經皮穴位電刺激對早發性卵巢功能不全大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的作用機制

帥振虹 張婉菁

南方醫科大學附屬深圳婦幼保健院生殖醫學中心，廣東深圳 518017

早發性卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）是指女性在40 歲之前卵巢功能明顯衰退的臨床綜合征，以月經紊亂同時伴有高促性腺激素和低雌激素為特征，其發病率為1%～3%，且近年來呈明顯上升趨勢[1]。研究表明，各種原因導致的POI 大都伴隨著卵巢顆粒細胞的凋亡，因此卵巢顆粒細胞過度凋亡可能成為POI 發病的始動因素[2-4]。經皮穴位電刺激（transcutaneous electric acupoint stimulation，TEAS）是以電刺激信號代替傳統針灸機械刺激的一種新型針灸療法，具有無創、易操作、能定量控制時間和強度等優點。研究發現，TEAS 在治療POI 生殖內分泌紊亂方面取得了良好的臨床效果，但關于TEAS 對POI 卵巢顆粒細胞凋亡的影響尚鮮見報道[5]。本研究旨在觀察TEAS 對POI 大鼠激素水平的調節及對微小RNA-23a（miR-23a）/SMAD 同源物5（recombinant SMAD family member 5，SMAD5）信號通路的影響，探討TEAS對POI 模型大鼠卵巢顆粒細胞凋亡的影響及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物

40 只10～12 周齡SPF 級雌性SD 大鼠，體重210～250 g，由北京維通利華實驗動物技術有限公司提供[合格證號SYXK（粵）2015-0106；許可證號SCXK（京）2016-0006]。室溫控制在22～25 ℃，濕度50%，通風良好。本實驗經深圳市婦幼保健院倫理委員會批準（SFYLS[2021]008）。

1.1.2 主要藥物

雷公藤多苷片（湖南千金協力制藥有限公司，批號：Z43020228）、戊酸雌二醇片（德國拜耳醫藥有限公司，批號：J20220009）。

1.1.3 主要試劑與儀器

大鼠血清卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，FSH）、雌二醇（estradiol，E2）抗米勒管激素（anti-mullerian hormone，AMH）的ELISA 試劑盒（上海酶聯生物有限公司）；電泳儀（美國BIO-RAD 公司）；凝膠成像系統（美國GE 公司）；SDZ-Ⅱ華佗電子針療儀（蘇州醫療用品廠有限公司）；ME204E 電子天平（瑞士METTLER TOLEDO 公司，精密度0.01 g）。

1.2 實驗方法

1.2.1 POI 大鼠模型構建及分組

每日上午8:00—9:00 時行陰道脫落細胞涂片檢查，選取動情周期規則的40 只雌性大鼠，采用隨機數字表法將其分成對照組、模型組、TEAS 組、激素組，除對照組外，其余30 只大鼠均使用雷公藤多苷片灌胃造模，每日上午給予生理鹽水配制的雷公藤多苷片懸浮液按50 mg/kg 連續灌胃14 d。對照組給予等量生理鹽水灌胃。當大鼠陰道脫落細胞涂片顯示動情周期紊亂時提示造模成功[6-8]。

1.2.2 干預方法

于造模結束后次日開始干預，TEAS 組參照《實驗針灸學》[9]選取關元、腎俞、雙側子宮及三陰交穴，用電子針療儀予連續波、頻率2 Hz、刺激強度以刺激點出現輕微肌肉節律收縮為宜，20 min/次[10]。激素組給予戊酸雌二醇溶液1 mg/（kg·d）進行灌胃。對照組和模型組僅給予抓取和固定，不予任何治療。各組均為2 次/d，連續2 周。TEAS 干預結束后第2 天，腹股溝靜脈取血，分離血清，用于檢測血清性激素的表達。處死大鼠，開腹取出兩側卵巢，左側卵巢放于4%多聚甲醛溶液中，用于TUNEL 檢測；右側卵巢迅速用液氮保存，用于Western blot 實驗。

1.2.3 檢測指標及方法

1.2.3.1 血清性激素水平檢測 各組大鼠TEAS 或灌胃結束后第2 天，腹股溝靜脈取血，離心半徑8 cm，離心速度4 000 r/min，10 min，按照ELISA 試劑盒說明書操作，檢測血清FSH、E2、AMH 水平。

1.2.3.2 TUNEL 染色法檢測卵巢顆粒細胞凋亡率 對卵巢組織切片二甲苯脫蠟，梯度乙醇及水合；蛋白酶K 工作液處理組織15～30 min；滴加50 μl TUNEL（試劑A5 μl+試劑B45 μl）反應混合液于標本上，室溫孵育1 h；載玻片晾干后滴加50 μl 轉化劑POD 液，室溫孵育30 min；滴加50～100 μl DAB 底物溶液，室溫顯色10 min；用蘇木精染液復染后立即用自來水沖洗。梯度乙醇脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片；滴一滴PBS 于視野下，用光學顯微鏡觀察凋亡顆粒細胞數并拍照，計數TUNEL 陽性細胞相對于總細胞的百分率。

1.2.3.3 Westernblot 檢測 卵巢中miR-23a、SMAD5、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（cysteine aspartate proteinase 3，Caspase-3）蛋白表達BCA 法測定蛋白濃度，取25～50 μg 蛋白樣品進行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉至PVDF 膜，室溫封閉1 h 后4℃過夜孵育一抗，用PBST 洗滌5 次后室溫孵育二抗1 h，用PBST 洗滌5次后將PVDF 膜進行ECL 化學發光顯影，采用Image J軟件分析蛋白灰度值，目的蛋白的相對表達量=目的蛋白灰度值/β-actin 灰度值。

1.3 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK-q 檢驗。P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠血清性激素水平比較

與對照組比較，模型組大鼠血清E2、AMH 水平降低，FSH 水平升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，TEAS 組大鼠血清E2、AMH 水平均上升，FSH 水平顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠血清性激素水平比較（）

表1 各組大鼠血清性激素水平比較（）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；TEAS：經皮穴位電刺激；FSH：卵泡刺激素；E2：雌二醇；AMH：抗米勒管激素。

2.2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較

與對照組比較，模型組顆粒細胞凋亡率明顯升高，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，TEAS組大鼠顆粒細胞凋亡率明顯下降，差異有統計學意義（P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（%，）

表2 各組大鼠卵巢顆粒細胞凋亡率比較（%，）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；TEAS：經皮穴位電刺激。

2.3 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 的蛋白表達比較

與對照組比較，模型組大鼠卵巢SMAD5 蛋白表達減少，而miR-23a、Caspase-3 蛋白表達增加，差異有統計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，TEAS 組大鼠卵巢SMAD5 蛋白表達增加，miR-23a、Caspase-3 蛋白表達減少，差異有統計學意義（P＜0.05）。見圖1、表3。

圖1 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白的表達

表3 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白表達比較（）

表3 各組大鼠卵巢miR-23a、SMAD5、Caspase-3 蛋白表達比較（）

注 與對照組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；TEAS：經皮穴位電刺激；SMAD5：SMAD 同源物5；Caspase-3：半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3。

3 討論

祖國醫學認為POI 屬于“月經后期、閉經、不孕癥”等范疇。中醫學認為腎精匱乏、沖任虛衰是其基本病機，肝郁脾虛是發病的關鍵因素。本研究選取雙側子宮及三陰交為主穴，關元、腎俞為配穴[11]。子宮穴為經外奇穴，與胞宮相鄰，具有局部治療作用；三陰交為三條陰經的交會穴，有通調沖任的作用；關元為任脈之穴，能健脾和胃、調經理氣；腎俞穴是腎的背腧穴，能補益腎精?？v觀諸穴配伍，以補腎填精為主，使腎精充足而天癸盛，再通調沖任、養血行氣使精充血足，經血有了物質基礎，營血充盛，陰陽調和，五志七情調暢，諸證可解。

顆粒細胞是卵泡的主要功能單位，對卵母細胞發育起著重要的調控作用[12]。POI 卵泡發育異常以竇卵泡發育阻滯在2～3 mm 階段、顆粒細胞過度凋亡引起的卵泡閉鎖加速導致卵子質量下降為主要特征[13-14]。因此，顆粒細胞過度凋亡是觸發POI 的機制之一。研究表明，與卵巢功能正常的女性比較，miR-23a 在POI女性的血漿和顆粒細胞中的表達顯著上調[15-17]。作為miR-23a 靶基因之一的SMAD5 是一種受體調控的SMAD 蛋白，可通過激活Caspase-3 蛋白直接影響顆粒細胞凋亡[18-19]。

研究闡明，針刺對POI 女性下丘腦-垂體-卵巢軸有良性調整作用，但具體機制尚不明確[20-25]。本研究采用的TEAS 是以電刺激信號代替傳統針灸機械刺激的一種新型針灸療法，通過雷公藤多苷建立POI 模型大鼠基礎上，觀察TEAS 對POI 模型大鼠血清激素水平的影響，證實了TEAS 的治療效果；進一步觀察結果顯示，TEAS 能上調SMAD5 蛋白表達，下調miR-23a、Caspase-3 蛋白表達，提示TEAS 可能通過調節miR-23a/SMAD5 信號通路，下調促凋亡蛋白的表達，從而抑制顆粒細胞過度凋亡，減少卵泡閉鎖，改善卵巢功能。但是否存在其他作用機制，在今后的研究中有待進一步探索。

利益沖突聲明：本文所有作者均聲明不存在利益沖突。