基于Box-Behnken 設計-響應面法和電子眼的梔子姜炙工藝研究

范星晨，祁玉芳，張科衛，汪思晨，戴桂鈺，陸兔林，毛春芹

南京中醫藥大學藥學院，江蘇 南京 210023

梔子GardeniaeFructus為茜草科梔子屬植物梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果實，是中國傳統的藥食同源品種之一[1-2]。其性寒，味苦，具有瀉火除煩、涼血解毒、消腫止痛、清熱利濕的功效。現代研究表明，梔子中所含的梔子苷、西紅花苷等成分具有保肝利膽、抗炎、抗抑郁等作用[3-7]。

有關梔子的炮制最早見于東漢，稱為“擘”，即敲擊梔子使其裂開[8]。到了宋代，《產寶雜錄》首載“姜汁炒焦黃”[9]。姜梔子的炮制方法自此不斷改良和完善，姜汁炙法也一直沿用至今。《中國藥典》2020年版收載的越鞠保和丸、黃連上清顆粒、導赤丸等14 種成方制劑均以姜梔子組方配伍入藥，但歷版《中國藥典》梔子項下均未收錄姜梔子這一飲片。查閱國家及各省市的炮制規范發現，北京、天津、山西、河南、福建、山東、重慶等省市均收錄了姜梔子飲片及其炮制方法，但是不同地區姜梔子的炮制方法有所不同，且均缺少細化統一的炮制工藝參數。故有必要對姜梔子的炮制工藝參數進行細化，以使其質量穩定可控，從而保證臨床用藥安全有效。

本研究采用 Box-Behnken 設計-響應面法（Box-Behnken design-response surface methodology，BBD-RSM）考察姜梔子炮制工藝，以外觀性狀與內在指標性成分的含量相結合，以此細化姜梔子炮制工藝參數，為中藥飲片炮制工藝的規范化研究提供一定的參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，美國Agilent公司；MS-105D 型1/10 萬電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多集團；CM-5 型分光測色儀，日本柯尼卡美能達有限公司；KQ-500E 型數控超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；H1650-W 型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；FA1104N 型電子天平，上海精密科學儀器有限公司；美的C21-RT2170 型勻火電磁爐，廣東美的生活電器制造有限公司；JYL-C93T 型榨汁攪拌機，九陽股份有限公司；BO-400Y 型多功能粉碎機，中國永康鉑政五金廠；H1650-W 型臺式高速離心機，湖南湘儀實驗室儀器開發有限公司；Milli-Q Integral 3 型超純水器，南京漢隆實驗器材有限公司。

1.2 試劑與藥品

對照品梔子苷（批號21092708，質量分數99.11%）、西紅花苷I（批號20022801，質量分數98.29%）、京尼平龍膽雙糖苷（批號21090604，質量分數99.20%）、西紅花苷II（批號19102303，質量分數98.84%）均購于成都普菲德生物技術有限公司；甲醇、甲酸、乙腈為色譜純；實驗用水為經Milli-Q Integral 3 型超純水器處理后所得的超純水。

16 批梔子藥材（編號Z01～Z16）購于8 個不同的省份，分別為浙江金華（Z01）、蒼南（Z02），四川成都（Z03），山西晉城（Z04），安徽亳州（Z05）、六安（Z06），江西井岡山（Z07）、九江（Z08）、上饒（Z09）、樟樹（Z10），湖北神農架（Z11）、蘄春（Z12），福建三明（Z13）、福安（Z14），湖南岳陽（Z15）、湘潭（Z16）；分別取上述梔子藥材按照《中國藥典》2020 年版飲片項下制備成相對應的凈梔子飲片（ZP01～ZP16）；輔料生姜購于江蘇南京。經南京中醫藥大學陳建偉教授鑒定，分別為茜草科梔子屬植物梔子GardeniajasminoidesEllis 的干燥成熟果實、姜科姜屬植物姜ZingiberofficinaleRosc.的新鮮根莖。經檢測均符合《中國藥典》2020 年版的質量要求。

2 方法與結果

2.1 梔子姜炙制備方法

2.1.1 輔料姜汁的制備 取生姜100 g，洗凈，搗碎，加水適量榨汁，用4 層紗布濾過。姜渣再加水適量，重復壓榨2 次，合并汁液，最后得生姜汁100 mL（每1 mL 生姜汁相當于生姜1 g）。

2.1.2 姜梔子的制備 取100 g 凈梔子飲片，加入一定量的姜汁拌勻，潤透，置于已設定相應功率的炒制容器內，翻炒至規定程度，取出，晾涼，即得。其中姜汁用量以凈梔子飲片質量的百分比表示。如10%的姜汁用量即指100 g 凈梔子飲片所用姜汁量為10 g。

2.2 指標成分的含量測定

2.2.1 色譜條件 色譜柱為Agilent C-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液-乙腈，梯度洗脫：0～15 min，96%～88%乙腈；15～30 min，88%～80%乙腈；30～35 min，80%～74%乙腈；35～45 min，74%～60%乙腈；45～60 min，60%～96%乙腈；體積流量1.0 mL/min；檢測波長254 nm 和440 nm；柱溫30 ℃；進樣量10 μL。經上述色譜條件進樣檢測，樣品中梔子苷和西紅花苷I 色譜峰的保留時間與對照品的保留時間相一致，均能達到很好的分離效果。對照品及樣品的HPLC圖見圖1。

圖1 混合對照品 (254 nm, A; 440 nm, B) 和姜梔子樣品(254 nm, C; 440 nm, D) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of mixed reference substances (254 nm, A; 440 nm, B) and Gardeniae Fructus processed with ginger juice(254 nm, C; 440 nm, D)

2.2.2 對照品溶液的制備 精密稱取對照品京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I 和西紅花苷II適量，配制成質量濃度為1.904、1.816、1.991、1.211 mg/mL 的混合對照品儲備液。

2.2.3 供試品溶液的制備 取按“2.1.2”項下制成的姜梔子飲片，打粉。精密稱取其粉末（過四號篩）0.1 g，置具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱定質量，超聲處理40 min（功率250 W、頻率40 kHz），放冷，稱定質量，用50%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，高速（12 000 r/min）離心（離心半徑5 cm）10 min，取上清液過0.22 μm微孔濾膜，即得供試品溶液。

2.2.4 線性關系考察 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品儲備液，按倍比稀釋原則制備成系列混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，以峰面積平均值（Y）對質量濃度（X）進行線性回歸，計算回歸方程分別為京尼平龍膽雙糖苷Y＝647.030X＋1.517 2，r＝0.999 9，線性范圍59.6～952.0 μg/mL；梔子苷Y＝2 843.000X＋2.697 1，r＝0.999 5，線性范圍56.8～908.0 μg/mL；西紅花苷IY＝2 460.700X－22.152，r＝0.999 4，線性范圍62.2～996.0 μg/mL；西紅花苷IIY＝1 012.800X－12.951，r＝0.999 6，線性范圍75.7～605.5 μg/mL。

2.2.5 精密度試驗 精密吸取“2.2.2”項下混合對照品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件連續進樣6 次，記錄各色譜峰峰面積，根據目標化合物峰面積計算其RSD。結果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 峰面積的RSD 分別為0.66%、0.52%、0.47%、0.67%，結果表明儀器系統精密度良好。

2.2.6 重復性試驗 取編號為Z06 的梔子藥材，按“2.1.2”項下方法制成姜梔子飲片，精密稱取姜梔子樣品粉末6 份，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按標準曲線法計算出各目標化合物的含量，并計算得各目標化合物含量的RSD。結果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 的平均質量分數分別為2.706 8%、8.052 3%、6.095 2%、1.213 8%，其RSD 分別為1.40%、0.22%、0.71%、0.68%，結果表明所建立的試驗方法重復性良好。

2.2.7 穩定性試驗 取編號為Z06 的梔子藥材，按“2.1.2”項下方法制成姜梔子飲片，精密稱取同一份樣品粉末，按“2.2.3”項下方法制備成供試品溶液，分別在制備后0、2、4、8、12、24 h 按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，根據目標化合物峰面積計算其RSD。結果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 峰面積RSD 分別為0.80%、0.73%、0.63%、0.92%，結果表明供試品溶液在室溫密閉條件下放置24 h 內穩定性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 取編號為Z06 的梔子藥材，按“2.1.2”項下方法制成姜梔子飲片，精密稱取0.05 g 已知各指標成分含量的姜梔子粉末9 份，分成3 組，每組分別精密加入0.5、1.0、1.5 mL 的混合對照品溶液（其中1.0 mL 混合對照品溶液中指標成分質量濃度與樣品中指標成分質量濃度總體相當），按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，計算各目標化合物的加樣回收率及其RSD。結果京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷、西紅花苷I、西紅花苷II 的平均加樣回收率分別為100.12%、100.09%、99.99%、100.21%，RSD 分別為1.20%、0.90%、0.80%、1.30%，結果表明該試驗所建立的含量測定方法準確度良好。

2.3 姜梔子炮制工藝考察

2.3.1 BBD-RSM 試驗設計 根據本課題組前期研究情況[10]，選擇炒制火力（X1）、炒制時間（X2）、姜汁用量（X3）3 個因素設計響應面試驗，Y為綜合評分。炮制工藝評價選擇梔子苷、西紅花苷I、醇溶性浸出物的含量及外觀性狀（顏色＋氣味）作為指標。BBD-RSM 試驗設計與結果見表1，外觀性狀評分標準見表2。

表1 BBD-RSM 試驗設計與結果Table 1 Design and results of BBD-RSM

表2 姜梔子外觀性狀評分Table 2 Evaluation of appearance of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

按照Box-Behnken 試驗設計原理進行試驗設計，根據各指標重要程度確定綜合評分的方法，具體計算方法見如下公式。

i表示組別編號，S1i、S2i、S3i分別對應各組別姜梔子飲片梔子苷含量、西紅花苷I 含量、醇溶性浸出物含量，S1max、S2max、S3max分別對應所有組別姜梔子飲片梔子苷含量、西紅花苷I含量、醇溶性浸出物含量的最大值，Pi為各組別姜梔子飲片性狀評分（顏色＋氣味）（分），Pmax為所有組別姜梔子飲片性狀評分最大值（分）

2.3.2 梔子姜炙外觀性狀研究

（1）色澤評價：根據響應面法設計的試驗分組進行測色試驗，按“2.1”項下方法制備姜梔子飲片并粉碎過三號篩，備用。測色儀測定光源D65，視角測量口徑φ3 mm，測定試場10°，測量波長360～740 nm，測量波長間隔10 nm，照明光源脈沖氙燈，SCE 模式（不包含鏡面反射光），30 mm。零校正（放置透明片、黑筒）與用戶校正（放置透明片、白板）。將4.0 g 樣品粉末均勻平鋪在測試皿內采集圖像并記錄色度值，平行測定3 次取平均值。

以明度值（L*）、紅綠值（a*）和黃藍值（b*）來表示色號并計算總色度值（Eab*），公式為Eab*＝(L*2＋a*2＋b*2)1/2，Eab*越大顏色越淺[11]。其中L*由0～100 表示顏色由黑到白；a*由正到負表示顏色由紅到綠色；b*由正到負表示顏色由黃到藍[12-13]。可用總色差值（ΔEab*）[11]表示2 個色號之間的色差，計算公式為ΔEab*＝(ΔL*2＋Δa*2＋Δb*2)1/2，規定當ΔEab*＞1.5 時，表示待測樣品顏色間有明顯差異[14]。顏色評分范圍見表3，不同炮制程度姜梔子飲片見圖2。由表3 可知，評分4 的總體亮度最高，顏色最淺，總體偏紅偏黃，符合主體紅黃色的外觀性狀描述；相比評分4，評分5 的姜梔子亮度、紅色度、黃色度均較小，故呈現金黃色的外觀；評分3、2、1 的姜梔子亮度、紅色度、黃色度隨著評分降低其下降幅度很大，其亮度逐漸變暗，顏色也逐漸加深，與肉眼所見的主觀感受相符合。取各個評分L*、a*、b*的平均值代入ΔEab*的計算公式，各個評分之間的ΔEab*按照評分順序從高到低分別為3.657、5.207、8.678、7.533 均遠大于規定所述的1.5，說明不同評分的姜梔子飲片顏色有明顯差異，故采用電子眼測色評價姜梔子的炮制程度是可行的。

表3 姜梔子顏色評分范圍Table 3 Color rating range of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

圖2 不同炮制程度姜梔子飲片Fig.2 Different processing degrees of Gardeniae Fructus processed with ginger juice

（2）氣味評價：隨機選取15 名嗅覺正常的健康人員對炮制后的姜梔子飲片進行氣味測評，取其平均值作為氣味評分（評分標準見表2）。氣味評分結果見表1。

2.3.3 BBD-RSM 試驗結果 按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，按照標準曲線法計算，得出梔子苷、西紅花苷I 的含量；浸出物測定按照《中國藥典》2020 年版測定方法（通則2201），采用熱浸法提取醇溶性浸出物，提取溶劑為乙醇。結果見表1。

利用Design-Expert 10.0 軟件處理實驗數據，對各因素分別進行多元線性回歸和二項擬合，得到回歸方程Y＝?201.590 8＋0.652 9X1＋24.569 9X2＋24.661 8X3＋0.006 5X1X2－0.006 1X1X3－0.081 1X2X3－0.000 8X12－2.933 7X22－1.139 5X32，判定系數（R）0.982 0。回歸模型具體數據見表4，本次建立的模型P＜0.001，F值為42.441 4，表明此響應回歸模型達到了極顯著性水平，具有統計學意義，且失擬項P值為0.095 6＞0.05，F值為4.321 9，失擬項不顯著，表明無失擬因素存在。因此，該回歸方程可對實驗結果進行分析。根據模型的判定系數（R2＝0.982 0）、調整判定系數（Radj2＝0.958 9）和預測判定系數（Rpre2＝0.943 3），可知有4.11%的變異不能用該模型解釋，說明該模型擬合性較好；變異系數（CV）2.58%＜10%表明試驗精確度可信度高。精密度是有效信號與噪聲的比值，為19.099 5＞4，說明試驗較為合理。

表4 Box-Behnken 回歸模型方差與顯著性分析Table 4 Analysis of variance and significance of Box-Behnken regression model

擬合模型中各系數的絕對值大小直接反映各因素對指標值的影響程度，X1、X2、X3、X12、X22、X32項P值具有統計學意義（均＜0.05），對綜合評分均有影響。其中單因素項的X1（炒制火力）和X2（炒制時間）對模型的影響表現出極顯著性水平（P＜0.001），對綜合評分影響較大，表明這2 項是影響姜梔子飲片質量的主要因素。X3（姜汁用量）雖然不是影響姜梔子飲片質量的主要因素，但仍表現出顯著性水平（P＜0.05）。根據F值大小得3 個因素對姜梔子炮制品質量影響的貢獻率為X2＞X1＞X3。

根據擬合回歸方程，運用Origin 2018 軟件建立矩陣并繪制三維效應面圖和等高線圖，結果見圖3。右側各影響因素兩兩交互的等高線均呈現橢圓形，說明各因素交互作用較為顯著。結合左側三維效應面圖可知，炒制火力（X1）、炒制時間（X2）的三維圖傾斜度較高，坡度較陡，顏色加深變化顯著，說明這2 個因素對姜梔子炮制工藝綜合評分影響較為顯著，該結論與方差分析結果一致。

圖3 炒制溫度 (X1)、炒制時間 (X2)、姜汁用量 (X3) 3 因素對綜合評分的三維效應面圖和等高線圖Fig.3 Response and contour surface plots of processing firepower (X1), frying time (X2) and the amount of ginger juice (X3)three factors to composite score

利用軟件進行數據預測可知，姜梔子的最優炮制工藝為炒制火力368.543 W，炒制時間4.459 min，姜汁用量9.677%，綜合評分為92.805 分。結合實際操作，將最佳工藝修正為炒制火力400 W，炒制時間4.5 min，姜汁用量10%。

2.4 姜炙工藝驗證試驗

按照上述優化工藝制備3 份樣品，樣品表面呈金黃色，具姜辣味。具體評分結果見表5，結果表明本研究優選出的姜梔子炮制工藝穩定可行。

表5 驗證試驗結果Table 5 Results of verification test

2.5 梔子姜炙前后化學成分變化

取“1.2”項下的凈梔子飲片（ZP01～ZP16）；按照優選工藝制備姜梔子飲片（JZP01～JZP16），按“2.2”項下方法進行測定，計算各成分含量，實驗結果見表6。梔子飲片經姜炙后其中的京尼平龍膽雙糖苷、梔子苷的含量均有上升；西紅花苷I、II的含量顯著降低，尤以西紅花苷II 含量下降最為顯著，平均下降幅度約為46%。

表6 16 批梔子飲片和姜梔子飲片樣品中4 種成分含量測定 (n = 3)Table 6 Contents of four compounds in Gardeniae Fructus samples (n = 3)

3 討論

目前，針對姜梔子的研究較少且研究內容基本都以單個成分含量檢測為主，缺少其他的代表性成分。本研究引入電子眼測色這一技術，將外觀評價的色澤進行量化，減少了主觀因素帶來的評判失誤，這樣就能更加科學合理地對姜梔子飲片的炮制程度進行客觀評判。

本研究發現梔子在姜炙過程中其外觀性狀與內在化學成分均發生了變化。梔子在姜炙不及時呈現原本的紅黃色，在姜炙得當后呈現金黃色，在姜炙太過時顏色逐漸呈棕褐色；梔子經姜炙后，其中所含的梔子苷與京尼平龍膽雙糖苷的含量均有上升，該結果與其他學者的研究相一致[10,15]；西紅花苷I、II 的含量顯著降低，尤以西紅花苷II 下降最為顯著，可能與其作為長鏈結構的化合物性質不穩定，較易轉化為其他物質有關[16-17]。

在進行氣味評價試驗時，本實驗參考姜炙工藝的相關文獻報道[18-20]，發現目前尚未見測試氣味時所采用的測試人員的相關信息（健康狀況、人數）。為了使得氣味評分結果更具客觀性，本實驗選擇15名具有正常嗅覺的健康人員進行測試評分，然后取平均值的方法來獲得最終的氣味測試結果，從而保證氣味評價數據的合理性。

本實驗將顏色變化以客觀量化方式納入考察范疇，使得試驗結果更加科學、準確、客觀。在考察指標方面選用了梔子中的梔子苷、西紅花苷等具有生理活性的物質作為評價指標，相比于單一化學成分的考察更加合理，且這些指標成分在實際測定過程中耗費的資源成本較低，符合企業大規模生產的要求。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突