miR-630靶向Slug信號通路影響人腎癌細胞株侵襲、遷移的作用

孫偉 張煒 付橋 胡志 徐律 褚浩 王瀟

(武漢市第三醫院泌尿外科,湖北 武漢 430000)

腎癌是我國常見的一種泌尿系統惡性腫瘤。4.4/10.0萬是腎癌在全球范圍內的年齡標準化發病率,且近年來我國腎癌發病率和死亡率逐年上升,已成為嚴重的公共衛生問題〔1,2〕。目前腎癌的放化療效果均不佳,根治性腎切除手術僅針對局限性腎癌有效,晚期腎癌患者雖可采用藥物靶向治療,但因腎癌惡性程度高、進展速度快、治療復雜性高等特點導致治療總體預后差、療效不佳且死亡率高,同時腫瘤的復發和轉移嚴重威脅患者生命健康〔3,4〕。因此探索更高效的分子靶向治療藥物和腎癌侵襲轉移分子標記對于腎癌的治療具有重要意義。惡性腫瘤常伴隨上皮細胞-間充質轉化,在腫瘤的轉移和復發中發揮重要作用〔5〕。鋅指轉錄因子Slug是一種具有鋅指結構的上皮細胞-間充質轉化轉錄因子,作為E-鈣黏蛋白(cadherin)的抑制因子參與調控癌細胞侵襲和遷移〔6〕,研究發現藥物治療后下調Slug信號通路可抑制腎癌細胞侵襲和遷移〔7〕。微小核糖核酸(miR)-630參與調節腫瘤的發生與發展,據報道,miR-630過表達對食管癌細胞的侵襲和遷移有抑制作用〔8〕。然而又有研究指出,miR-630在腎癌中發揮促癌作用,抑制miR-630表達可抑制腎癌細胞侵襲和轉移〔9〕,且有臨床研究表明,miR-630在腎癌組織中的表達顯著高于正常組織,高表達miR-630與腎癌患者預后不良密切相關〔10〕。miR-630靶向Slug可抑制甲狀腺癌細胞侵襲能力〔11〕。但miR-630對腎癌細胞發展的影響是否與Slug信號通路相關還不明確。故本研究以腎癌ACHN細胞株為研究對象,對miR-630在腎癌ACHN細胞中的作用和靶點Slug信號通路進行了系統的分析和研究,旨在為腎癌臨床治療提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1實驗細胞與試劑 人腎癌細胞株ACHN,上海雅吉生物科技有限公司;攜帶miR-630 inhibitor(序列:5′-ACCUUCCCUGGUACAGAAUACU-3′)慢病毒、攜帶miR-630抑制劑陰性對照慢病毒(NC inhibitor,序列:5′-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3′)、miR-630 mimics陰性對照(NC mimics,正義鏈5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′,反義鏈5′-ACGUG ACACGUUCGGAGAATT-3′)、攜帶miR-630模擬物(miR-630 mimics,序列:正義鏈5′-AGUAUUCUGUACCAGGGAAGGU-3′,反義鏈5′-ACGUGACACG UUCGGAGAATT-3′)慢病毒、野生型和突變型Slug-3′非翻譯區(UTR)報告基因質粒(野生型pMIR-Report-Luc-Slug、突變型pMIR-Report-Luc-Slug),伊萊博生物科技(上海)有限公司;小鼠抗人E-cadherin(C1817)、N-cadherin(17-3904M)、Vimentin(ab97046)、Slug(ab27568)、磷酸脫氫酶(GAPDH)單克隆抗體(ab8245,一抗)、兔抗小鼠E-cadherin(ab76055)、N-cadherin(ab280375)、Vimentin(ab92547)、Slug(ab78105)、GAPDH辣根過氧化物酶標記多克隆抗體(LS-C66774,二抗),上海信帆生物科技有限公司;總RNA提取試劑盒(批號:15596026),美國Thermo;二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒(69-97682),武漢默沙克生物科技有限公司;E-cadherin、Vimentin、N-cadherin、Slug、miR-630和GAPDH聚合酶鏈反應(PCR)引物,圣克魯斯生物技術(上海)有限公司;侵襲小室(Transwell)板、基質膠(北京萌壯科技有限公司,生產批號:3421、356234);結晶紫(美國AMRESCO,生產批號:0528-500G);雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒(RG027),上海碧云天生物技術有限公司。

1.2儀器 XSP-GX8F熒光顯微鏡(上海光學儀器六廠);CKX53倒置顯微鏡(日本奧林巴斯);TG-16W型離心機(山東博科生物產業有限公司);JY02G型凝膠成像儀(北京海富達科技有限公司);GT100型熒光定量PCR儀(北京同洲維普科技有限公司);Quantity One4.5.6軟件(美國Bio-Rad公司);ImageJ軟件(美國國立衛生研究院);EnVision型多功能酶標儀(英國珀金埃爾默)。

1.3細胞培養傳代、轉染及分組 人腎癌ACHN細胞株在杜氏改良培養液(DMEM)培養,培養基中添加10%胎牛血清。細胞保存在含有5%CO2的37 ℃潮濕氣氛中。將對數期ACHN細胞接種到24孔板,待其達到80%融合時,分別轉染pGFP-hsa-NC inhibitor慢病毒、pGFP-hsa-miR-630 mimics慢病毒和pGFP-hsa-miR-630 inhibitor慢病毒,依次記為陰性對照組、過表達組、低表達組,以未轉染的ACHN細胞作為正常組,具體操作步驟依據慢病毒轉染說明書進行。轉染后48 h,各組ACHN細胞在熒光顯微鏡觀察轉染效率。

1.4Transwell小室實驗檢測各組細胞侵襲能力 轉染后的各組ACHN細胞繼續培養48 h,采用Transwell法檢測腎癌細胞株ACHN侵襲活性。細胞消化后,6 000 r/min(離心有效半徑為7 cm)離心5 min,用不含胎牛血清的DMEM重懸細胞,調整細胞濃度為5×105個/ml,將100 μl細胞懸液置于預鋪基質膠的Transwell小室上室,下室中添加含10%胎牛血清的培養基500 μl。孵育48 h后,細胞用4%多聚甲醛固定,再用0.5%結晶紫染色20 min,最后在倒置顯微鏡下計數穿膜細胞數。

1.5劃痕實驗檢測各組細胞遷移能力 轉染后各組細胞繼續培養48 h,采用劃痕實驗檢測各組細胞遷移活性。標記筆在6孔板背后每隔0.5 cm畫一道橫線,每孔至少穿過5條線。每孔加入約1×106個細胞。24 h后使用10 μl槍頭在單層細胞上劃痕,磷酸鹽緩沖液(PBS)沖掉劃下的細胞,加無血清RPMI1640培養液,37 ℃、5%CO2培養。在0、48 h時倒置顯微鏡拍照,應用Quantity One4.5.6軟件分析各組劃痕間距。

1.6實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-630表達及Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin mRNA表達 轉染后各組細胞繼續培養48 h,提取其總RNA,逆轉錄合成互補脫氧核糖核酸(cDNA)后進行PCR擴增。擴增條件:95 ℃,8 min;95 ℃,8 s;63 ℃,15 s;72 ℃,15 s;40個循環。采用2-ΔΔCt計算待測基因的相對表達量〔12〕。引物序列:miR-630上游引物5′-AACTTAACATCATGCTACCT-3′,下游5′-TATAGTTAAGAACTACCTT-3′;Slug上游引物5′-CCTGGTTGCTTCAAGGACAC-3′,下游5′-TCCATGCT CTTGCAGCTCTC-3′;E-cadherin上游引物5′-TTAAACTCCTGGCCTCAAGCAATC-3′,下游5′-TCCTAT CTTGGGCAAAGCAACTG-3′;N-cadherin上游引物5′-GTGCCATTAGCCAAGGGAATTCAGC-3′,下游5′-GCGTTCCTGTTCCACTCATAGGAGG-3′;Vimentin上游引物5′-TTGAACGCAAAGTGGAATC-3′,下游5′-AGGTCAGGCTTGGAAACA-3′;GAPDH上游引物5′-AGAAGGCTGGGGCTCATTTG-3′,下游5′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-3′。

1.7Western印跡法檢測各組Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達 細胞用冷PBS洗滌,在哺乳動物蛋白提取試劑RIPA緩沖液中溶解,并添加蛋白酶和磷酸酶抑制劑混合物。用BCA蛋白定量試劑盒對蛋白濃度進行定量,10 μg/μl為蛋白終濃度。每組4 μl蛋白加到上樣孔中進行電泳,轉膜,加入一抗(小鼠抗人Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、GAPDH單克隆抗體稀釋倍數分別為1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶1 000、1∶500),4 ℃孵育過夜,室溫下孵育兔抗小鼠E-cadherin、Slug、N-cadherin、Vimentin、GAPDH二抗(稀釋倍數分別為:1∶500、1∶500、1∶1 000、1∶2 000、1∶500)后,顯影反應,采用凝膠成像儀拍照,ImageJ軟件分析蛋白印跡灰度值。

1.8雙熒光素酶報告基因檢測驗證miR-630是否靶向Slug信號通路 利用TargetScan8.0數據庫〔13〕檢測miR-630靶基因。將腎癌細胞株ACHN接種至96孔板中,待細胞融合度達到80%時進行質粒轉染,將0.1 μg/孔野生型pMIR-Report-Luc-Slug報告基因質粒和20 nmol/L miR-630 mimics共轉染至腎癌細胞株ACHN,同樣將0.1 μg/孔突變型pMIR-Report-Luc-Slug報告基因質粒和20 nmol/L miR-630 mimics共轉染至腎癌細胞株ACHN。同時分別設置野生型pMIR-Report-Luc-Slug質粒和NC mimics共轉染組、突變型pMIR-Report-Luc-Slug質粒和NC mimics共轉染組為對照。轉染48 h后,PBS洗滌細胞,加入裂解液緩沖液裂解細胞,多功能酶標儀測量熒光強度。結果以螢火蟲熒光素酶與海腎熒光素酶熒光強度的比值表示。

1.9統計學分析 采用SPSS23.0軟件進行方差分析和SNK-q檢驗。

2 結 果

2.1各組ACHN細胞轉染效率 轉染成功細胞在熒光顯微鏡下為綠色熒光,未轉染成功細胞在熒光顯微鏡下無熒光。陰性對照組、過表達組和低表達組的轉染效率依次為(87.39±17.36)%、(86.11±17.01)%、(85.43±16.98)%,各組間轉染效率差異無統計學意義(P>0.05)。見圖1。

圖1 各組腎癌ACHN細胞株轉染后熒光(×200)

2.2各組細胞侵襲能力 與陰性對照組、正常組比較,過表達組穿膜細胞數量明顯升高(P<0.05);與陰性對照組、正常組和過表達組比較,低表達組穿膜細胞數量明顯降低(P<0.05)。見圖2、表1。

表1 各組miR-630 mRNA及穿膜細胞數、劃痕間距比較

圖2 各組細胞侵襲能力Transwell小室實驗結果(結晶紫染色,×100)

2.3各組ACHN細胞遷移能力 48 h時,與陰性對照組、正常組比較,過表達組劃痕間距明顯減小(P<0.05);與正常組、陰性對照組和過表達組比較,低表達組劃痕間距明顯增加(P<0.05)。見表1、圖3。

圖3 各組細胞劃痕實驗(×100)

2.4各組ACHN細胞miR-630、Slug、N-cadherin、E-cadherin和Vimentin mRNA表達比較 與陰性對照組、正常組比較,過表達組miR-630、Vimentin和N-cadherin mRNA表達顯著增高,E-cadherin和Slug表達顯著降低(P<0.05);與陰性對照組、正常組和過表達組比較,低表達組miR-630、N-cadherin和Vimentin mRNA表達顯著降低,E-cadherin和Slug mRNA表達顯著增高(P<0.05)。見表1、表2。

表2 各組Slug、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin mRNA及蛋白表達比較

2.5各組ACHN細胞Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達比較 與陰性對照組和正常組比較,過表達組Vimentin和N-cadherin蛋白表達明顯增高,E-cadherin和Slug蛋白表達明顯降低(P<0.05);與陰性對照組、正常組和過表達組比較,低表達組Vimentin和N-cadherin表達明顯降低,E-cadherin和Slug表達明顯增高(P<0.05)。見表2、圖4。

圖4 各組Slug、E-cadherin、N-cadherin和Vimentin蛋白表達

2.6miR-630靶向Slug信號通路驗證 miRNA靶基因預測Slug為miR-630潛在靶基因。miR-630與Slug的3′UTR區堿基互補配對序列見圖5。在轉染野生型pMIR-Report-Luc-Slug質粒細胞中,miR-630 mimics組相對熒光強度比NC mimins組明顯低(P<0.001);miR-630 mimics組與NC mimins組相比,轉染突變型pMIR-Report-Luc-Slug質粒細胞相對熒光強度差異無統計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 雙熒光素酶報告基因檢測結果

圖5 miR-630與其潛在靶基因Slug-3′UTR堿基互補序列

3 討 論

腎癌的發病誘因包含遺傳易感性或遺傳性疾病、肥胖、吸煙、各種對腎臟有毒的工業化學品、藥物和天然或人造放射性〔14〕。目前腎癌手術治療多選擇根治性腎切除,對于早期患者而言大多可痊愈,但腎癌初始階段很難診斷,通常發現時已經處于晚期,因此手術治療具有很大局限性;對于晚期腎癌患者通常使用藥物治療,盡管目前臨床已出現大量靶向藥物,但治療效果有限,5年生存率僅12%,且存在腎功能不全、腎衰竭等后遺癥、治療周期長等問題〔15,16〕。因此探索針對腎癌治療的關鍵靶點,尋找更高效、更特異的藥物對于腎癌的治療至關重要。

以往癌癥報道顯示,miR-630功能具有多向性,在不同細胞環境中發揮不同作用,王青安子等〔17〕指出,miR-630可抑制子宮內膜癌細胞侵襲和遷移,發揮抑癌作用;但王智宇等〔18〕指出,miR-630可促進膀胱尿路上皮癌細胞侵襲和轉移,發揮促癌作用;趙建軍〔19〕指出,miR-630在腎癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織,且在腎癌細胞系ACHN中表達水平高于腎小管上皮細胞系,抑制miR-630表達可抑制腎癌細胞生長并促進其凋亡。本研究結果證明,miR-630可提高腎癌細胞侵襲和遷移能力。Cui等〔20〕指出,miR-630過表達通過激活核轉錄因子(NF)-κB通路促進卵巢癌細胞侵襲和轉移,而Chen等〔21〕指出,miR-489-3p和miR-630協同作用靶向有機陽離子轉運蛋白2發揮抑制腎癌作用,提示miR-630在腎癌中可能參與調節多個信號通路,不同信號通路組成網絡、相互作用,共同調節細胞行為,而本研究中miR-630的促癌作用占主導地位,因此發揮促癌作用。

上皮細胞-間充質轉化在癌癥轉移過程中發揮重要作用,研究表明抑制肺癌上皮細胞-間充質轉化可抑制癌細胞遷移、侵襲〔22〕。Slug是E-cadherin的抑制因子,N-cadherin和Vimentin共同調控惡性腫瘤中上皮細胞-間充質轉化,調控腫瘤細胞的侵襲和轉移。本實驗結果提示,miR-630可能是通過靶向調控Slug促進腎癌上皮細胞-間充質轉化發揮促癌作用。李建新等〔23〕指出,miRNA-3915靶向抑制Slug信號通路可抑制腎癌細胞侵襲和遷移作用;馮頂威等〔24〕指出,在肺癌中促進N-cadherin和Vimentin表達,抑制E-cadherin表達,可促進肺癌細胞上皮細胞-間充質轉化、促進肺癌細胞遷徙和侵襲。本研究與前述Slug相關研究結果相反,與N-cadherin、E-cadherin和Vimentin相關研究結果一致。Chen等〔25〕指出,肝癌細胞中miR-630靶向Slug抑制肝癌細胞轉移,本研究結果與該研究結果相反,首次證實miR-630可通過靶向Slug信號通路促進腎癌轉移。

綜上,miR-630可能通過調節Slug信號通路,抑制E-cadherin表達,促進N-cadherin和Vimentin表達發揮促進腎癌細胞侵襲和遷移作用。本研究初步闡釋了miR-630對人腎癌細胞株侵襲和遷移的作用和機制,為臨床治療腎癌分子靶向藥物的研發提供了實驗依據。