和mtDNA mRNA 表達水平均顯著下降(P<0.05,P<0.01);與模型組相比,絞股藍總苷組主動脈組織ISCU和 mtDNA mRNA 表達水平均顯著升高(P<0.05),辛伐他汀組ISCU mRNA 表達水平顯著升高(P<0.05)。見表2。

2.7各組主動脈ISCU表達 與正常組(1.000 0±0.000 0)比較,模型組ISCU蛋白表達(0.456 5±0.010 5)顯著下降(P<0.01);與模型組比較,絞股藍總苷組ISCU蛋白表達(1.384 0±0.169 8)顯著升高(P<0.01)。見圖3。

圖3 各組主動脈ISCU蛋白表達

3 討 論

AS是心血管疾病(CVD)的主要病因,其涵蓋范圍非常廣,包括心肌梗死、心力衰竭、腦卒中等〔12〕。AS的主要病變是動脈局部脂質沉積,伴有平滑肌細胞和纖維基質增生,逐漸形成AS斑塊〔13〕,因此AS通常被認為是一種慢性炎癥性疾病〔14〕。中醫認為,AS可歸屬“胸痹”“眩暈”“心悸”等范疇〔15〕,其病機為本虛標實,多是由氣虛血瘀所致,血瘀為標、氣虛為本。可見,防治 AS 的重要治則為健脾益氣,活血化瘀。絞股藍系葫蘆科絞股藍屬多年生草質藤本植物?！吨腥A本草》記載其以全草入藥,味苦,微甘,性涼,歸肺、脾和腎經〔16〕,具有清熱益氣健脾、化痰止咳等功效。絞股藍總苷是絞股藍植物的有效成分群,其包含80 余種達瑪烷型四環三萜類人參皂苷類成分,具有降血脂、降血糖、抗氧化、免疫調節、抗腫瘤等作用〔17〕,此外,經前期研究結果發現,絞股藍可以通過影響斑塊形成改善AS,前期研究發現,絞股藍可通過影響線粒體能量代謝進而改善AS;研究發現,在新生兒缺血缺氧腦損傷疾病中,miR-210沉默ISCU會導致線粒體功能障礙,促進新生兒HI后的氧化性腦損傷〔18〕。本研究結果表明,絞股藍總苷可以抑制斑塊形成防治AS。

miRNA是一類大小為19～25個堿基(平均22個堿基)的內源性非編碼小RNA分子,通常與靶基因mRNA的3＇UTR結合調控翻譯,主要通過靶向信使RNA影響基因表達水平〔19〕。研究表明,多種來源的miRNA參與了AS的炎癥過程,通過引起炎癥反應而導致動脈壁發生多種病變,進一步加劇了AS 的發展〔20〕。在正常氧條件下,miR-210單獨傳遞足以抑制線粒體能量生成,削弱氧氣消耗,誘導乳酸積累,改變線粒體膜電位,破壞線粒體結構〔21〕。ISCU是miR-210的直接靶點之一,通過下調線粒體代謝,特別是抑制氧化呼吸鏈復合體來促進能量代謝的轉變〔18〕。Fe-S簇作為電子傳遞鏈中黃素蛋白的輔基,使線粒體呼吸和能量產生中發生氧化還原反應〔22〕,它是線粒體氧化呼吸鏈復合體Ⅰ、Ⅱ中傳遞電子的重要功能性輔助因子〔23〕。ISCU是鐵硫簇組裝過程中非常重要的一部分,能夠將組裝成熟的鐵硫簇傳遞給目標蛋白,是鐵硫簇功能能夠正常發揮的核心分子要素。如果ISCU發生基因突變,會導致鐵硫簇減少,氧化還原反應增加,線粒體能量穩態失衡,進一步發生AS。

課題組前期研究發現,在絞股藍總苷的理論指導下,健脾益氣,活血化瘀是防治AS的關鍵治則。絞股藍之健脾補氣較為突出,絞股藍總苷能通過影響線粒體能量代謝、保護內皮細胞等多方面途徑起到拮抗AS的作用〔24〕。本研究發現,miR-210與ISCU存在靶向調控的關系,且經絞股藍總苷干預后,miR-210/ISCU途徑可以有效抑制線粒體能量代謝防治AS形成。因此,靶向miR-210/ISCU可作為治療AS的創新療法,也為絞股藍總苷防治AS提供了一定的科學依據,課題組也將在后續的實驗研究中進行更深入的探討。