基于HIF-1α/VEGF通路探討土家族麝針療法“活血生新”干預缺血性腦卒中大鼠的作用機制

余秀 涂星,3 陳嘉碧 袁麗君 李三宇 陳通華 李鴻 張鈺

(湖北民族大學 1風濕性疾病發生與干預湖北省重點實驗室,湖北 恩施 445000;2醫學部;3武陵山中藥材檢驗檢測中心)

缺血性腦卒中臨床表現為猝然昏仆、人事不知、口眼歪斜、語言不利等〔1～3〕。缺血性腦卒中作為世界第二死因與第一致殘原因,其致死率僅次于缺血性心臟病,給個人和社會帶來沉重的負擔〔4〕。

土家族麝針療法是土家族民間流傳甚久的一種常用治療方法,用于穿刺癤腫膿皰、針刺穴位、局部放血等〔5〕。前期研究表明〔6～8〕,土家族麝針療法對缺血性腦卒中大鼠的血液循環具有較好的改善作用,可以促進缺血性腦卒中大鼠的神經運動功能的改善,其通過調節血清、血漿中的細胞因子可以改善腦部缺血的狀態,從而減少缺血對腦部的損傷,達到腦保護的作用,其作用機制可能與麝針具有芳香化濁、通筋脈、行氣滯、散瘀血作用有關。

在缺血性腦卒中早期,缺氧誘導因子(HIF)-1α可促使細胞凋亡,在后期則促使細胞增殖,因此HIF-1α可能屬于雙向調節因子。HIF-1α磷酸化后可激活血管內皮生長因子(VEGF)等抗凋亡基因,一方面促進微血管和側支循環的形成,增加腦血流量,同時刺激神經元細胞增殖、分化等,起到腦保護作用〔9〕。VEGF具有促進血管內皮細胞分裂、誘發血管形成及增加血管通透性的功能,在缺氧條件下,VEGF作為HIF-1α的靶基因之一,被HIF-1α誘導而轉錄激活〔10,11〕。

缺血性腦卒中在損傷機制與缺血缺氧的情況下,泛素會被HIF-1α激活上調HIF-1α,進而促進了VEGF的表達釋放,導致血管內皮細胞的增殖分裂與VEGF受體(VEGFR)2結合,使Src蛋白過度釋放,進而導致一氧化氮合酶(NOS)的釋放改變,從而使血管的通透性和血管的新生增強,達到改善缺血性腦卒中的目的。因此,調控HIF-1α/VEGF通路可能促進缺血性腦卒中的康復。但土家族麝針療法治療缺血性腦卒中大鼠的作用機制是否與HIF-1α/VEGF通路表達有關,未見相關報道。本研究通過研究HIF-1α/VEGF通路探討土家族麝針療法干預缺血性腦卒中模型(MACO)大鼠的作用機制。

1 資料與方法

1.1實驗動物 清潔級SD雄性大鼠80只,5～7周齡,體質量(200±20)g,購于湖北省實驗動物中心,許可證號:SCXK(鄂)2015-0001。飼養環境溫度(22±2)℃,濕度50%～70%,12 h/12 h光暗體系。

1.2藥品及試劑 土家族麝針(實驗室自制,專利號:201720035406.2);水合氯醛(CP,批號:150307,廣州化學試劑廠);大鼠蛋白激酶A ELISA試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司);通用型二抗試劑盒、β-actin抗體、山羊抗小鼠IgG、山羊抗兔IgG(北京中杉生物試劑公司);VEGFR2一抗(美國 Abcam),電化學發光(ECL)超敏發光試劑盒(美國Thermo);酪氨酸蛋白激酶家族成員(Src)抗體(Cell Signaling Technology公司);其他試劑均為分析純。

1.3主要儀器 Western印跡電泳及轉膜裝置(國Bio-Rad公司);TU-1901紫外-可見分光光度計(北京普析通用儀器有限責任公司);酶標定量測定儀(德國Thermo公司);PELAMB DABIO 20雙光束紫外分光光度計(美國PerkinElmer公司);5810R 高速冷凍離心機(德國Eppendorf公司);TS-Ⅰ型搖床(江蘇海門麒麟醫用儀器廠)。

1.4實驗方法

1.4.1缺血性腦卒中大鼠模型的制備及篩選 根據文獻〔6～8〕,取80只SD大鼠,隨機分成模型組(n=60),假手術組(n=20)。水合氯醛以3 ml/kg劑量麻醉后大鼠,頸部正中縱行切口切開皮膚,依次分離肌肉及皮下組織,暴露右側頸總動脈、頸外動脈和頸內動脈,結扎頸總動脈、頸外動脈,經切口插入制備好的栓線,經過頸總動脈分叉處、頸內動脈進入顱底至較細的大腦前動脈,阻斷頸內動脈、大腦前動脈及大腦后動脈血流供應,固定線栓后逐層縫合皮膚,回籠飼養。假手術組僅給予假手術而不進行線栓栓塞及結扎。按照 Zea-longa 5級評分法〔12〕對造模大鼠進行評分,選取評分為 1～3 分的造模大鼠作為成功的模型大鼠。最后大鼠造模組共成功45只,假手術組成功15只。

1.4.2缺血性腦卒中大鼠模型的分組與治療〔6～8〕將造模成功的大鼠隨機分為麝針組、針刺組、模型組,每組15只,另取假手術組15只。

1.4.3神經運動功能評價 通過平衡木實驗〔13〕來檢測大鼠的運動功能。平衡木長 100 cm,寬2 cm,高80 cm,兩端各有一平臺,大鼠放置在平衡木上,觀察120 s,根據大鼠在平衡木上表現評分,得分越高說明平衡能力越差。于治療前和每個療程后每組隨機取6只大鼠測試。

1.4.4酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測血漿中 HIF-1α、VEGF含量 取備測血漿,室溫復溶后采用ELISA檢測血漿中 HIF-1α、VEGF含量,具體操作按照試劑盒進行。

1.4.5Western印跡檢測海馬組織中VEGFR2和Src蛋白表達 取備測蛋白樣品,室溫復溶后采用Western印跡檢測VEGFR2和Src蛋含量,具體操作按照試劑盒進行。

1.5統計學處理 采用SPSS20.0軟件進行t檢驗、方差分析,兩兩比較采用LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1各組運動功能恢復情況 治療前,與假手術組比較,模型組、麝針組、針刺組運動功能皆顯著下降且各組間無明顯差異(P<0.05);經過治療后,隨著療程增加,各造模組平衡木測試評分不同程度降低(P<0.05),且麝針組運動功能恢復更明顯(P<0.05)。見表1。

表1 不同療程各組平衡木測試評分分)

2.2各組血漿中HIF-1α、VEGF的含量 治療前,與假手術組相比,各造模組血漿中HIF-1α、VEGF含量顯著升高(P<0.05),且各造模組無顯著差異(P>0.05)。經過3個療程治療后,各造模組血漿中HIF-1α、VEGF含量較治療前明顯升高(P<0.05);與模型組比較,麝針組及針刺組血漿中HIF-1α、VEGF含量均顯著升高(均P<0.05)。見表2。

表2 各組血漿HIF-1α、VEGF含量及海馬VEGFR2、Src蛋白表達

2.3海馬組織中VEGFR2、Src蛋白表達的變化 治療3個療程后,與假手術組相比,模型組、針刺組和麝針組VEGFR2、Src蛋白相對表達量均顯著升高且各組間差異顯著(P<0.05)。與模型組比較,針刺組和麝針組海馬中VEGFR2蛋白表達量明顯升高,麝針組Src蛋白表達量明顯降低(均P<0.05),與針刺組比較,麝針組海馬中VEGFR2蛋白表達量顯著升高,Src蛋白表達量明顯降低(均P<0.05)。見表2、圖2。

圖2 各組海馬組織中VEGFR2、Src蛋白表達

3 討 論

缺血性腦卒中是臨床上常見的腦血管疾病,腦組織作為人體需氧量和需血量最高的器官,一旦由于腦血管狹窄或閉塞使腦血流阻斷而導致一過性的缺血或者缺氧,就極易引起腦組織缺血缺氧性軟化甚至壞死,進而能引起中樞神經系統大量神經細胞損傷,從而出現長期的神經功能障礙〔14～16〕。但現代研究〔17,18〕發現,腦損傷后神經功能具有一定自發恢復能力,可能與中樞神經系統損傷早期腦神經的可塑性有關。

缺血性腦卒中大鼠在缺血缺氧的情況下,HIF-1α 表達隨著腦組織缺氧加重而升高,而HIF-1α可以調控多個下游靶基因,其中VEGF作為最有效的血管生成因子之一,可以介導內皮細胞增殖,導致血管內皮細胞的增殖分裂與VEGFR2結合,使Src過度釋放,進而導致NOS的釋放改變,減少腦部因缺血缺氧所致的損傷,起到腦保護作用,從而達到改善缺血性腦卒中的目的。

本研究結果顯示,土家族麝針療法促進缺血大鼠運動功能的康復、改善腦部血流情況的作用可能是通過激活HIF-1α/VEGF信號通路實現的。