酸堿位移結(jié)合噴霧干燥法制備染料木素三元包合物體系

王明帥，寧 夏，劉華石，王井俠，段亞輝，耿晨陽，王偉明

黑龍江省中醫(yī)藥科學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150036

染料木素（genistein，Gen）即金雀異黃素，為異黃酮類化合物[1]?，F(xiàn)代藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，具有抗氧化、抗腫瘤、抗骨質(zhì)疏松、調(diào)血脂、清除自由基等生物活性，且毒性較低，不良反應(yīng)較小，因此作為天然抗癌產(chǎn)物而被廣泛研究[2-5]。但研究結(jié)果表明，染料木素具有水溶性差、生物利用度較低等缺陷，限制其在臨床上的應(yīng)用。

環(huán)糊精是一種優(yōu)良載體，可與疏水性藥物分子形成包合物，通常用于增加藥物分子的溶解度和溶解速率[6-8]，但由于成本、生產(chǎn)能力和毒性等多種原因，導(dǎo)致藥物配方中環(huán)糊精使用量有限[9-12]。羥丙基-β-環(huán)糊精（hydroxypropyl-β-cyclodextrin，HP-β-CD）是在環(huán)糊精羥基上進(jìn)行化學(xué)修飾產(chǎn)生的一種環(huán)糊精衍生物[13]，其水溶性更強(qiáng)，毒性更低[14]，在低至中等劑量下，被認(rèn)為是口服和靜脈注射無毒，被廣泛用于改善水溶性差藥物的溶解度[15]，是美國食品藥品監(jiān)督管理局（Food and Drug Administration，F(xiàn)DA）推薦使用的增溶劑，且多種上市藥物中都有HP-β-CD 存在[16]。據(jù)報(bào)道，染料木素與HP-β-CD包合物增強(qiáng)了染料木素的溶解度、穩(wěn)定性、溶解速率和生物利用度[17-18]。

而包合物增溶的另一個(gè)方向是與親水性聚合物配合，親水性聚合物具有協(xié)同作用，能增加包合物穩(wěn)定性[19-23]。本研究為解決染料木素水溶性差的問題，采用相溶解度實(shí)驗(yàn)與分子模擬探究三元與二元包合物的增溶效果，并對(duì)制備工藝、體外抗癌活性進(jìn)行系統(tǒng)性研究，對(duì)包合物進(jìn)行表征為開發(fā)染料木素抗癌藥物提供參考。

1 儀器與材料

1.1 儀器

SD-1500 型噴霧干燥機(jī)，上海沃迪智能裝備股份有限公司；BP-10 型電子天平，德國賽多利斯公司；LC-20A 型高效液相色譜，日本島津公司；HS-DSC-101 型差示掃描量熱儀，上海和晟儀器科技有限公司；Smartlab9 型X 射線衍射儀，日本理學(xué)株式會(huì)社；Apreo 2 型掃描電子顯微鏡（SEM），美國賽默飛世爾科技公司；RC-806 型溶出儀，天津市天大天發(fā)科技有限公司；Spectrum Two 型紅外光譜儀，美國Perkin Elmer 公司；H97 型磁力攪拌器，上海尚普儀器設(shè)備有限公司。

1.2 材料

染料木素對(duì)照品，批號(hào)111704-201302，質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.1%，中國食品藥品檢定研究院；羥丙基-β-環(huán)糊精（HP-β-CD）、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）K30，上海阿拉丁試劑公司；非小細(xì)胞肺癌A549 細(xì)胞，上海細(xì)胞資源庫；人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞，武漢普諾賽生命科技有限公司；細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒CCK-8，批號(hào)G021-1-2，南京建成生物工程研究所；氫氧化鈉、鹽酸，西隴科學(xué)股份有限公司；其他均為實(shí)驗(yàn)室分析級(jí)試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 染料木素測(cè)量方法

2.1.1 色譜條件 采用配有光電陣列二極管和自動(dòng)進(jìn)樣器的島津LC-20A 進(jìn)行分析。采用Krmasil C18色譜柱（250 mm×4.6 μm，5 μm）；流動(dòng)相采用0.05%磷酸水溶液-甲醇（3∶7）；柱溫30 ℃；體積流量1 mL/min；進(jìn)樣量10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng)為260 nm。

2.1.2 對(duì)照品溶液的配制 精密稱取染料木素14.27 mg，加甲醇定容至100 mL 量瓶中，得染料木素對(duì)照品儲(chǔ)備液，再取染料木素對(duì)照品儲(chǔ)備液4.0 mL，置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻，得染料木素對(duì)照品溶液。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密稱取染料木素三元包合物75 mg，加甲醇稀釋至50 mL，再取4 mL 置于10 mL 量瓶中，加甲醇稀釋并定容至刻度，即得供試品溶液。

2.1.4 輔料空白溶液 取適量的HP-β-CD 與PVP K30 用甲醇溶解、稀釋定容，即得輔料空白溶液。

2.1.5 專屬性 取對(duì)照品溶液、供試品溶液及輔料空白溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，所得色譜圖見圖1，結(jié)果表明輔料及溶劑不會(huì)干擾目標(biāo)成分的測(cè)定，表明該分析方法專屬性良好。

圖1 輔料空白溶液 (A)、染料木素對(duì)照品溶液 (B) 和供試品溶液 (C) 的HPLC 圖Fig.1 HPLC of excipient blank solution (A), genistein reference substance solution (B) and test solution (C)

2.1.6 線性關(guān)系考察 精密稱取染料木素對(duì)照品15.65 mg 至50 mL 量瓶中，加甲醇溶解，稀釋至刻度，即得313 μg/mL 的對(duì)照品儲(chǔ)備液。精密量取對(duì)照品儲(chǔ)備液，用甲醇稀釋制成染料木素質(zhì)量濃度分別為0.500 8、2.504、12.520、156.500、313.000 μg/mL的對(duì)照品溶液。按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，以染料木素峰面積（Y）與質(zhì)量濃度（X）作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y＝74 393X＋40 262，R2＝0.999 8，結(jié)果表明染料木素在0.500 8～313.000 μg/mL 與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.1.7 精密度試驗(yàn) 取“2.1.3”項(xiàng)下染料木素三元包合物供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算進(jìn)樣精密度，結(jié)果顯示染料木素峰面積的RSD 為0.79%。

2.1.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取染料木素三元包合物供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12、24 h取樣測(cè)定，測(cè)得染料木素峰面積的RSD 為0.91%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.9 重復(fù)性試驗(yàn) 按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備染料木素三元包合物供試品溶液6 份，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定三元包合物中染料木素含量，結(jié)果其RSD 為1.45%，結(jié)果表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.10 加樣回收率試驗(yàn) 取染料木素三元包合物9 份，精密稱定，分別按樣品中染料木素含量添加對(duì)照品（添加標(biāo)準(zhǔn)80%、100%、120%各3 份），測(cè)得染料木素的平均加樣回收率為99.66%，RSD 為1.77%，結(jié)果表明該方法加樣回收率良好。

2.2 相溶解度實(shí)驗(yàn)

精密稱取10 mg 染料木素（過量）加入分別含有0～14 mmol/L 的10 mL HP-β-CD 水溶液中混合均勻，另制備含有5%的PVPK30 的三元混合溶液。樣品在恒溫?fù)u床中以（37.0±0.5）℃、150 r/min 的條件下放置72 h 后取出，5 000 r/min 將樣品離心15 min，收集上清液，通過微米過濾器（0.45 μm）濾過，并稀釋。以溶解度為縱坐標(biāo)，HP-β-CD 濃度為橫坐標(biāo)繪制溶解度相圖。在物質(zhì)的量比1 ∶1 的假設(shè)下，計(jì)算絡(luò)合效率和穩(wěn)定性常數(shù)（Ks）[24-26]。

S0為不存在HP-β-CD 時(shí)的固有溶解度，m代表溶解相圖上的線性斜率

根據(jù)染料木素的溶解度相圖可知，染料木素可與HP-β-CD 形成可溶性包合物，且溶解度隨HP-β-CD 濃度的增加呈線性增長(zhǎng)（圖2）。根據(jù)Higuchi方程可知，染料木素與HP-β-CD 的相關(guān)性可歸類為線性圖（AL）類型，而染料木素的斜率為0.035，遠(yuǎn)小于1，由此可知，1分子染料木素與1分子HP-β-CD形成包合物，或者說兩者的化學(xué)計(jì)量數(shù)之比為1∶1。在二元包合物中加入三元物質(zhì)PVP K30 溶解度進(jìn)一步增加，并且與染料木素的濃度呈線性相關(guān)。HP-β-CD 二元體系增加了7.2 倍，HP-β-CD 與PVP K30 形成的三元體系溶解度增加了10.8 倍。二元體系與三元體系的Ks和絡(luò)合效率值分別為397.3 mol?1、3.63%及635.76 mol?1、5.98%。在二元包合物中加入PVP K30 導(dǎo)致Ks和絡(luò)合效率顯著提高。PVP K30 作為三元物質(zhì)的存在通過外部黏附到環(huán)糊精表面來增強(qiáng)穩(wěn)定性，并有助于形成可能導(dǎo)致更高Ks值的共包合物。Ks值小于100 mol?1會(huì)產(chǎn)生不穩(wěn)定的藥物/環(huán)糊精包合物，而大于1 000 mol?1的Ks值可能會(huì)有阻礙影響藥物吸收。

圖2 二元 (Gen-HP-β-CD) 和三元 (Gen-HP-β-CD-PVP K30) 溶解度相圖Fig.2 Binary (Gen-HP-β-CD) and ternary (Gen-HP-β-CDPVP K30) solubility phase diagrams

2.3 分子對(duì)接研究

β-CD 晶體結(jié)構(gòu)的X 射線晶體學(xué)結(jié)構(gòu)從蛋白質(zhì)晶體數(shù)據(jù)庫（PDB）檢索，PDB：1BFN。利用PyMol獲得β-CD 的坐標(biāo)文件[27-29]。在β-環(huán)糊精的伯羥基上添加了4 個(gè)2-羥丙基，采用AutoDock 1.5.6 版用于添加缺失的氫，計(jì)算Gasteiger 電荷并生成pdbqt文件。在Chem Draw Ultra6.0 軟件中繪制配體PVP K30[30-32]，分配了適當(dāng)?shù)?D 取向。通過PM3 方法最小化，并將其保存為pdbqt 格式。通過AutoDock 1.5.6 使用拉馬克遺傳算法進(jìn)行篩選，并使用對(duì)接日志選擇最佳結(jié)合構(gòu)象。使用PyMol 視化工具4.0 進(jìn)行交互[33-36]。

為了在分子水平上證明PVP K30 有利于增加染料木素包合物的溶解度，利用AutuDock 進(jìn)行分子對(duì)接。分子對(duì)接技術(shù)，可以準(zhǔn)確地推測(cè)2 個(gè)分子的優(yōu)勢(shì)構(gòu)型。

為保證結(jié)構(gòu)的合理性，采用拉馬克遺傳算法（Lamarckian genetic algorithm，LGA）進(jìn)行分子對(duì)接。當(dāng)2 個(gè)分子形成穩(wěn)定包合物時(shí)，所產(chǎn)生的優(yōu)勢(shì)構(gòu)象主要取決于，結(jié)合位點(diǎn)的殘基的數(shù)量。分子對(duì)接結(jié)果如圖3 所示。對(duì)接結(jié)果表明，染料木素位于HP-β-CD 疏水腔的寬開口處，一部分位于腔中，另一部分為于腔外。染料木素的酚羥基和環(huán)糊精的羥丙基生成氫鍵，而色原酮上的羰基和7-位酚羥基分別與HP-β-CD 的吡喃葡萄糖苷氧原子形成了氫鍵，產(chǎn)生大量的范德華力，這些范德華力證明了包合物的形成。

圖3 二元和三元分子對(duì)接圖Fig.3 Binary and ternary molecular docking diagram

采用染料木素二元包合物進(jìn)一步與PVP K30進(jìn)行分子對(duì)接，結(jié)果表明，染料木素和羰基基團(tuán)與三元包合物中的吡喃葡萄糖苷氧原子產(chǎn)生了相互作用證明三元包合物比二元包合物更加穩(wěn)定，分子模擬結(jié)果仍需其他具體表征結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證。

2.4 包合物的制備

2.4.1 酸堿位移結(jié)合噴霧干燥法制備包合物 取25 mL 0.1 mol/L 的NaOH 溶液，加入270 mg 的染料木素與2.7 g 的HP-β-CD 超聲40 min 促進(jìn)包合，在40 ℃，900 r/min 條件下將相同物質(zhì)的量的鹽酸PVP K30 溶液加入染料木素溶液中，繼續(xù)攪拌30 min，采用相對(duì)分子質(zhì)量100 的透析袋除鹽，得到包合物溶液。采用噴霧干燥法得到干燥包合物（噴霧參數(shù)為進(jìn)風(fēng)溫度200 ℃，出風(fēng)溫度85 ℃，風(fēng)速60 Hz，撞針間隔3 s）。

2.4.2 噴霧干燥法制備包合物 將處方量染料木素溶于無水乙醇，加入HP-β-CD 與PVP K30，超聲40 min 促進(jìn)包合，在40 ℃、900 r/min 條件下繼續(xù)攪拌30 min，將所得溶液噴霧干燥（噴霧參數(shù)為進(jìn)風(fēng)溫度120 ℃，出風(fēng)溫度60 ℃，風(fēng)速60 Hz，撞針間隔3 s）得到包合物。

2.4.3 球磨法制備包合物 取處方量的染料木素與HP-β-CD 及PVP K30，置于球磨罐中在500 r/min下干磨3 h，加入50 倍量的純化水繼續(xù)研磨2 h，將得到的混懸液，利用噴霧干燥法干燥（噴霧參數(shù)為進(jìn)風(fēng)溫度200 ℃，出風(fēng)溫度85 ℃，風(fēng)速60 Hz，撞針間隔3 s）。

2.5 溶解度研究

取染料木素及包合物與物理混合物在37 ℃，將過量的樣品加入含有10 mL 蒸餾水的西林瓶中，振搖3 h。將樣品溶液以角速度10 000 r/min 離心（離心半徑100 mm），取上清液，過0.45 μm 微孔濾膜，稀釋。使用定量HPLC 分析染料木素含量，平行3份。結(jié)果如表1 所示，染料木素在物理混合物和包合物中的溶解度顯著提高，在只有染料木素存在時(shí)飽和溶解度為2 μg/mL，與文獻(xiàn)報(bào)道相同[37]，在物理混合物和三元包合物中，物理混合物水溶性比純?nèi)玖夏舅卦黾?0 倍［（20.23±3.23）μg/mL］，而酸堿位移法制備的三元包合物的溶解度達(dá)到了8.8 mg/mL。染料木素在三元包合物中的顯著高溶解度是由于和HP-β-CD 及PVP K30 形成了三元包合物。并且使用的酸堿位移結(jié)合噴霧干燥法相比于其他方法溶解度更高，推測(cè)一部分染料木素可能以鹽的形式存在。相比二元包合物，三元包合物由于表面活性劑的添加，有助于降低染料木素和水之間的界面張力提高染料木素的溶解度。Zafar 等[18]使用染料木素、HP-β-CD、TPGS 制了三元包合物，其溶解度比純?nèi)玖夏舅馗?8 倍。

表1 染料木素及包合物的溶解度Table 1 Solubility of genistein and inclusion complexes

2.6 三元包合物的表征

2.6.1 差示掃描量熱法（differential scanning calorimetry，DSC）分析 使用差示掃描量熱儀測(cè)定HP-β-CD、PVPK30、染料木素、染料木素三元包合物、三元物理混合物的熱特性。將樣品放入鋁坩堝中，以空白鋁坩堝為基準(zhǔn)，在氮?dú)獯祾叩臈l件下，10 ℃/min 升溫，掃描0～400 ℃，研究樣品熱性能。結(jié)果如圖4 所示，染料木素、HP-β-CD、PVPK30、物理混合物、三元包合物的DSC 譜圖，可以觀察到，由于水分子的蒸發(fā)會(huì)在70～130 ℃產(chǎn)生較寬吸收峰，染料木素在298.8 ℃處有明顯的的特征吸收峰，而PVP K30 與HP-β-CD 的為無定型物質(zhì)不存在明顯吸收峰。物理混合物由于染料木素的含量較少會(huì)在298.8 ℃出現(xiàn)較弱的吸收峰，三元包合物中染料木素被包被在疏水腔內(nèi)因此特征吸收峰消失。因此染料木素的DSC 圖譜可以為包合物的形成提供很好的證據(jù)。

圖4 染料木素、PVP K30、HP-β-CD、物理混合物、三元包合物的DSC 圖譜Fig.4 DSC spectra of genistein, PVP K30, HP-β-CD,physical mixture and ternary inclusion complex

2.6.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy，F(xiàn)TIR）分析 使用FTIR 光譜儀分析前，將各個(gè)樣品與KBr 在紅外燈下置于瑪瑙研缽中充分研磨，在4 000～400 cm?1的波數(shù)范圍內(nèi)掃描，掃描分辨率為2 cm?1。通過FTIR 對(duì)染料木素、PVP K30、HP-β-CD、物理混合物、三元包合物進(jìn)行分析，結(jié)果如圖5 所示。HP-β-CD 的光譜有3 402.43 cm?1O-H 處的伸縮震動(dòng)吸收帶，1 647 cm?1處的彎曲振動(dòng)，1 026.72 cm?1處的C-O-C 伸縮振動(dòng)峰。而PVP K30 在2 954.01 cm?1處有C-H 伸縮振動(dòng)，1 664.10 cm?1處的C-O 伸縮振動(dòng)，1 286.51 cm?1處存在C-N 伸縮振動(dòng)。染料木素在3 413.68 cm?1的-OH 伸縮振動(dòng)峰，1 650.03 cm?1處存在C＝O 伸縮振動(dòng)，在1 617.02、1 518.69 cm?1處呈現(xiàn)苯環(huán)的骨架振動(dòng)峰。三元物理混合物的FTIR 光譜中顯示出，染料木素、HP-β-CD 和PVP K30 的特征波段在2 928.21 cm?1顯示出PVP K30 的C-H 振動(dòng)，以及HP-β-CD 的3 042.43 cm?1處的O-H 伸縮振動(dòng)。染料木素三元包合物的紅外譜峰均屬于HP-β-CD 與PVP K30，而染料木素在1 650.03 cm?1處羰基峰和1 430～1 600 cm?1處苯環(huán)峰消失，推測(cè)染料木素的羰基和芳香環(huán)可能被包裹在HP-β-CD 的疏水腔內(nèi)，在1 652.38 cm?1處的O-H 氫鍵吸收峰可能為包合過程中產(chǎn)生的。

圖5 染料木素、PVP K30、HP-β-CD、物理混合物、三元包合物的FTIR 圖Fig.5 FTIR spectra of genistein, PVP K30, HP-β-CD,physical mixture and ternary inclusion complexes

2.6.3 X 射線粉末衍射（X-ray powder diffraction，XRPD）分析 使用X 射線衍射儀測(cè)定染料木素、三元包合物、三元物理混合物的XRPD 衍射圖，XRPD測(cè)試參數(shù)：在電壓40 kV，電流40 mA，測(cè)試范圍5°～90°，步距0.02，靶材是Cu 靶。結(jié)果如圖6 所示，采用XRPD 分析染料木素、物理混合物、染料木素三元包合物的晶體結(jié)構(gòu)，純?nèi)玖夏舅卦?.8°、13°、14.6°、18.2°、22.8°、25.0°、26.6°、36.4°、40.4°顯示出多個(gè)尖銳的晶體衍射峰證明染料木素的晶體結(jié)構(gòu)，而物理混合物在7.6°、17.9°、22.4°、26.4°存在染料木素的峰值說明物理混合物只是單個(gè)成分的疊加，而包合物中染料木素的特征峰值消失，只剩下類似HP-β-CD 的吸收峰推測(cè)三元包合物形成了非晶型無定型化合物。

圖6 染料木素、物理混合物、三元包合物的XRPD 圖譜Fig.6 XRPD pattern of genistein, physical mixture and ternary inclusion complex

2.6.4 SEM 分析 使用Apreo 2 型掃描電子顯微鏡測(cè)定染料木素、三元包合物、三元物理混合物的形態(tài)，使用濺射涂覆機(jī)單元用薄金鈀層涂覆樣品，并在加速電壓下分析表面形貌。結(jié)果如圖7 所示，從染料木素SEM 圖中可以看出，染料木素為規(guī)則的棒狀晶體，物理混合物為各種物質(zhì)的簡(jiǎn)單堆積，各物質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰可見，染料木素仍為棒狀結(jié)晶。而染料木素三元包合物中，染料木素的結(jié)構(gòu)消失且粒徑明顯減小，比單獨(dú)的染料木素、HP-β-CD 和PVP K30的粒徑要小得多，粒徑的減小導(dǎo)致顆粒表面積的增加，從而增加了三元包合物的水溶性和溶解速率。SEM 觀察結(jié)果與XRD 分析結(jié)果一致，表明染料木素與HP-β-CD 和PVP K30 形成的三元包合物處于無定型狀態(tài)，并證實(shí)了染料木素和HP-β-CD 的包合作用。

圖7 染料木素、物理混合物、三元包合物的SEM 圖譜Fig.7 Scanning electron microphotographs of genistein, physical mixture and ternary inclusion complex

2.7 溶出度研究

使用溶出儀評(píng)估三元包合物的釋放度，該研究在溶出裝置中進(jìn)行，使用pH 6.8 的磷酸鹽緩沖液（PBS）作為溶出介質(zhì)。準(zhǔn)確稱量樣品，并將其置于含有900 mL 容器中，溫度保持在（37.0±0.5）℃，研究過程中將槳設(shè)置在75 r/min。在固定的時(shí)間間隔（5、15、30、60、90、120 min）取出5 mL 試樣，并補(bǔ)加等量緩沖液。樣品過0.45 μm 的微孔濾膜，稀釋，并使用定量HPLC 分析測(cè)定染料木素含量，以建立染料木素、不同制備方式三元包合物的釋放曲線。

如圖8 所示，從圖中可以看出三元包合物的累積溶出度效果高于物理混合物。在30 min 時(shí)的溶出度酸堿位移法為93.02%，噴霧干燥法88.92%，球磨法70.05%，最終的溶出度也表明酸堿位移結(jié)合噴霧干燥的制備方式更好，酸堿位移結(jié)合噴霧干燥法制備的包合物表現(xiàn)出更好的溶出特性，推測(cè)部分染料木素以鹽的形式存在，因此，比其他制備方式溶出度更高，染料木素的三元包合物比物理混合物溶出度更高，可能因染料木素被包被在環(huán)糊精疏水腔內(nèi)，形成了氫鍵；增加了藥物的濕潤性等原因。

2.8 包封率

考察包合物處方對(duì)三元包合物包封率的影響，固定染料木素-HP-β-CD 的物質(zhì)的量比為1∶1.8，考察PVP K30 的加入量對(duì)包封率的影響。分別加入染料木素-HP-β-CD 總質(zhì)量1%、3%、5%、7%的PVP K30，考察三元包合物的包封率。在PVP K30 的加入量在1%、3%時(shí)，包合物溶液會(huì)出現(xiàn)明顯的渾濁，離心后，透析袋除鹽，測(cè)定包合物中染料木素的包封率為55%、65%，在5%、7%的加入量時(shí)，包合物溶液澄清，離心，除鹽，測(cè)定包合物中染料木素的包封率分別為94%、96%，相差不大。所以最終選擇5%的PVPK30 加入量。

2.9 體外抗癌實(shí)驗(yàn)

2.9.1 細(xì)胞培養(yǎng) 取A549、MCF-7 細(xì)胞，使用各自完全培養(yǎng)基，在5% CO2、（37.0±0.5）℃的CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

2.9.2 CCK-8 法測(cè)定細(xì)胞活性 使用CCK-8 法測(cè)定染料木素原料藥與三元包合物的抗癌活性，將癌細(xì)胞接種到96 孔板中，細(xì)胞密度保持在5×103個(gè)/孔、每孔100 μL，在37 ℃、5% CO2下培養(yǎng)24 h使細(xì)胞貼壁。點(diǎn)入100 μL 不同濃度的藥物，相同條件培養(yǎng)48 h，加入100 μL 10%的CCK-8 試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，利用酶標(biāo)儀在450 nm 下測(cè)定吸光度（A）值，通過公式計(jì)算抑制率。

抑制率＝(A對(duì)照－A實(shí)驗(yàn))/(A對(duì)照－A空白)

采用CCK-8 法測(cè)定染料木素與其三元包合物對(duì)MCF-7 細(xì)胞株和A549 細(xì)胞株的細(xì)胞毒性。結(jié)果如表2 所示，染料木素及其三元包合物對(duì)MCF-7和A549 細(xì)胞均有抑制作用，且均具有濃度相關(guān)性。與染料木素單獨(dú)處理組相比，染料木素三元包合物對(duì)細(xì)胞活力的抑制作用明顯增強(qiáng)。染料木素的IC50為135.5 μmol/L（A549 細(xì)胞）和209.9 μmol/L（MCF細(xì)胞），而染料木素三元包合物的IC50為201.9 μmol/L（MCF 細(xì)胞）和91.89 μmol/L（A549 細(xì)胞），實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，所形成的染料木素三元包合物增強(qiáng)了染料木素對(duì)癌細(xì)胞的抑制作用。

表2 染料木素原料藥及其三元包合物對(duì)MCF-9、A549 細(xì)胞存活率的影響 (±s, n = 4)Table 2 Effects of genistein raw materials and their ternary inclusion complexes on survival rate of MCF-9 and A549 cells(±s, n = 4)

與原料藥組比較：*P＜0.05 **P＜0.01 ***P＜0.001。*P < 0.05 **P < 0.01 ***P < 0.001 vs compared with raw material group.

組別 MCF-7 細(xì)胞存活率/%10 μmol?L?1 100 μmol?L?1 250 μmol?L?1 500 μmol?L?1 1 000 μmol?L?1染料木素原料藥 94.47±0.56 58.44±0.67 34.84±0.05 18.45±1.00 10.43±0.41染料木素三元包合物 89.05±1.00* 48.36±0.85*** 27.44±0.86** 8.63±1.06*** 4.76±0.77**組別 A549 細(xì)胞存活率/%10 μmol?L?1 100 μmol?L?1 250 μmol?L?1 500 μmol?L?1 1 000 μmol?L?1染料木素原料藥 96.81±2.65 90.36±6.61 50.56±8.74 18.03±5.90 9.72±2.31染料木素三元包合物 95.80±2.88 81.74±6.80* 41.62±8.47** 14.37±3.07 2.31±0.09*

3 討論

水溶性差是限制藥物開發(fā)與應(yīng)用的主要原因之一[38]。大量的抗癌藥物為不溶性或脂溶性物質(zhì)，給藥物開發(fā)帶來很大不便。HP-β-CD 是的β-CD 衍生物，與β-CD 相比具有更高的溶解度和更低的腸外毒性。有一定親脂性的染料木素分子能被捕獲到HP-β-CD 的疏水腔中，本研究，通過相溶解度實(shí)驗(yàn)及分子模擬證明三元包合物增溶效果及穩(wěn)定性高于二元包合物。對(duì)三種包合效果較好的制備工藝進(jìn)行考察，酸堿位移結(jié)合噴霧干燥法制備的三元包合物溶解度更高（8.8 mg/mL）。體外抗癌研究中，三元包合物具有更高的抗癌活性，與之前報(bào)道一致，含有HP-β-CD 的包合物增加了染料木素抑制細(xì)胞生長(zhǎng)的能力?？赡苡捎诎衔镄纬稍黾恿巳玖夏舅氐娜芙舛燃凹?xì)胞膜的透過性。另一種原因可能是HP-β-CD 的存在也可增強(qiáng)染料木素抗癌活性，最近的一項(xiàng)研究報(bào)道，HP-β-CD 可以通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯來破壞膽固醇穩(wěn)態(tài)和抑制慢性粒細(xì)胞白血?。╟hronic myelogenous leukemia，CML）細(xì)胞增殖。綜上所述酸堿位移結(jié)合噴霧干燥制備三元包合物為染料木素的開發(fā)提供了新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突