不同來源外泌體對骨骼發(fā)育及骨骼疾病的影響

劉新新,周恩友,安智遠(yuǎn),蔡春霞,張露潔,李建增,李轉(zhuǎn)見,閆峰賓,康相濤,高延玲,韓瑞麗*

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院,鄭州 450046;2.神農(nóng)種業(yè)實驗室,鄭州 450002;3.河南農(nóng)業(yè)職業(yè)學(xué)院,鄭州 451450)

骨骼是人和動物運(yùn)動系統(tǒng)重要的構(gòu)成部分,是機(jī)體堅硬的支撐結(jié)構(gòu)。骨骼系統(tǒng)具有支撐軀體、保護(hù)內(nèi)臟器官、供肌肉附著和作運(yùn)動的杠桿等作用,同時骨也是鈣和磷的儲存場所[1],且紅骨髓在成體動物的身體中還能制造血細(xì)胞。骨的形成和發(fā)育同時進(jìn)行,在骨的形成發(fā)育過程中,外界機(jī)械因素、營養(yǎng)因素、病理因素及遺傳性[2]等都可能會引起骨代謝紊亂,導(dǎo)致骨代謝疾病的發(fā)生。骨骼疾病是多種骨與關(guān)節(jié)病的一個總稱,臨床常見的有骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)、骨關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis,OA)、股骨頭壞死(osteonecrosis of the femoral head,ONFH)、脛骨軟骨發(fā)育不良(tibial dyschondroplasia,TD)和肢體內(nèi)外翻畸形(valgus-varus deformity,VVD)等。在畜禽生長過程中,骨骼疾病尤其是腿部骨骼疾病不僅造成骨強(qiáng)度和骨密度的降低,還會影響采食、飲水等基本行為,導(dǎo)致機(jī)能及生長性能水平顯著下降[3],進(jìn)而影響動物福利和經(jīng)濟(jì)效益。

細(xì)胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)包括外泌體、微囊泡和凋亡小體,幾乎由所有類型的細(xì)胞產(chǎn)生和釋放。EVs的大小、性質(zhì)和分泌途徑取決于原始細(xì)胞[4],不同細(xì)胞來源發(fā)揮的功能也不同。其中,外泌體(exosome,exo)的脂質(zhì)雙層膜結(jié)構(gòu)可以使其內(nèi)容物免受溶酶體降解,從而可以在相鄰和遠(yuǎn)端細(xì)胞之間傳遞蛋白質(zhì)和遺傳信息。

外泌體來源廣泛,一方面,它可由多種細(xì)胞產(chǎn)生,如間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)[5]、巨噬細(xì)胞[6]、內(nèi)皮細(xì)胞[7]、免疫細(xì)胞[8]、樹突狀細(xì)胞[9];另一方面,外泌體幾乎存在于所有體液中,如血漿[10]、尿液[11]、腹水[12]、乳汁[13]、精漿[14]等都能檢測到外泌體的存在。外泌體也因來源廣泛、更穩(wěn)定、易保存、可人為調(diào)節(jié)用量等優(yōu)點(diǎn),攜帶miRNA通過旁分泌的形式,介導(dǎo)某些信號通路的表達(dá),進(jìn)而調(diào)控骨代謝以及參與骨骼疾病的診斷與治療。

外泌體中包裹的含有與細(xì)胞來源相關(guān)的蛋白質(zhì)、mRNA和非編碼RNA(miRNAs、lncRNAs、circRNAs)等,其內(nèi)含物的種類和數(shù)目由遺傳基因和所處的內(nèi)環(huán)境兩方面決定。外泌體被釋放后主要通過旁分泌的方式以受體細(xì)胞內(nèi)吞、受體-配體介導(dǎo)的胞吐以及與受體細(xì)胞膜融合這3種形式將內(nèi)容物exomiRs釋放作用于受體細(xì)胞,進(jìn)入受體細(xì)胞的exomiRs與mRNA靶基因結(jié)合,從而調(diào)控靶基因的降解或抑制其翻譯過程[15],進(jìn)而參與相關(guān)疾病的發(fā)生與治療。有報道,外泌體也是“無細(xì)胞”再生醫(yī)學(xué)關(guān)注的熱點(diǎn)[16]。

1 外泌體的結(jié)構(gòu)和功能

外泌體,單層膜,是一類直徑在40～160 nm之間胞內(nèi)形成的微小囊狀結(jié)構(gòu),由細(xì)胞膜雙層內(nèi)陷形成胞內(nèi)多泡體(multivesicular bodies,MVBs),成熟的MVBs與細(xì)胞膜融合,將囊泡釋放到胞外形成外泌體[17]。可通過細(xì)胞外刺激、微生物攻擊和其他應(yīng)激條件的誘導(dǎo)而產(chǎn)生,其含有細(xì)胞特異的蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、miRNA和lncRNA等這些物質(zhì)可以作為信號分子參與細(xì)胞間的信息傳遞。外泌體本身具有高度異質(zhì)性,且其異質(zhì)性根據(jù)其大小、含量(載物)、對受體細(xì)胞的功能影響以及細(xì)胞來源會出現(xiàn)差異,具備不同的功能。隨著外泌體研究的不斷深入,已不僅僅限于各種腫瘤疾病的診斷與治療、臨床藥物遞送載體以及醫(yī)學(xué)美容等領(lǐng)域[18-20],同時在骨骼系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)等疾病中有廣泛應(yīng)用。近年來研究發(fā)現(xiàn),外泌體具有良好的骨特異性和強(qiáng)大的骨再生能力使得其擁有潛在治療價值,可增強(qiáng)骨骼的生長發(fā)育和治療臨床骨疾病[21]。以下將介紹不同來源的外泌體對骨骼生長發(fā)育以及骨骼疾病中的影響。

2 細(xì)胞來源的外泌體在骨骼發(fā)育與骨骼疾病中的應(yīng)用

2.1 間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs)是一類具有自我更新、再生、分化和修復(fù)功能,有多種來源的多能基質(zhì)干細(xì)胞,其再生潛力及其免疫調(diào)節(jié)能力在骨損傷的修復(fù)和治療中顯示出巨大的前景[22]。常見的MSCs一般是從骨髓、脂肪、臍帶、臍血等組織提取,并具有很好的離體增殖能力、自我更新及多向分化能力,因此常用間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體作為載體(如包裹藥物)或攜載miRNA、蛋白質(zhì)等來探究外泌體及內(nèi)容物在骨骼發(fā)育及骨骼疾病中的診療機(jī)制。有研究發(fā)現(xiàn),MSCs外泌體含有無活性的糖酵解酶和產(chǎn)ATP的酶,這些酶似乎可通過外泌體的轉(zhuǎn)移來補(bǔ)償人OA中線粒體功能障礙,提高軟骨缺損修復(fù)能力,使軟骨再生[23]。

2.1.1 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)除具有間充質(zhì)干細(xì)胞的功能外,還可以分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、脂肪生成譜系等,促進(jìn)骨形成和骨再生[24]。BMSCs是新骨形成的關(guān)鍵成分,BMSCs的成骨分化過程受多個信號通路和基因的調(diào)節(jié),可以通過其細(xì)胞來源的外泌體轉(zhuǎn)運(yùn)miRNA調(diào)控靶基因表達(dá),介導(dǎo)成骨通路參與一些骨病的發(fā)生與治療。研究發(fā)現(xiàn),BMSCs的外泌體運(yùn)輸miR-424-5p通過調(diào)節(jié)WIF1介導(dǎo)的wnt/β-catenin軸減弱成骨,從而過表達(dá)WIF1部分逆轉(zhuǎn)BMSCs來源的外泌體在骨質(zhì)疏松癥患者中的成骨作用,即促進(jìn)成骨作用[25]。BMSCs來源的外泌體攜帶miR-935,通過靶向STAT1促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖和分化,從而減輕了大鼠的骨質(zhì)疏松癥癥狀[25]。有研究發(fā)現(xiàn),關(guān)節(jié)內(nèi)注射骨髓來源的間充質(zhì)干細(xì)胞可增強(qiáng)膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎的再生,而BMSCs通過旁分泌信號機(jī)制和可溶性營養(yǎng)因子(包括骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(BMP2)和胰島素樣生長因子-1(IGF1))的分泌促進(jìn)修復(fù)[26]。目前,畜禽BMSCs分離鑒定技術(shù)逐漸完善,也推動了從骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞本身到其來源的外泌體在畜禽骨骼生長發(fā)育與骨骼疾病尤其是腿部骨骼疾病中的研究。

2.1.2 脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體 骨骼和脂肪在功能上相互聯(lián)系,共同調(diào)節(jié)機(jī)體“骨-脂”代謝穩(wěn)定。最新研究表明,外泌體作為一種細(xì)胞外囊泡可攜帶多種生物活性分子,在“骨-脂肪 Crosstalk”(即骨與脂肪間存在交互作用的關(guān)系)中發(fā)揮關(guān)鍵調(diào)控作用[27]。脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose mesenchymal stem cells, ADSCs)是存在于脂肪組織中具有多向分化和自我更新能力的一種間充質(zhì)干細(xì)胞,相比于骨髓、血清、臍帶血等間充質(zhì)干細(xì)胞來源,ADSCs所分泌的外泌體因其具有來源豐富、提取便捷以及創(chuàng)傷較小等優(yōu)點(diǎn),已在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域受到了極大的關(guān)注[28]。ADSCs作為細(xì)胞治療和再生領(lǐng)域最有前途的工具之一,由其衍生的外泌體攜帶不同的蛋白質(zhì)和miRNAs等參與多種生物過程。或以旁分泌的形式釋放細(xì)胞因子等物質(zhì)促進(jìn)骨骼修復(fù),進(jìn)而預(yù)防和改善骨質(zhì)疏松等疾病[28-29]。此外,最新研究表明,ADSCs-exo與基因修飾技術(shù)和組織工程技術(shù)的結(jié)合,可增強(qiáng)成骨細(xì)胞活性以及加速骨的再生[30],為外泌體作為基因遞送載體的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ),極大地推動了ADSCs-exo在骨的生長發(fā)育與骨質(zhì)疏松等骨骼疾病治療中的應(yīng)用。

2.1.3 其他間充質(zhì)干細(xì)胞源性外泌體 除了骨髓和脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在骨骼系統(tǒng)上的較多應(yīng)用外,也有其他間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體被應(yīng)用,如臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells,UCMSCs)、滑膜間充質(zhì)干細(xì)胞(synovial mesenchymal stem cells,SMSCs)等。有研究發(fā)現(xiàn),UCMSCs(憑借其強(qiáng)大的自我更新和分化能力)已被證明對軟骨損傷有治療作用,前期發(fā)現(xiàn)lncRNA H19是介導(dǎo)臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體調(diào)控軟骨細(xì)胞活性的重要活性分子,并反向驗證了 H19-Exos 是通過 TGF-β1/Smad3 通路促進(jìn)軟骨細(xì)胞的增殖和再生[31]。以及SMSCs外泌體來源的長鏈非編碼RNA(lncRNA) SNHG14(SMSC-EXO-SNHG14)在骨關(guān)節(jié)炎(OA)中具有促進(jìn)軟骨合成和修復(fù)的潛在作用。不同來源外泌體的靶向性和功能可能有所不同,除干細(xì)胞來源外,也有研究證明,MSCs來源外泌體的骨靶向性要比成骨前體細(xì)胞(MC-3T3-E1)、乳腺癌細(xì)胞(4T1)和腎上皮細(xì)胞(293 T)的更強(qiáng),有更好的促組織修復(fù)能力,因此,MSCs來源的外泌體多用于骨代謝相關(guān)細(xì)胞的活性調(diào)控以及多種類型的組織修復(fù)與再生[32]。

2.2 非干細(xì)胞源性外泌體

間充質(zhì)干細(xì)胞靠本身強(qiáng)大的自我更新與分化能力被應(yīng)用于眾多領(lǐng)域。但此外,成骨細(xì)胞[33]、破骨細(xì)胞[34-35]、骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞[36]、巨噬細(xì)胞[37]、癌細(xì)胞[38]、內(nèi)皮細(xì)胞[39]等來源的外泌體也在骨的生長、修復(fù)和再生過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。有科學(xué)家發(fā)現(xiàn),不同細(xì)胞來源的外泌體在參與骨骼發(fā)育與骨損傷等生理病理過程時,其生理病理蛋白聚集物通過外泌體從組織細(xì)胞中釋放出來,進(jìn)而調(diào)控骨組織周圍微環(huán)境。此外,外泌體包含的miRNA通過上調(diào)或下調(diào)成骨相關(guān)基因介導(dǎo)相關(guān)信號通路,調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞或破骨細(xì)胞活性,平衡骨形成和吸收,參與骨重塑和骨再生過程。

3 體液來源的外泌體在骨骼發(fā)育與骨骼疾病中的應(yīng)用

外泌體不僅可以由幾乎所有類型細(xì)胞分泌,也廣泛存在于體液中,如血漿、尿液、唾液、母乳、精液和腹水等。先前研究中,外泌體具有在疾病侵襲機(jī)體時數(shù)量增加、在體液中穩(wěn)定存在且易獲取、不易被酶解的特點(diǎn),因而可通過外泌體分泌和轉(zhuǎn)移大部分腫瘤標(biāo)志物[40]以及基因或藥物的有效載體[41]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn),體液中的外泌體已成為多種疾病如類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)、ONFH、OA的生物標(biāo)志物,可用于疾病的診斷[42]。近年來,不同體液來源的外泌體再生療法成為促進(jìn)骨骼生長與再生的研究熱點(diǎn),在骨骼發(fā)育與相關(guān)疾病中發(fā)揮重要作用。基于外泌體可以包裹多種具有生物活性的核酸分子,如miRNAs、mRNAs等,當(dāng)發(fā)生疾病或處于病理狀態(tài)時,外泌體中各種成分的組成可發(fā)生明顯的改變,因此,可通過調(diào)控外泌體中miRNA的表達(dá)來促進(jìn)或抑制成骨細(xì)胞的增殖和分化,調(diào)控骨生成,進(jìn)而參與骨骼發(fā)育與相關(guān)疾病的發(fā)生與治療。

3.1 血漿來源外泌體

血漿外泌體miRNAs不僅限于癌癥領(lǐng)域,在RA[43]、OA、膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)[44]等疾病中也逐漸有研究應(yīng)用。有很多研究均提示,外泌體特異性miRNA水平與疾病的發(fā)生和發(fā)展存在密切關(guān)聯(lián)。外泌體miRNA是參與骨重建的重要因子,能在細(xì)胞之間傳遞生物學(xué)信息,對基因的表達(dá)起著重要的調(diào)控作用[45]。最近的研究表明,通過將小檗堿包封在源自富血小板血漿的外泌體中,通過wnt/β-catenin途徑促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的軟骨分化,為軟骨重建提供了新的見解[46]。此外,通過輻射調(diào)節(jié)外周血漿外泌體中與成骨和氧化相關(guān)的miRNA的表達(dá),可影響骨代謝和再生的方式,介導(dǎo)成骨方式[47]。也有研究證實,miR-26b-3p在特發(fā)性身材矮小(ISS)血漿外泌體中的過表達(dá)可抑制AKAP2/ERK1/2軸導(dǎo)致生長板軟骨的增殖和軟骨內(nèi)骨化障礙,從而誘導(dǎo)ISS[48]。

3.2 尿液來源外泌體

目前,尿液來源的外泌體主要在腎病患者或膀胱癌等癌癥疾病中應(yīng)用較多,大多數(shù)作用方式為參與一些信號通路介導(dǎo)癌細(xì)胞的生長與凋亡,進(jìn)而對疾病進(jìn)行診斷和治療。而在骨骼發(fā)育與骨骼疾病方面應(yīng)用很少。有報道,將人尿源性干細(xì)胞(human urine-derived stem cells,hUSCs)過表達(dá)miR-1-1p的外泌體處理大鼠KOA模型,結(jié)果表明hUSCs-exo處理KOA模型的軟骨細(xì)胞增殖和遷移能力增強(qiáng),細(xì)胞凋亡受到抑制,促進(jìn)了軟骨再生和軟骨下骨重塑,且hUSCs-exo過表達(dá)miR-140-5p相比干細(xì)胞來源外泌體本身治療OA更具有優(yōu)越性[11]。尿液外泌體中還有一些特有蛋白質(zhì),如水通道蛋白1、銅綠菌素、尿調(diào)節(jié)蛋白、前列腺干細(xì)胞抗原等,主要作為檢測體液的生物標(biāo)志物[49-50]。

3.3 其他來源外泌體

研究表明,乳源性外泌體可參與代謝過程、發(fā)育過程、免疫系統(tǒng)過程,與生物粘附和細(xì)胞增殖有關(guān),可以促進(jìn)腸道上皮細(xì)胞的活力,增強(qiáng)其增殖能力,并刺激腸道干細(xì)胞的活性,以及通過外泌體運(yùn)輸母乳中miRNA來影響嬰兒的生理功能發(fā)育,如糖脂代謝、腸道、神經(jīng)發(fā)育、免疫功能發(fā)育、表觀遺傳學(xué)和嬰兒疾病防治方面[51-52]。唾液來源的外泌體既可作為口腔疾病(如口腔癌)的理想標(biāo)志物,也用于參與調(diào)控?fù)p傷修復(fù)過程中的炎癥反應(yīng),促進(jìn)損傷部位的組織修復(fù)[53-55]。精液外泌體中包含的附睪體相關(guān)蛋白質(zhì)、前列腺體相關(guān)蛋白質(zhì)在精子成熟中起著不可或缺的作用[56]。子宮內(nèi)膜異位癥患者腹水外泌體中相比對照組存在5種特異性蛋白質(zhì),因此腹水來源的外泌體中蛋白質(zhì)的鑒定為疾病的診斷和研究開辟了新途徑[57]。在羊水外泌體中Let-7 d-5p可能通過調(diào)節(jié)BACH1表達(dá)促進(jìn)唐氏綜合征胎兒大腦中的氧化應(yīng)激[58]。布魯氏菌感染病人的汗液外泌體較唾液外泌體、尿液外泌體及血漿外泌體有5種共同的蛋白和896種獨(dú)特的蛋白質(zhì),作為精神分裂癥、老年癡呆癥和外胚層發(fā)育不良的生物標(biāo)記物[59]。但以上體液來源的外泌體在畜禽骨骼發(fā)育與骨代謝方面目前還無過多研究。

4 展 望

近年來,外泌體的應(yīng)用取得了諸多進(jìn)展,尤其在骨骼修復(fù)與再生方面。外泌體憑借其來源廣泛、穩(wěn)定易保存,可以人為地改變其內(nèi)容物的種類和數(shù)量,且無活細(xì)胞,因此可以避免因細(xì)胞過度增殖而放大療效或癌變,以及有可能避免某些針對間充質(zhì)干細(xì)胞調(diào)控問題的出現(xiàn),因此外泌體有代替間充質(zhì)干細(xì)胞等細(xì)胞發(fā)揮作用的趨勢,其攜帶的miRNA或蛋白質(zhì)等通過旁分泌介導(dǎo)某些信號通路,參與骨骼發(fā)育、抑制炎癥反應(yīng)、組織修復(fù)與再生等。

綜上,不同來源外泌體在疾病治療方面有頗多研究,如間充質(zhì)干細(xì)胞來源的外泌體在心臟、肺、腦、肝臟、皮膚、腎臟等多個方面均具有治療效果。在骨骼方面不僅調(diào)節(jié)骨骼代謝,也參與骨重塑、骨骼疾病的發(fā)生與治療以及在全身內(nèi)環(huán)境、關(guān)節(jié)腔環(huán)境中發(fā)揮重要作用。外泌體及其內(nèi)容物在畜禽遺傳育種上已有不少應(yīng)用,如豬上防止組織損傷、促進(jìn)組織新生,促進(jìn)生長發(fā)育與繁殖等;牛上促進(jìn)個體生長發(fā)育,參與體內(nèi)免疫平衡等;家禽上促進(jìn)子代的生長發(fā)育,參與免疫應(yīng)答與感染,以及妊娠羊上也有應(yīng)用。而在畜禽骨骼領(lǐng)域,大多研究集中在飼料添加劑(Ca、P、微量元素、抗?fàn)I養(yǎng)因子、中藥等)、不同日齡與生長環(huán)境以及與骨骼相關(guān)的基因、miRNA、mRNA、circRNA、蛋白等對骨骼的影響與作用機(jī)制,外泌體相關(guān)研究較少。因此,外泌體及其內(nèi)容物在畜禽骨骼生長發(fā)育與骨骼疾病方面具有很大的應(yīng)用潛力,為畜禽骨骼領(lǐng)域的研究奠定基礎(chǔ)。