針刺治療通過抑制細胞凋亡改善缺血性腦卒中療效及其機制

王記委 李雁冰 李娜 李夢迪 郭敏芳 孟濤 馬存根 尉杰忠,3

(1山西中醫藥大學神經生物學研究中心 國家中醫藥管理局益氣活血法治療多發性硬化重點研究室,山西 晉中 030619;2山西大同大學腦科學研究所;3大同市第五人民醫院)

缺血性腦卒中(CIS)是一種常見的中樞神經系統疾病,占所有腦血管病例的 70%～80%〔1〕,是世界范圍內第二大常見死因和長期殘疾的主要原因〔2〕,也是導致癡呆癥的第二常見原因。由于人口老齡化及糖尿病、肥胖等發病率的增加等原因,預計在未來幾十年內CIS的發病率將增加〔3〕。因此,CIS被認為在全球的疾病負擔會持續加大,但目前的藥物療法在實用性和有效性方面仍受到限制〔4〕,而且缺血損傷的組織在血流恢復后難以得到有效的改善,反而可能加重損傷。雖然機械取栓可顯著改善腦缺血再灌注損傷(CIRI),但CIS患者因缺血導致長期預后較差而療效欠佳〔5〕。作為其主要致病因素,遲發性神經元死亡是影響預后的非常關鍵的因素,而稱為程序性死亡的神經細胞凋亡被廣泛認為是其主要途徑〔6〕。

針灸療法通過刺激經絡穴位,激活人體內的自我調節機制,改善缺血后神經功能,在臨床上有較好的效果〔7〕。目前常用的針刺療法分為針法治療和電針治療。針法是指運用中醫的傳統思維方法,根據辨證論治的理論把針具按照不同的方式刺入患者身體,再利用其不同的操作手法如捻轉、提插和振動等進行刺激的方式達到治療疾病的目的。而電針療法則是通過將針插入穴位,之后通過一定的電流刺激以達到治療效果〔8〕。本文主要收集近年來通過針刺的方法治療CIS,并探討其抑制細胞凋亡的機制的文章,進行綜述。

1 細胞凋亡與CIS

1.1細胞凋亡 細胞凋亡是指伴隨著細胞內組織的變化所導致的體積逐漸減少、細胞核的碎裂和染色質的縮小從而使細胞失去活性。這種特殊的細胞死亡是細胞最基本的死亡方式之一,在正常生理狀態下通過激活基因編碼的自殺程序來為機體去除不必要或潛在有害的細胞〔9〕。細胞凋亡是細胞的一種調節程序,在生物體發育和生長過程中具有重要的作用。盡管在癌癥或自身免疫狀態下會發生細胞凋亡不足,但在退行性疾病、免疫缺陷和不孕癥中,細胞凋亡加速〔10〕。所以雖然細胞凋亡的發生必不可少,但是凋亡不足或者過多都會導致疾病的發生。細胞凋亡主要有兩種途徑:一是內在途徑,也稱為線粒體途徑,B細胞淋巴瘤(Bcl)-2家族促凋亡蛋白(Bak/Bax)的寡聚化激活。Bak/Bax低聚物在線粒體外膜形成孔,導致細胞色素(Cyt)C釋放到細胞質中。Bak/Bax的活化由Bcl-2家族促凋亡〔如Bcl-2相關啟動子(Bad)和BH3結構域凋亡誘導蛋白(Bid)〕或抗凋亡(如Bcl-2)Bcl-2家族蛋白調節〔11〕。CytC與凋亡酶激活因子(Apaf)-1結合,Apaf-1募集半胱天冬酶(Caspase)-9前體,形成細胞凋亡體。在細胞凋亡體中,Caspase-9被自體蛋白水解切割激活,啟動Caspase處理級聯反應〔12,13〕。二是外在途徑,又被稱為受體為媒介傳導的途徑,通過膜受體的參與激活,例如腫瘤壞死因子受體(TNFR)1、死亡受體或 Toll 樣受體(TLR)。這些蛋白質誘導涉及TNFR1相關死亡結構域蛋白(TRADD)或自殺相關因子(Fas)受體相關死亡結構域蛋白(FADD),受體相互作用導致絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(RIPK)1和pro-Caspase-8的信號復合物的形成〔14〕。細胞凋亡抑制劑(cIAPs)對RIPK1的泛素化穩定了復合物并誘導轉錄因子核因子(NF)-κB的活化,死亡誘導信號復合體(DISC)中的凋亡抑制蛋白限制Caspase-8活性,同時促進細胞存活,細胞增殖和促炎細胞因子的產生。該途徑中的不平衡,例如細胞應激施加的不平衡,允許Caspase-8和Caspase-10的激活,這反過來又觸發了Caspase激活級聯反應。一旦激活,Caspase(即Caspase-2,-6,-8和-10)會導致程序性凋亡死亡〔15,16〕。

1.2細胞凋亡與腦缺血之間的關系 臨床上,CIS主要是由于大腦內動脈堵塞之后,腦細胞缺血缺氧使細胞發生凋亡或壞死〔17〕。與此同時,神經元的血液供應被破壞,隨后促進一連串的病理生理反應,導致細胞損失。多種機制單獨或聯合參與這種疾病,包括興奮性毒性、線粒體死亡途徑,自由基釋放,蛋白質錯誤折疊,氧化應激、細胞凋亡,鈣超載、壞死,自噬和炎癥等〔18,19〕。腦細胞缺血缺氧后激活相關凋亡基因的表達,通過相關途徑使神經細胞發生凋亡〔20〕。在腦缺血的治療過程中主要分為兩種,一種為神經保護,防止受損神經元在腦缺血急性期死亡,另一種為干細胞療法,理論上可以在腦缺血的慢性期用新生神經元/神經膠質細胞修復斷裂的神經元網絡〔21〕。又知神經元凋亡是腦梗死的重要表現,提示可能是由凋亡相關因子的調節誘導的腦缺血治療中,使用治療措施抑制凋亡信號通路c-Jun氨基末端激酶(JNK)、磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)/雷帕霉素機械靶蛋白(mTOR)、非受體蛋白酪氨酸激酶(JAK)/信號轉導與轉錄激活因子(STAT)等〔22〕,調控下游凋亡分子(Bcl-2家族、Caspase家族、Fas受體等)的表達,從而保護神經達到治療效果〔23〕。活性氧(ROS)是完整細胞中線粒體損傷后所誘導的重要物質〔24〕,也是CIRI引起的氧化應激產物。為了應對缺氧,低氧誘導因子-1(主要是在細胞內氧氣濃度不足對其調控的相關因子)被ROS激活可誘導自噬〔25〕,并導致細胞凋亡。所以,也可以通過調節線粒體功能障礙和抑制氧化應激來抑制細胞凋亡〔26〕。

2 針刺治療CIS的機制與療效

臨床試驗表明,針灸可以增強平衡〔27〕,減少痙攣,增加肌肉力量,促進中樞神經系統駐留細胞的增殖,通過血管生成和調節血管活性介質調節腦血流量,通過直接干預內在和外在途徑或相關途徑來抗細胞凋亡,調節缺血級聯反應中涉及的神經化學物質,增強和恢復海馬記憶和學習過程〔28〕。有研究表明針康法通過調節細胞凋亡抑制蛋白1的表達,抑制Caspase-9、Caspase-8和Caspase-3活化,降低腦缺血大鼠缺血半暗區神經元凋亡,減少細胞凋亡數量〔29〕。針灸還可以減少腦缺血/再灌注后的炎癥反應,并促進損傷神經系統的修復〔30〕,激活軸突再生和發芽,改善突觸的結構和功能。臨床得出電針(EA)聯合跑臺訓練改善局灶性腦缺血大鼠神經功能缺損,抑制炎癥反應,使神經功能改善〔31〕。這些過程修改了受損大腦區域的神經網絡和功能,從而提高了各種技能和適應性〔32〕。有研究表明通過調節一系列參與氧化還原調節的分子信號通路,針灸不僅可以激活固有的抗氧化酶系統,還可以抑制ROS的過度生成。針灸療法緩解了腦缺血引起的氧化應激,與針灸的神經保護作用密切相關〔33〕。

3 針刺抑制CIS細胞凋亡的機制

細胞凋亡在腦缺血過程中非常重要,而內源性和外源性又是細胞凋亡的主要原因。見圖1。

圖1 細胞內源性及外源性凋亡

3.1通過Bcl-2家族抑制細胞凋亡 Bcl-2蛋白家族通過控制線粒體凋亡來控制細胞是死是活。哺乳動物Bcl-2家族由20多個成員組成,這些成分根據它們在β-螺旋區域中的Bcl-2同源結構域及它們在細胞凋亡過程中的功能進行分類。其中抗凋亡成員如Bcl-xL、Bcl-w或Bcl-2,通過阻止與促凋亡蛋白(Bim、Bak或Bax)成員相關的電壓依賴性陰離子通道的開放或通過抑制促凋亡形成的分子開口組裝來抑制細胞凋亡〔34〕,抗凋亡成員和促凋亡成員間的微妙平衡決定了細胞的生死,因此靶向Bcl-2蛋白家族內的蛋白質-蛋白質相互作用是控制細胞凋亡的關鍵策略〔35〕。

所有Bcl-2家族成員都不同程度地擁有一個或多個Bcl-2同源結構域,允許與各種促細胞凋亡蛋白相互作用,具有阻止細胞凋亡的能力。Bcl-2和密切相關的Bcl-xl和Mcl-1可以保護細胞免受各種可能導致凋亡的刺激,包括輻射、生長因子戒斷和化學療法。而Bax、Bak和Bim作為促凋亡蛋白,和Bcl-2相似,包含三個結構域,在促進細胞凋亡方面效果顯著〔36〕。故可知調節抗凋亡與促凋亡的意義非常重大。EA不同的經絡穴位刺激可以導致大鼠心及腦組織細胞一定程度的凋亡指數減少,心、腦組織Bcl-2蛋白增加,Bax減少,從而抑制了細胞凋亡,使細胞存活〔37〕。有研究表明使用EA刺激水溝治療腦缺血,抗凋亡Bcl-2蛋白明顯增高〔38〕。又有研究證明利用ST36(足三里)在缺血前多次進行EA刺激可以有效地增加轉化生長因子-β1和Bcl-2的產生,這些蛋白質共同作用以減少CIRI后腦組織損傷的程度,此外,轉化生長因子-β1還能通過調節凋亡級聯反應促進具有神經保護作用的蛋白質對抗預期的氧化應激〔39〕。EA刺激百會和神庭可能會誘導Bcl-2 mRNA的過表達并抑制Bax發揮其抗凋亡作用,保護神經元免受損傷,因此EA通過調節Bcl-2家族的表達來改善CIRI的療效是確定的〔40〕。

3.2通過Caspase家族抑制細胞凋亡 Caspase是一種在進化上較為保守的半胱氨酸依賴性內切蛋白酶分子,細胞凋亡過程中Caspase作為起始者激活相關Caspase執行,隨后協調它們的活動,以破壞關鍵的結構蛋白并激活其他酶〔41〕。此外,有文獻發現了炎癥性Caspase還具有能促進細胞焦亡的機制,這是另一種不同的裂解細胞死亡模式,與炎性細胞因子白細胞介素(IL)-1β和 IL-18 的分泌有一定的關系〔42〕。Caspase 是一種IL-1β 轉換酶家族蛋白酶,到目前為止已經被發現存在有 14 種Caspase,它們都有一些共同的特性并且都是天冬氨酸特異性的Caspase〔43〕,它們對體內神經元凋亡的任何影響可能是通過它們對炎癥反應的調節間接導致的,既可以作為凋亡刺激的初始傳感器,也可以作為死亡的最終劊子手。其中Caspase-1和Caspase-11主要參與促炎細胞因子的加工,Caspase-3 和 Caspase-9 對大腦的發育過程中細胞凋亡有很重要的影響。Caspase 8 是對于造血譜系細胞增殖、心肌的發育和死亡受體介導的細胞凋亡至關重要,因此確定哪些Caspase在腦中表達和激活將顯著闡明細胞凋亡在針刺治療腦缺血中的作用。研究表明,Caspase在細胞信號轉導事件中發揮作用,包括細胞凋亡、細胞生長和分化〔44〕。在研究中,EA外關和足三里穴位,可以通過抑制NOD樣受體蛋白結構域相關蛋白(NLRP)3誘導的Caspase-1激活來減少細胞凋亡,從而降低神經元的損傷〔45〕。使用百會和水溝,Caspase-9陽性細胞顯著減少,減少其過度表達,防止了高血脂腦缺血的損傷〔46〕。利用電針“合谷”“尺澤”“足三里”“三陰交”,使腦缺血再灌注后細胞凋亡指數及腦梗死體積百分比降低,改善了神經功能,其機制與Caspase-3表達減少相關〔47〕。又有電針預處理百會可以通過降低Caspase-3蛋白的表達減少缺血再灌注損傷后的神經元凋亡〔48〕。

3.3通過Fas受體 TNF和神經生長因子受體家族的成員Fas是屬于死亡受體家族的膜蛋白。由Caspase激活介導,通過其配體FasL或激動性抗Fas抗體并交聯Fas,攜帶跨膜受體Fas的細胞在結合表達FasL細胞后可以迅速發生程序性細胞死亡〔49,50〕。通常地表達或沒有Fas抗原的細胞表面上Fas的上調可能會發生在許多病理情況下,通過Fas/FasL途徑導致細胞死亡。細胞毒性藥物(特別是已知會導致DNA損傷且目前用于治療的藥物)誘導細胞中Fas 表達增強,表明使用藥物/抗 Fas 組合可以進行有效治療〔51〕。通過電針刺激百會(DU20)和神庭(DU24)顯著下調了促凋亡Bax和Fas的表達,緩解了腦缺血大鼠的細胞損傷。又有利用眼針治療腦卒中發現Fas的含量降低,從而抑制細胞凋亡,達到治療腦卒中的作用〔52〕。

3.4內質網(ER)應激 由外源性或內源性因素觸發的ER蛋白折疊的消亡,刺激細胞應激反應,稱為ER應激。在嚴重毒性或長期存在ER應激的情況下,ER應激通過稱為ER未折疊蛋白質反應,將致命的信號傳輸到線,而線粒體是凋亡和自噬細胞死亡的關鍵,因此,ER在感知和協調應激途徑并維持整體生理穩態方面至關重要〔53〕,并通過這些調節細胞凋亡。來自ER的信號通路參與由ER應激,癌基因表達,死亡受體連接和氧化應激等多種刺激引發細胞凋亡〔54〕。針刺可以通過蛋白激酶R樣ER激酶(PERK)、肌醇依賴性激酶(IRE)1和激活轉錄因子(ATF)-6通路抑制中腦動脈栓塞誘導的ER應激,導致細胞凋亡受到影響。此外,4-苯基丁酸鈉鹽抑制ER應激可進一步抑制自噬和細胞凋亡,從而加強針刺的保護作用〔55〕。CIRI后大鼠大腦中ER發生應激反應,在它當中存在的ATF-6及IRE1兩個凋亡通路開始活化并隨之促進細胞凋亡,使用EA結合腦內注射藥物,發現了其能通過抑制ER應激相關蛋白IRE1、和ATF-6的表達,從而抑制IRE1及ATF-6凋亡通路來實現降低細胞凋亡〔56〕。

3.5CytC的釋放 線粒體對生命至關重要。它們位于細胞代謝的核心,通過氧化磷酸化在三磷酸腺苷(ATP)生成中發揮關鍵作用〔57〕。而CytC在為細胞的命運做出生死攸關的決定中起著關鍵作用。它是一種小球狀、高度保守的有104個氨基酸組成的蛋白質,具有共價連接的血紅素基團,具有多種功能和催化活性〔58〕。在線粒體內膜中,存在于內的CytC在線粒體電子傳輸鏈有密切關系,使用其血紅素基團作為氧化還原的中間產物在復合物Ⅲ和復合物Ⅳ之間穿梭電子。當細胞檢測到凋亡遭受到刺激時,例如DNA損傷、未折疊蛋白或代謝應激的存在,內在的凋亡途徑開始被激活〔59〕在細胞應激作用下,CytC被線粒體所釋放是細胞凋亡的關鍵一步,在脫氧ATP和ATP共同存在的條件中與細胞凋亡蛋白酶活化因子1相互作用,并且當CytC從線粒體中釋放到胞質溶膠當中,蛋白凋亡蛋白酶激活因子-1就會與其發生相互作用,從而導致凋亡體的形成,通過Caspase的特定方式收集Caspase-9前體,然后促進其裂解成活性形式,隨后通過多米諾反應導致了下游Caspase活化,使線粒體不能避免地發生了凋亡,最后使細胞開始死亡〔60〕。CytC被證明是細胞信號通路的靶點,通過組織特異性磷酸化調節CytC的功能。但根據現有文獻針刺下調CytC表達,對它的抑制作用不明顯,途徑可能不是針刺抑制新生大鼠神經細胞凋亡作用的通路。由于針刺治療這方面的文章較少,具體是否可以作為抑制細胞凋亡的途徑,有待進一步實驗觀察。

綜上所述,針刺在治療CIRI的過程中抑制細胞凋亡是具有治療效果的,并且使用針刺治療不僅對機體損害較小,而且效果顯著,在凋亡的途徑當中,內源性,外源性和其他通路方面的研究均有不錯的成果,而且細胞凋亡對于氧化應激和炎癥反應等都有一定的相互作用,但作為治療方向,依然需要進一步研究,在一些凋亡通路方面的研究針刺的文獻較少作用靶點不太清楚,例如CytC,但以現有在其他通路方面的現有文獻來看其對于治療CIRI有確定的療效。希望在針刺治療腦缺血方面有更深入的研究。