健脾補腎化瘀膠囊對老年2型糖尿病大鼠神經(jīng)保護相關蛋白的調控作用

李娟娟 南一 袁玲 黨翔 宋麗 黨毓起

(寧夏醫(yī)科大學 1中醫(yī)學院,寧夏 銀川 750004;2藥學院;3附屬銀川市中醫(yī)院)

最近研究數(shù)據(jù)表明,我國約有糖尿病(DM)患者1.26億,患病率約達11.2%〔1〕。DM認知功能障礙(DCD)是DM的中樞神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥,國內外研究結果顯示DM是引起認知功能下降和癡呆的重要危險因素〔2～4〕,與其他非DM患者相比,DM患者患癡呆的風險顯著增加〔5〕,且2型DM(T2DM)發(fā)生認知功能障礙的風險更大,DCD患者臨床主要表現(xiàn)在近記憶力減退、注意力下降、執(zhí)行能力及抽象思維下降、推理能力及運動協(xié)調能力下降〔6〕,隨著病程延長,后期可發(fā)展為癡呆;患者還伴發(fā)有抑郁、情緒控制能力及心理適應能力下降等情緒障礙〔7〕。隨著老年T2DM患者數(shù)量的增加,伴有認知功能障礙的DM患者越來越多。目前,T2DM的管理策略并不有利于認知功能障礙的改善,從而給患者、家庭和社會帶來負擔,DM在認知功能損傷和癡呆的發(fā)生發(fā)展過程中的作用已成為科研及臨床關注的重點。研究發(fā)現(xiàn),褪黑素(MT)、褪黑素受體(MTR)、環(huán)磷酶腺苷(cAMP)、腦源性神經(jīng)養(yǎng)因子(BDNF)、神經(jīng)元型一氧化氮合酶(nNOS)在認知功能損害中具有重要作用,本實驗旨在探討健脾補腎化瘀膠囊對認知功能的影響。

1 材料與方法

1.1實驗動物 SPF級雄性SD大鼠100只,17月齡,購自寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心,許可證號:SCXK(寧)2020-0001。獲得寧夏醫(yī)科大學倫理委員會批準,飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學實驗動物中心獨立通氣籠中,2只/籠,室內溫度與濕度恒定,每日給予大鼠充足的飼料與水,所有實驗遵循實驗動物倫理學規(guī)定。

1.2主要藥物 健脾補腎化瘀膠囊(由寧夏醫(yī)科大學附屬銀川市中醫(yī)院提供,院內制劑編號:rhdm041-sjh01-04,藥物組成:黃芪、黨參、赤芍、當歸、地龍、牛膝、生地黃、熟地黃、茯苓、紅花、酒黃精、肉桂等)。奧拉西坦膠囊(規(guī)格:0.4 g ×24粒,批號:H20031033,石藥集團歐意藥業(yè)有限公司)。

1.3主要儀器及試劑 -80 ℃冰箱(美國,Thermo)電子秤(11387921,日本獨資上海寺岡電子有限公司),離心機(TD5KR,中國東旺儀器 ),酶標儀(MultiSan3,美國Thermo),切片機(LEICA RM2235,徠卡公司),數(shù)字病理掃描系統(tǒng)(Aperio LV1,徠卡公司),鏈脲佐菌素(STZ,美國Sigma公司),酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海江萊生物科技有限公司),Anti-BDNF(北京博奧森生物科技有限公司),二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術有限公司)。

1.4T2DM大鼠造模、分組及給藥 100只SD雄性大鼠,飼養(yǎng)至18月齡后,可滿足老年大鼠實驗要求〔8,9〕,將大鼠隨機分為兩組,對照組(10只)給予普通飼料;其余為實驗組,喂高脂高糖飼料(Boaigang-1135DM,由北京博愛港生物技術有限公司提供),均自由進食、飲水4 w,誘發(fā)胰島素抵抗,將實驗組大鼠空腹12 h后,按37 mg/kg體質量腹腔注射1% STZ溶液,注射后繼續(xù)喂以高脂高糖飼料,對照組腹腔注射相當劑量的檸檬酸鈉緩沖液,喂普通飼料,72 h后尾靜脈點刺采血檢測大鼠隨機血糖,選擇血糖≥16.7 mmol/L的大鼠,維持穩(wěn)定2 w作為T2DM大鼠成模標準〔10〕。造模成功后,將實驗組隨機平均分為Model組、ORC組、JPBS組、JPBS+ORC組,每組10只,采用灌胃給藥方式干預6 w,1次/d,ORC組給予奧拉西坦0.2 g/kg〔11〕,JPBS組給予健脾補腎化瘀膠囊0.6 g/kg〔12〕,JPBS+ORC組給予健脾補腎化瘀膠囊0.6 g/kg+奧拉西坦0.2 g/kg,對照組和 Model組給予等體積生理鹽水,根據(jù)體質量調整給藥劑量。對照組、ORC組、JPBS組、JPBS+ORC組給予普通飼料,Model組繼續(xù)喂以高脂高糖飼料,給藥期間觀察大鼠一般情況變化。

1.5血清的采集和檢測 Morris水迷宮實驗結束后,大鼠禁食12 h麻醉后心尖取10 ml,分離血清,4 ℃ 3 000 r/min,離心15 min,收集血清樣本,將血清分裝到無菌EP管中,保存于-80 ℃冰箱用于ELISA試劑盒檢測MT、MTR、cAMP。

1.6腦組織取材、標本制備及檢測方法 待大鼠深度麻醉后,仰臥位固定,由劍突處剪開胸腔充分暴露心臟,輸液器專用針頭從左心室插入至升主動脈,固定針頭,剪開右心耳,先用預熱的0.9%氯化鈉注射液快速灌注,直至從右心耳流出液體變清亮后,換用預冷的4%多聚甲醛溶液緩慢灌注至大鼠身體僵硬。充分固定后,冰浴取腦,分離含有海馬的腦組織,置于4%多聚甲醛溶液中固定過夜。脫水,透明,浸蠟,切片,烤片。放入切片盒內,4 ℃冷藏保存。HE染色觀察海馬組織病理形態(tài)學改變,免疫組化法檢測海馬組織BDNF蛋白表達。

1.7統(tǒng)計學處理 采用SPSS25.0軟件進行單因素方差分析、LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1健脾補腎化瘀膠囊對海馬組織病理學觀察 與對照組相比,Model組神經(jīng)元排列松散、無序、模糊,細胞核和細胞質之間界限不清晰。給予健脾補腎化瘀膠囊治療后,JPBS組和JPBS+ORC組海馬神經(jīng)細胞損傷得到有效緩解,壞死和凋亡細胞數(shù)量也明顯減少,且神經(jīng)細胞損傷逐漸減輕或維持穩(wěn)定,特別是在JPBS+ORC組中最顯著,與Model組相比,ORC組海馬組織損傷情況也有所改善,見圖1。

圖1 各組海馬組織(HE染色,×200)

2.2健脾補腎化瘀膠囊對T2DM大鼠MT、MTR表達的影響 Model組MT、MTR表達顯著低于對照組(P<0.01),除ORC組MTR外,ORC組、JPBS組、JPBS+ORC組MT和MTR與Model組相比均顯著升高(P<0.01);JPBS組和JPBS+ORC組MTR表達顯著高于ORC組(P<0.01);JPBS組MT表達顯著低于ORC組(P<0.01),JPBS+ORC組顯著高于ORC組(P<0.05),見表1。

表1 各組MT、MTR、cAMP蛋白表達

2.3健脾補腎化瘀對T2DM大鼠cAMP表達的影響 Model組cAMP表達顯著低于對照組(P<0.01),ORC組、JPBS組、JPBS+ORC組與Model組相比均顯著升高(P<0.01),JPBS組和JPBS+ORC組顯著高于ORC組(P<0.01),見表1。

2.4健脾補腎化瘀膠囊對T2DM大鼠BDNF表達的影響 Model組BDNF表達顯著低于對照組(P<0.01),ORC組、JPBS組、JPBS+ORC組與Model組相比均顯著升高(P<0.01),且JPBS+ORC組顯著高于ORC組(P<0.01),JPBS組與ORC組相比無統(tǒng)計學差異(P>0.05),見表1、圖2。

圖2 健脾補腎化瘀膠囊對T2DM大鼠BDNF表達的影響(×200)

2.5健脾補腎化瘀膠囊對T2DM大鼠nNOS表達的影響 Model組nNOS表達顯著低于對照組(P<0.01),ORC組、JPBS組、JPBS+ORC組與Model組相比均顯著升高(P<0.01),JPBS組、JPBS+ORC組顯著高于ORC組(P<0.01),見表1、圖3。

圖3 健脾補腎化瘀膠囊對T2DM大鼠nNOS表達的影響(×200)

3 討 論

研究發(fā)現(xiàn)〔13〕,T2DM患者或動物其血清MT水平均下降,尤其在夜間更加明顯;且MT晝夜分泌的波動幅度變小,正常節(jié)律被破壞,而且隨著病程進展MTR的表達逐漸下降甚至發(fā)生缺失;MTR是一種特異、高效的G蛋白耦聯(lián)膜受體,有MTNR1和MTNR1B兩種亞型,MT發(fā)揮生物效應依賴于與MTR的結合,依次與細胞內的一個或多個效應器系統(tǒng)相聯(lián)系,給予T2DM患者MT治療,可改善胰島素抵抗,保護胰島β細胞功能,調節(jié)血脂代謝。MT和其特異性受體進行結合通過信號轉導發(fā)揮生物學效應,對抗體內過度磷酸化tau蛋白形成神經(jīng)纖維纏繞,能夠發(fā)揮保護神經(jīng)元細胞完整性的作用〔14〕。研究發(fā)現(xiàn),cAMP信號通路與機體認知功能下降有密切關系〔15〕;cAMP信號通路下游相關蛋白,包括蛋白激酶(PK)A〔16〕、cAMP反應元件結合蛋白(CREB)〔17〕和BDNF〔18〕在機體的學習記憶形成中發(fā)揮重要作用〔19〕。cAMP作為細胞內重要的第二信使之一,主要參與真核細胞生物進行細胞信息轉導,通過激活PKA使其磷酸化后開啟基因表達,在記憶的形成過程中至關重要,細胞內cAMP過量的增加或減少都會造成學習記憶減低〔20,21〕。

BDNF是神經(jīng)營養(yǎng)因子家族中的一員,主要在中樞神經(jīng)內表達,對神經(jīng)元分化、生長、發(fā)育發(fā)揮重要作用,同時能夠修復受損神經(jīng)元,改善學習及認知功能〔22～24〕。具體來說,BDNF支持海馬體中的谷氨酸神經(jīng)元,促進長期電位增強,從而促進長期記憶存儲,并增強樹突棘的生長和重組,以響應神經(jīng)元活動變化,即BDNF對促進長期記憶和存儲的持久性十分重要。相關研究表明,海馬區(qū)BDNF可能在認知功能障礙中有重要保護作用〔25〕。學習記憶的重要解剖學基礎與中樞神經(jīng)系統(tǒng)相關,特別是與大腦邊緣系統(tǒng)的重要組成部分-海馬關系密切〔26〕。目前有研究認為大腦海馬區(qū)中的nNOS可能參與了學習記憶的重要環(huán)節(jié)和過程,同時又是合成神經(jīng)遞質一氧化氮(NO)的關鍵酶〔27〕。研究發(fā)現(xiàn),認知功能損傷后海馬區(qū)nNOS陽性細胞數(shù)和積分光密度值明顯降低〔28〕。

綜上,健脾補腎化瘀膠囊可以改善海馬組織病理形態(tài)學改變,調控影響認知功能相關蛋白MT、MTR、cAMP、BDNF、nNOS的表達,推測健脾補腎化瘀膠囊對老年T2DM大鼠的認知功能具有保護作用,可以有效延緩T2DM向DCD的發(fā)展。