天麻素調節cAMP/PKA/CREB信號通路對阿爾茨海默病大鼠認知障礙的影響

陳逢義 王艷平 向慶偉

(長江大學附屬仙桃市第一人民醫院 1神經內科,湖北 仙桃 433000;2眼科;3湖北省中醫院老年病科;4湖北省中醫藥研究院;5湖北中醫藥大學附屬醫院)

阿爾茨海默病(AD)癥狀包括情緒變化、嚴重的記憶力減退和認知障礙〔1〕。病理學研究表明,AD患者大腦中存在β-淀粉樣蛋白(Aβ)斑塊及以神經膠質細胞激活和存在各種炎癥成分為特征的神經炎癥〔2,3〕。盡管已經對AD治療進行了許多研究,但尋找治愈該疾病的干預措施仍是一個挑戰。天麻素(GT)作為天麻的主要生物活性成分,已有研究報道,GT可減輕AD大鼠海馬CA1區神經元損傷,提高學習記憶能力〔4〕。提示GT具有改善AD大鼠認知障礙的作用。而關于GT改善AD大鼠認知障礙的具體機制尚不完全清楚。先前研究顯示,環磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶(PK)A/cAMP反應元件結合蛋白(CREB)通路激活可減輕AD小鼠認知缺陷〔5〕。而GT能否通過調控cAMP/PKA/CREB通路減輕AD大鼠認知障礙尚不明確。本研究主要探究GT對AD大鼠認知障礙的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物 60只雄性SPF級SD大鼠購自吉林大學(實驗動物中心),生產許可證號:SYXK(吉)2021-0006。本研究得到醫院動物倫理委員會的批準,所有動物實驗遵循3R原則。

1.2主要試劑 GT(純度≥98%,貨號:XY21243)購自上海信裕生物公司;PKA抑制劑H-89(貨號:KGR0043)購自江蘇凱基生物公司;白細胞介素(IL-6,貨號:SZ-HAS-336)、離子鈣接頭蛋白(IBA)-1酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(貨號:HAS-49076)、鏈脲佐菌素(STZ,貨號:18883-66-4)購自深圳海思安生物公司;大鼠cAMP ELISA試劑盒(貨號:QN-PS2085)購自上海喬羽生物公司;兔源一抗Aβ42(貨號:SFK079)購自上海士鋒生物公司;兔源一抗p-PKA(貨號:ab75991)、PKA(貨號:ab216572)、p-CREB(貨號:ab32096)、CREB(貨號:ab32515)、β-actin(貨號:ab8226)、Alexa Fluor 488標記的山羊抗兔二抗(貨號:ab150077)及辣根過氧化物酶(HRP)標記的羊抗兔二抗(貨號:ab6728)均購自Abcam公司。

1.3AD大鼠模型構建及分組 AD大鼠模型構建〔6〕,用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠,固定頭部,碘伏消毒,沿矢狀線切開皮膚,暴露顱骨,用骨鉆在前囟后1.0 mm、矢狀縫旁開1.5 mm處鉆孔,利用注射器將10 μl STZ溶液(3 mg/kg)緩慢注入腦室,注射后留針1 min,以同樣方式將10 μl STZ溶液注入另一側腦室,間隔2 d再向腦雙側注射STZ,縫合皮膚,連續注射5 d慶大霉素以防感染。NC組除向雙側腦室注射10 μl生理鹽水外,其余操作同造模過程。將60只SD大鼠分為NC組、Model組、GT組、H-89組、GT+H-89組,每組12只。除NC組外,其他組均構建AD大鼠模型。建模成功后,第10天開始給藥處理,GT組〔7〕灌胃300 mg/kg GT并腹腔注射5 mg/kg生理鹽水,H-89組〔8〕腹腔注射5 mg/kg H-89并灌胃300 mg/kg生理鹽水,GT+H-89組灌胃300 mg/kg GT,同時腹腔注射5 mg/kg H-89,NC組和Model組同時灌胃300 mg/kg生理鹽水并腹腔注射5 mg/kg生理鹽水,每天1次,持續4 w。

1.4標本收集 末次給藥結束后,對各組進行認知障礙的評定;評定結束后,用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠后處死,收集大鼠海馬組織,分為兩部分,一部分固定于4%多聚甲醛中,一部分凍存于液氮中。

1.5Morris水迷宮實驗 測試大鼠空間學習能力:將大鼠放在任意一個入水點處,將大鼠游到平臺的時間記錄為逃避潛伏期,若在2 min內大鼠不能游到平臺就引導其爬到平臺,按照這種方式持續訓練5 d,觀察并記錄第6天的逃避潛伏期。測試大鼠空間記憶能力:在第7天時撤去平臺,將距平臺最遠的位置設置為入水點,觀察并記錄大鼠在2 min內穿臺次數〔9〕。

1.6蘇木素-伊紅(HE)染色檢測AD大鼠海馬CA1區病理損傷 將固定在4%多聚甲醛中的海馬組織樣本進一步處理并包埋在石蠟中,用切片機獲得5 μm切片。切片用蘇木素和伊紅染色后,利用光學顯微鏡觀察切片病理學變化。

1.7免疫熒光檢測海馬Aβ42斑塊沉積 將海馬組織切片經脫蠟、磷酸鹽緩沖液(PBS)平衡后,置于2 mol/L鹽酸中,在37 ℃恒溫搖床中孵育30 min,再在0.1 mol/L硼酸中孵育10 min后,用TBS洗滌。然后將切片用10%驢血清封閉1 h,加入一抗Aβ42(1∶300)在4 ℃溫育過夜,洗滌后,加入Alexa Fluor488標記的二抗在常溫下孵育1 h,用TBS洗滌后,將切片置于載玻片上,蓋上蓋玻片,利用熒光顯微鏡觀察并拍照。

1.8ELISA檢測海馬組織中IL-6、IBA-1、cAMP水平 將海馬組織用預冷的生理鹽水進行勻漿,2 500 r/min離心10 min,取上清液。利用IL-6、IBA-1、cAMP試劑盒測定海馬組織中IL-6、IBA-1、cAMP水平。

1.9Western印跡檢測p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達 利用RIPA裂解緩沖液提取海馬組織勻漿中的總蛋白,將等量的蛋白質進行電泳、轉膜、封閉,然后與一抗p-PKA(1∶2 000)、PKA(1∶1 000)、p-CREB(1∶2 000)、CREB(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)在4 ℃下過夜,再與山羊抗兔二抗共同孵育1 h后,加入ECL觀察顯色,利用ImageJ軟件量化蛋白灰度值。

1.10統計學分析 采用SPSS19.0軟件進行方差分析,兩組間比較行SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1GT對AD大鼠認知障礙的影響 與NC組比較,Model組逃避潛伏期明顯延長,穿臺次數明顯減少(P<0.05);與Model組比較,GT組逃避潛伏期明顯縮短,穿臺次數明顯增多,而H-89組對應指標呈相反變化趨勢(P<0.05);與GT組比較,GT+H-89組逃避潛伏期明顯延長,穿臺次數明顯減少(P<0.05),見表1。

表1 GT對AD大鼠認知障礙、Aβ42熒光強度、海馬組織中IL-6、IBA-1、cAMP水平及p-PKA、p-CREB蛋白表達的影響

2.2GT對AD大鼠海馬組織中IL-6、IBA-1水平的影響 與NC組比較,Model組IL-6、IBA-1水平明顯升高(P<0.05);與Model組比較,GT組IL-6、IBA-1水平明顯降低,而H-89組對應指標變化呈相反趨勢(P<0.05);與GT組比較,GT+H-89組IL-6、IBA-1水平明顯升高(P<0.05),見表1。

2.3GT對AD大鼠海馬Aβ42斑塊沉積的影響 與NC組比較,Model組海馬Aβ42斑塊沉積明顯增多(P<0.05);與Model組比較,GT組海馬Aβ42斑塊沉積明顯減少,而H-89組Aβ42斑塊沉積明顯增多(P<0.05);與GT組比較,GT+H-89組大鼠海馬Aβ42斑塊沉積明顯增多(P<0.05),見表1、圖1。

圖1 各組海馬Aβ42斑塊沉積(免疫熒光染色,×200)

2.4GT對AD大鼠海馬CA1區神經元損傷的影響 NC組海馬CA1區神經元結構完整,排列整齊,著色均勻;Model組海馬CA1區神經元結構不規則、排列紊亂、細胞核固縮、空泡化和壞死嚴重;與Model組比較,GT組海馬CA1區神經元損傷有所緩解,而H-89組海馬CA1區神經元損傷加劇;與GT組比較,GT+H-89組神經元損傷嚴重,見圖2。

圖2 各組海馬CA1區神經元損傷(HE染色,×200)

2.5GT對AD大鼠海馬組織中cAMP/PKA/CREB通路相關蛋白表達的影響 與NC組比較,Model組cAMP水平、p-PKA、p-CREB蛋白表達顯著降低(P<0.05);與Model組比較,GT組cAMP水平、p-PKA、p-CREB蛋白表達顯著升高(P<0.05),H-89組cAMP水平變化無顯著差異(P>0.05),p-PKA、p-CREB蛋白表達顯著降低(P<0.05);與GT組比較,GT+H-89組cAMP水平變化無顯著差異(P>0.05),p-PKA、p-CREB蛋白表達顯著降低(P<0.05),見表1、圖3。

圖3 Western印跡檢測p-PKA、PKA、p-CREB、CREB蛋白表達

3 討 論

AD是一種進行性神經退行性疾病,伴有神經炎癥和認知能力下降,盡管多年來為尋找有效的治療藥物付出了巨大的努力,但目前仍未找到能夠治愈AD的方法〔10〕。雙側腦室注射STZ可導致腦內Aβ沉積,進而損傷海馬神經元造成學習與記憶能力下降,是構建AD模型常用的方法〔11〕。研究報道,Aβ42蛋白在AD大鼠海馬組織中的表達明顯高于正常大鼠〔12〕;IL-6作為重要的促炎細胞因子,在AD患者腦中呈高表達狀態并誘導神經炎癥導致神經元損傷,進而加劇小膠質細胞的活化,促進膠質細胞激活狀態下的標志物IBA-1的表達〔13,14〕。本研究結果與上述結果一致。本研究提示,AD大鼠海馬組織中Aβ42蛋白呈高表達。本研究還表明,AD大鼠海馬組織中存在神經炎癥。

GT可廣泛用于預防和改善中樞神經系統疾病〔15〕。Chen等〔16〕報道,GT可改善血管性癡呆大鼠的學習和記憶障礙;劉德玲等〔17〕闡明GT可改善AD大鼠的學習記憶能力,具有一定的神經保護作用。表明GT具有改善認知障礙的作用。本研究結果與上述研究是一致的,本研究證實,GT能夠改善AD大鼠認知障礙,GT對AD大鼠發揮保護作用。

cAMP/PKA/CREB通路是對記憶鞏固至關重要的通路,該通路的抑制可能在一定程度上導致認知能力下降〔18〕。相關文獻報道,激活cAMP/PKA/CREB通路可改善神經元損傷,進而提高D-半乳糖誘導的衰老模型大鼠認知能力〔19〕;上調cAMP/PKA/CREB信號通路可改善AD小鼠認知行為和中樞病理損傷〔20〕。本研究結果證實,GT可能通過激活cAMP/PKA/CREB通路改善AD大鼠認知障礙。