土木香內(nèi)酯抗病毒作用的體內(nèi)外研究

李藝穎，初英杰#，孔令東，謝 芳，何昱廷，劉 霞，李俊良，羅 政，周義翔，王 遙*

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，北京 100029

2.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京 100029

土木香是菊科植物土木香InulaheleniumL.的干燥根，為蒙醫(yī)常用清熱類藥，收錄于《中國(guó)藥典》2020 年版、《本草綱目拾遺》等[1]，其味苦、甘、辛，性平，具有解巴達(dá)干熱、清赫依血相訌、開胃止痛、溫中消食的功效，并作為多種蒙藥復(fù)方中主藥，用于瘟疫熱癥的治療。如四味土木香散為治療瘟病熱癥的經(jīng)典方和基礎(chǔ)方，于1977 年被載入《中國(guó)藥典》[2-5]。該方清瘟解表，用于瘟病初期發(fā)冷發(fā)熱、頭痛咳嗽、咽喉腫痛的治療。土木香內(nèi)酯是從土木香中提取出的倍半萜烯內(nèi)酯類小分子化合物，是《中國(guó)藥典》2020 年版中規(guī)定的土木香主要的藥效和質(zhì)量評(píng)價(jià)成分，分子式為C15H20O2。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，土木香內(nèi)酯對(duì)細(xì)菌、真菌具有明顯的抵抗活性，對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及枯草芽孢桿菌具有較佳的抑菌作用；土木香內(nèi)酯能夠通過(guò)抑制核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）和絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路發(fā)揮抗炎功能。然而，作為土木香主要活性成分的土木香內(nèi)酯，對(duì)其臨床相關(guān)的抗病毒感染作用與機(jī)制的研究仍未見報(bào)道，很大程度上限制了土木香及其活性成分藥用價(jià)值的提升。

抗病毒天然免疫反應(yīng)是宿主抵御病毒入侵的第一道防線[6]。病毒釋放基因組進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，宿主細(xì)胞通過(guò)模式識(shí)別受體（pattern recognition receptor，PRR）識(shí)別并結(jié)合病原體相關(guān)分子模式（pathogen associated molecular pattern，PAMP），將病毒入侵信號(hào)傳給接頭蛋白（MAVS/STING），進(jìn)而激活轉(zhuǎn)錄因子干擾素調(diào)節(jié)因子3（interferon regulatory factor 3，IRF3）和IRF7 轉(zhuǎn)位入核，啟動(dòng)I 型干擾素（type I interferon，IFN-I）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。環(huán)鳥苷酸-腺苷酸合酶（cyclic GMP-AMP synthase，cGAS）-STING 信號(hào)軸由第二信使cGAS 和干擾素基因STING 的環(huán)鳥苷酸-腺苷酸受體刺激物組成，可檢測(cè)致病DNA，以觸發(fā)先天免疫反應(yīng)，涉及針對(duì)微生物感染的強(qiáng)IFN-I 反應(yīng)[7]。在細(xì)胞質(zhì)中，視黃酸誘導(dǎo)基因-I 樣受體（retinoic acid-inducible gene I-like receptor，RLR）、視黃酸誘導(dǎo)基因-I（retinoic acid-inducible gene I，RIG-I）和黑色素瘤分化相關(guān)基因5（melanoma differentiation-associated gene 5，MDA5）感知與病毒感染相關(guān)的非典型RNA[8-9]，通過(guò)接頭分子MAVS觸發(fā)信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，翻譯產(chǎn)生IFN-I，干擾素分泌到細(xì)胞外，與細(xì)胞膜表面的干擾素受體[I 型干擾素受體1（type I interferon receptor 1，IFNAR1）、I 型干擾素受體2（type I interferon receptor 2，IFNAR2）]結(jié)合，激活JAK 激酶（Janus kinase，JAK）-信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）信號(hào)通路，并誘導(dǎo)大量干擾素刺激基因（interferon stimulated genes，ISGs）表達(dá)，這些ISGs 可在病毒生命周期的各個(gè)階段包括入侵、復(fù)制、裝配和釋放發(fā)揮廣泛的抗病毒作用[10]。

本研究通過(guò)構(gòu)建多種病毒感染的細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯對(duì)水皰性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）、甲型流感病毒（influenza A virus，H1N1）、腦心肌炎病毒（encephalomyocarditis virus，EMCV）等病毒復(fù)制的體外抑制作用。此外，通過(guò)構(gòu)建小鼠H1N1 病毒滴鼻感染模型，發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯能夠提高感染小鼠的存活率，降低肺組織中H1N1 的病毒載量。本研究利用分子生物學(xué)及免疫學(xué)研究手段，初步闡明土木香內(nèi)酯通過(guò)活化抗病毒天然免疫信號(hào)通路抵抗病毒復(fù)制的免疫藥理機(jī)制。為土木香及蒙藥四味土木香散的抗病毒臨床應(yīng)用提供了重要的科學(xué)數(shù)據(jù)支撐，為相關(guān)藥物未來(lái)的科學(xué)開發(fā)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料

1.1 細(xì)胞與病毒

人肺上皮細(xì)胞系A(chǔ)549 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)ATCC 公司；IFNAR1 敲除A549 細(xì)胞（Ifnar1?/?A549）由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[11]；小鼠原代成纖維MEF 細(xì)胞來(lái)源于本實(shí)驗(yàn)室凍存；VSV（印第安納株）、VSV-GFP、H1N1（PR8 株）、EMCV 均來(lái)自本實(shí)驗(yàn)室，病毒擴(kuò)增后置于?80 ℃保存。

1.2 動(dòng)物

SPF 級(jí)雄性C57BL/6 小鼠，6～8 周，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)自斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)許可證SCXK（京）2019-0010。動(dòng)物于室溫（23±2）℃、相對(duì)濕度40%～70%、晝夜交替照明的環(huán)境中飼養(yǎng)，自由進(jìn)食飲水。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批準(zhǔn)號(hào)BUCM-2023120501-4152）。

1.3 藥品與試劑

土木香內(nèi)酯（質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98.0%，批號(hào)PS1852-0025）購(gòu)自成都普思生物科技股份有限公司；達(dá)菲?磷酸奧司他韋膠囊（以?shī)W司他韋計(jì)75 mg/粒，批號(hào)0221906016）購(gòu)自宜昌長(zhǎng)江藥業(yè)有限公司；二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO，批號(hào)D4540）購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司；IFN 刺激性DNA（interferon stimulatory DNA，ISD，批號(hào)tlrl-isdn）、聚乙烯亞胺（PEI，批號(hào) BMS1003-A）、Trizol 試劑（批號(hào)15596018）均購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司；Evo M-MLV RT Kit（批號(hào)AG11711）、SYBR?Green Premix Pro Taq HS qPCR Kit（批號(hào)AG11701）購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司；DMEM 高糖培養(yǎng)基（批號(hào)C11995500CP）、青霉素-鏈霉素（10 000 U/mL，批號(hào)15140-122）、胎牛血清（批號(hào)2358184P）購(gòu)自美國(guó)Gibco 公司；0.25%胰蛋白酶/EDTA 細(xì)胞消化液（批號(hào)T1300）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；CCK-8 細(xì)胞增殖-毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)CK04）購(gòu)自東仁化學(xué)科技（上海）有限公司；VSV-G tag 重組抗體（ 批號(hào) ab183497 ）、H1N1 Influenza A virus Nucleocapsid protein（H1N1-NP）抗體（批號(hào)104870）購(gòu)自英國(guó)Abcam 公司；超敏ELC 發(fā)光液（批號(hào)WBKLS0500）購(gòu)自美國(guó)Millipore 公司；HRP 標(biāo)記的羊抗兔IgG 二抗（批號(hào)M21002）購(gòu)自艾比瑪特醫(yī)藥科技（上海）有限公司。

1.4 儀器

CytoFLEX 流式細(xì)胞儀（美國(guó)Beckman 公司）；CFX96 型熒光定量PCR 儀、T100 型PCR 儀、PowerPac 型基礎(chǔ)電泳儀（美國(guó)Bio-Rad 公司）；NANODROP ONEc 型分光光度計(jì)、Sorvall?Legend?Micro 21R 型微量離心機(jī)、300 Series A2 型生物安全柜、Heracell 150i 型CO2培養(yǎng)箱（美國(guó)Thermo 公司）；SpectraMax i3x 型多功能酶標(biāo)儀[美谷分子儀器（上海）有限公司]；Mill-Q 超純水儀（美國(guó)Millipore 公司）；ZHCH-C1115B 型超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器制造有限公司）；DK-8D 型電熱恒溫水槽（上海一恒科技有限公司）；SKL180-Pro 型數(shù)控線性搖床[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器（北京）股份公司]；EPS-300 型數(shù)顯式穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀（天能公司）；SCl-VS 型可調(diào)式混勻儀（美國(guó)Scilogex 公司）；1CKX53 型倒置顯微鏡（日本Olympus 公司）。

2 方法

2.1 藥物的配制

取土木香內(nèi)酯25 mg，加入1.076 1 mL DMSO，充分振蕩，37 ℃超聲60 min 后即為100 mmol/L 母液，分裝后儲(chǔ)存于?80 ℃?zhèn)溆谩８鶕?jù)具體使用濃度計(jì)算所需母液體積，按照一定比例用DMEM 完全培養(yǎng)基稀釋至使用濃度，充分渦旋振蕩后，加入細(xì)胞使用。

2.2 細(xì)胞活力測(cè)定

A549細(xì)胞以每孔2.5×104個(gè)的密度接種于96孔板，培養(yǎng)過(guò)夜使細(xì)胞完全貼壁；配制0.078 125、0.156 250、0.312 500、0.625 000、1.250 000、2.500 000、5.000 000、10.000 000、20.000 000、40.000 000、80.000 000 μmol/L 的土木香內(nèi)酯溶液加入細(xì)胞中，同時(shí)設(shè)置僅加入DMEM 的空白組（不含細(xì)胞）和0.1% DMSO溶劑對(duì)照組（含細(xì)胞），每孔設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔，于5%CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；培養(yǎng)24 h 后，每孔加入10 μL CCK-8 試劑孵育30 min，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 處吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。

細(xì)胞存活率＝(A給藥－A空白)/(A對(duì)照－A空白)

2.3 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)A549 細(xì)胞中VSV-GFP 病毒復(fù)制的影響

A549 細(xì)胞以每孔1.2×105個(gè)密度接種于24 孔板，培養(yǎng)過(guò)夜至細(xì)胞貼壁后，設(shè)置對(duì)照組、模型組和土木香內(nèi)酯（5、10、20 μmol/L）組，除對(duì)照組外，VSV-GFP 以 0.05 的感染復(fù)數(shù)（multiplicity of infection，MOI）感染各組細(xì)胞[11]，同時(shí)加藥共同孵育，對(duì)照組和模型組加入DMSO。孵育12 h 后用預(yù)冷PBS 清洗細(xì)胞2 次，加入100 μL 胰酶消化，收集細(xì)胞至流式管，采用流式細(xì)胞儀上機(jī)檢測(cè)GFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例。

2.4 熒光顯微鏡檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)A549 細(xì)胞中VSV-GFP 病毒復(fù)制的影響

細(xì)胞接種、分組同“2.3”項(xiàng)，除對(duì)照組外，VSVGFP 以MOI＝0.1 感染各組細(xì)胞[11]，同時(shí)加藥共同孵育，對(duì)照組和模型組加入DMSO。孵育24 h 后，采用熒光顯微鏡檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-GFP 的抑制作用。

2.5 qRT-PCR 檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)EMCV、H1N1 病毒mRNA 表達(dá)的影響

細(xì)胞接種、分組同“2.3”項(xiàng)，分別使用H1N1（MOI＝0.05）、EMCV（MOI＝3）感染細(xì)胞[11]，同時(shí)加藥共同孵育。共同孵育12 h 后，收集細(xì)胞，加入Trizol 試劑提取總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRT-PCR分析，檢測(cè)病毒基因的表達(dá)水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

2.6 Western blotting 檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-G 和H1N1-NP 蛋白表達(dá)的影響

收集不同濃度（5、10、20 μmol/L）土木香內(nèi)酯和不同時(shí)間（0、8、12、16 h）處理后的病毒感染細(xì)胞蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白濃度。蛋白樣品經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，封閉后，分別加入VSV-G 抗體（1∶3 000）和H1N1-NP 抗體（1∶1 500），4 ℃孵育過(guò)夜；室溫孵育二抗（1∶5 000），加入ECL 化學(xué)發(fā)光試劑，于凝膠成像儀中曝光顯影。

2.7 土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-GFP、H1N1 和EMCV 病毒復(fù)制周期的影響

細(xì)胞接種同“2.3”項(xiàng)，過(guò)夜培養(yǎng)后，設(shè)置對(duì)照組、模型組和土木香內(nèi)酯（5、10、20 μmol/L）組。土木香內(nèi)酯使用病毒感染前預(yù)處理12 h、病毒吸附2 h 過(guò)程中、病毒吸附后3 種不同方式給藥，加入VSV-GFP（MOI＝0.05）或H1N1（MOI＝0.05）或EMCV（MOI＝3）感染12 h，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-GFP 病毒復(fù)制的影響，通過(guò)qRTPCR 檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)EMCV、H1N1 病毒復(fù)制的影響。

2.8 RNA 測(cè)序及轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

MEF 細(xì)胞接種于12 孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入DMSO（對(duì)照組）或20 μmol/L 土木香內(nèi)酯處理12 h，收集細(xì)胞，加入Trizol 試劑提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄為 cDNA 進(jìn)行測(cè)序。使用 Hieff NGS Ultima Dualmode mRNA Library Prep Kit for Illumina（Yeasen Biotechnology Co.，Ltd.）產(chǎn)生測(cè)序文庫(kù)。文庫(kù)在Illumina NovaSeq 平臺(tái)上測(cè)序，產(chǎn)生150 bp 的成對(duì)端讀數(shù)。使用Hisat2 工具軟件與參考基因組進(jìn)行映射，并獲得每個(gè)樣本中基因的原始表達(dá)值。使用edgeR 進(jìn)行差異表達(dá)分析，錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR）＜0.05 且|log2FC|＞1 的基因被認(rèn)為是差異表達(dá)基因。

2.9 qRT-PCR 檢測(cè)土木香內(nèi)酯對(duì)ISGs mRNA 表達(dá)的影響

MEF 細(xì)胞以每孔1×105個(gè)的密度接種于12 孔板，培養(yǎng)過(guò)夜后，加入DMSO（對(duì)照組）或5、10、20 μmol/L 土木香內(nèi)酯處理12 h，收集細(xì)胞，加入Trizol 試劑提取總RNA 并合成cDNA，進(jìn)行qRTPCR 分析，檢測(cè)干擾素α1（interferon α1，Ifna1）、干擾素β1（interferon β1，Ifnb1）、干擾素誘導(dǎo)蛋白1（interferon-induced protein with tetratricopeptide repeats 1，Ifit1）、Isg15的mRNA 表達(dá)。引物序列見表1。

2.10 土木香內(nèi)酯對(duì)Ifnar1?/? A549 細(xì)胞中VSVGFP、H1N1、EMCV 病毒復(fù)制的影響

A549 細(xì)胞和Ifnar1?/?A549 細(xì)胞分別以每孔1.2×105個(gè)密度接種于24 孔板，培養(yǎng)過(guò)夜至細(xì)胞貼壁后，設(shè)置對(duì)照組、模型組和土木香內(nèi)酯（5、10、20 μmol/L）組，使用VSV（MOI＝0.05）、EMCV（MOI＝3）、H1N1（MOI＝0.05）感染細(xì)胞[11]，同時(shí)加藥共同孵育。共同孵育12 h 后，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)A549 細(xì)胞和Ifnar1?/?A549 細(xì)胞中給予土木香內(nèi)酯對(duì)GFP 陽(yáng)性細(xì)胞比率的影響，或者通過(guò)qRTPCR 檢測(cè)這2 種細(xì)胞中給予土木香內(nèi)酯對(duì)H1N1 和EMCV 病毒復(fù)制的影響。

2.11 土木香內(nèi)酯對(duì)流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用

將小鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、土木香內(nèi)酯（30 mg/kg）組和磷酸奧司他韋膠囊（40 mg/kg）組，每組10 只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后，除對(duì)照組外，其余小鼠于實(shí)驗(yàn)第0 天滴鼻接種H1N1 病毒（50 μL/只）建立流感病毒感染小鼠模型。各給藥組ig 相應(yīng)藥物，對(duì)照組和模型組ig 生理鹽水，1 次/d，連續(xù)14 d。給藥組小鼠第7 天每組隨機(jī)選取5 只小鼠處死，采集小鼠肺組織，經(jīng)Trizol 法提取總RNA，qRT-PCR檢測(cè)肺組織中H1N1的mRNA 表達(dá)水平。統(tǒng)計(jì)各組剩余小鼠存活天數(shù)及死亡數(shù)，計(jì)算存活率。

2.12 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

數(shù)據(jù)用GraphPad Prism 軟件進(jìn)行可視化處理，以±s表示，兩組樣本間通過(guò)雙尾非配對(duì)t檢驗(yàn)進(jìn)行比較，多組樣本間通過(guò)單因素方差分析進(jìn)行比較。

3 結(jié)果

3.1 土木香內(nèi)酯對(duì)A549 細(xì)胞存活率的影響

通過(guò)CCK-8 法檢測(cè)不同濃度的土木香內(nèi)酯處理24 h 后，對(duì)A549 細(xì)胞存活率的影響，計(jì)算得到半數(shù)抑制濃度（half inhibitory concentration，IC50）為79.63 μmol/L（圖1）。后續(xù)選取無(wú)明顯細(xì)胞毒性的低、中、高濃度（5、10、20 μmol/L）進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖1 土木香內(nèi)酯結(jié)構(gòu)式 (A) 及其對(duì)A549 細(xì)胞存活率 (B) 的影響 (±s, n = 3)Fig.1 Structure of alantolactone (A) and its effect on survival rate (B) of A549 cells (±s, n = 3)

3.2 土木香內(nèi)酯對(duì)VSV 病毒復(fù)制的影響

如圖2-A 所示，與對(duì)照組比較，VSV-GFP 感染引起了A549 細(xì)胞GFP 陽(yáng)性細(xì)胞比例的增加（P＜0.001）；與模型組比較，土木香內(nèi)酯呈劑量相關(guān)性地減少了GFP 陽(yáng)性細(xì)胞的比例（P＜0.001），尤其在濃度為20 μmol/L 時(shí)抑制病毒復(fù)制的效果顯著，GFP陽(yáng)性細(xì)胞即被感染細(xì)胞的比例降低至5.74%。隨后，使用熒光顯微鏡檢測(cè)了土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-GFP 感染的細(xì)胞綠色熒光強(qiáng)度的影響，如圖2-B 所示，與模型組比較，土木香內(nèi)酯可以顯著抑制VSV-GFP 的熒光強(qiáng)度（P＜0.001）；此外，檢測(cè)了土木香內(nèi)酯對(duì)野生型VSV 的抑制作用，如圖2-C、D 所示，與模型組比較，土木香內(nèi)酯在劑量和時(shí)間梯度上降低了VSV-G 蛋白表達(dá)。表明土木香內(nèi)酯能夠在細(xì)胞水平有效抑制VSV 的復(fù)制。

圖2 土木香內(nèi)酯對(duì)A549 細(xì)胞中VSV 病毒復(fù)制的抑制作用 (±s, n = 3)Fig.2 Inhibition of alantolactone on VSV replication in A549 cells (±s, n = 3)

3.3 土木香內(nèi)酯對(duì)EMCV、H1N1 病毒復(fù)制的影響

為了探究土木香內(nèi)酯對(duì)不同病毒的抑制作用，利用EMCV、H1N1 感染A549 細(xì)胞，同時(shí)加入土木香內(nèi)酯處理12 h。通過(guò)qRT-PCR 技術(shù)檢測(cè)病毒基因拷貝情況，如圖3-A、B 所示，與對(duì)照組比較，模型組病毒基因的拷貝數(shù)均顯著升高（P＜0.001）；與模型組比較，土木香內(nèi)酯組病毒基因的拷貝數(shù)均顯著降低（P＜0.001）。如圖3-C 所示，土木香內(nèi)酯在劑量和時(shí)間梯度上明顯抑制了H1N1-NP 蛋白表達(dá)，表明土木香內(nèi)酯顯著抑制EMCV、H1N1 病毒的復(fù)制。

圖3 土木香內(nèi)酯對(duì)A549 細(xì)胞中H1N1、EMCV 病毒復(fù)制的抑制作用 (±s, n = 3)Fig.3 Inhibition of alantolactone on H1N1, EMCV replication in A549 cells (±s, n = 3)

3.4 土木香內(nèi)酯作用于VSV-GFP、EMCV、H1N1病毒復(fù)制周期的多個(gè)階段

為了探究土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒復(fù)制周期不同階段的影響，設(shè)置了不同的加藥方式（圖4-A），分別對(duì)細(xì)胞進(jìn)行了預(yù)處理、病毒吸附過(guò)程中給藥、病毒吸附后給予土木香內(nèi)酯。結(jié)果表明，預(yù)處理給予土木香內(nèi)酯處理方式下，與模型組比較，土木香內(nèi)酯預(yù)給藥組可以抑制VSVGPF、EMCV、H1N1 病毒復(fù)制（P＜0.01、0.001，圖4-B、E、H）；在病毒吸附的過(guò)程中給藥時(shí)，與模型組比較，病毒復(fù)制水平?jīng)]有顯著性變化（圖4-C、F、I）；在病毒吸附后給藥，與模型組比較，土木香內(nèi)酯可以顯著抑制VSV-GPF、EMCV、H1N1 病毒復(fù)制（P＜0.01、0.001，圖4-D、G、J）。上述結(jié)果表明，土木香內(nèi)酯對(duì)VSV-GFP、EMCV 和H1N1 病毒的吸附過(guò)程沒(méi)有影響，而預(yù)處理或吸附后給藥可以顯著抑制VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒復(fù)制。

圖4 土木香內(nèi)酯在病毒復(fù)制周期不同階段給藥對(duì)VSV-GFP、EMCV、H1N1 病毒復(fù)制的影響 (±s, n = 3)Fig.4 Effect of alantolactone administration at different stages of virus replication cycle on VSV-GFP, EMCV, H1N1 virus replication (±s, n = 3)

3.5 土木香內(nèi)酯誘導(dǎo)抗病毒天然免疫信號(hào)通路激活

為了探究土木香內(nèi)酯抵抗病毒復(fù)制的分子機(jī)制，對(duì)土木香內(nèi)酯處理的MEF 細(xì)胞進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄組學(xué)測(cè)序分析。如圖5-A 所示，與對(duì)照組比較，土木香內(nèi)酯處理誘導(dǎo)了549 個(gè)差異表達(dá)基因，其中包含367 個(gè)上調(diào)基因、182 個(gè)下調(diào)基因。值得注意的是，幾種與抗病毒IFN-I 通路相關(guān)的基因被顯著上調(diào)，如Ifna1、Ifnb1、Ifit44、Isg15、Ifit1等。通過(guò)對(duì)差異基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，結(jié)果顯示病毒感染和抗病毒天然免疫相關(guān)的通路被顯著富集，主要包括EB 病毒感染、甲流病毒感染和Toll 樣受體信號(hào)通路等（圖5-B）。基于基因表達(dá)值的GSEA 分析發(fā)現(xiàn)（圖5-C），土木香內(nèi)酯處理組顯著富集到與抗病毒天然免疫反應(yīng)相關(guān)的IFN-α 信號(hào)通路。上述結(jié)果提示，土木香內(nèi)酯可能通過(guò)激活細(xì)胞內(nèi)的抗病毒天然免疫信號(hào)通路，發(fā)揮抗病毒功能。

圖5 土木香內(nèi)酯處理細(xì)胞的生物信息學(xué)分析 (A)、KEGG 通路分析 (B) 和GSEA (C)Fig.5 Bioinformatics analysis of alantolactone-treated cells (A), KEGG pathway analysis (B) and GSEA (C)

3.6 土木香內(nèi)酯通過(guò)激活I(lǐng)FN-I 信號(hào)通路發(fā)揮抗病毒作用

藥物處理細(xì)胞的生物信息學(xué)分析結(jié)果提示，土木香內(nèi)酯的抗病毒功能與宿主抗病毒天然免疫應(yīng)答的核心信號(hào)通路IFN-I 信號(hào)通路高度相關(guān)。因此，檢測(cè)了土木香內(nèi)酯處理MEF 細(xì)胞中ISGs（Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15）的表達(dá)情況。如圖6 所示，與對(duì)照組比較，土木香內(nèi)酯處理顯著誘導(dǎo)Ifna1、Ifnb1、Ifit1、Isg15的mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.001）。表明土木香內(nèi)酯單獨(dú)藥物處理有效促進(jìn)IFN-I 的表達(dá)，并誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因Ifit1、Isg15等的表達(dá)。

圖6 土木香內(nèi)酯對(duì)MEF 細(xì)胞IFN-I 通路中相關(guān)基因表達(dá)的影響 (±s, n = 3)Fig.6 Effect of alantolactone on expressions of related genes in IFN-I pathway of MEF cells (±s, n = 3)

3.7 Ifnar1?/? A549 細(xì)胞中土木香內(nèi)酯對(duì)病毒復(fù)制的影響

IFNAR1 是細(xì)胞表面IFN 的重要受體，其與IFN結(jié)合后可激活下游JAK-STAT 信號(hào)通路。因此，利用IFNAR1 敲除A549 細(xì)胞（Ifnar1?/?A549）探究土木香內(nèi)酯發(fā)揮抗病毒作用與IFN-I 信號(hào)通路的依賴關(guān)系。qRT-PCR 結(jié)果顯示，與野生型細(xì)胞（A549細(xì)胞）相比，在Ifnar1?/?A549 細(xì)胞中土木香內(nèi)酯對(duì)VSV、EMCV 和H1N1 病毒的抑制功能被顯著削弱。上述結(jié)果表明，土木香內(nèi)酯的抗病毒功能部分依賴IFN-I 信號(hào)通路（圖7）。

圖7 土木香內(nèi)酯對(duì)Ifnar1?/? A549 細(xì)胞中VSV、EMCV、H1N1 病毒復(fù)制的影響 (±s, n = 3)Fig.7 Effect of alantolactone on VSV, EMC and H1N1 virus replication in Ifnar1?/? A549 cells (±s, n = 3)

3.8 土木香內(nèi)酯對(duì)流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用

如圖8-A 所示，模型組小鼠在感染后第8 天開始出現(xiàn)死亡，到第10 天全部死亡。而磷酸奧司他韋膠囊組和土木香內(nèi)酯組的生存率分別為60%和80%，表明土木香內(nèi)酯提高流感病毒感染小鼠的生存率。如圖8-B 所示，在病毒感染后第7 天檢測(cè)小鼠肺組織流感病毒載量，與模型組比較，土木香內(nèi)酯給藥組小鼠肺臟中H1N1病毒mRNA 表達(dá)顯著降低（P＜0.001），表明土木香內(nèi)酯在體內(nèi)抑制流感病毒的復(fù)制。

圖8 土木香內(nèi)酯對(duì)流感病毒感染小鼠的保護(hù)作用 (±s, n = 5)Fig.8 Protective effect of alantolactone on influenza virus-infected mice (±s, n = 5)

4 討論

土木香是菊科植物土木香I.heleniumL.的干燥根，又名黃花菜，始載于《本草圖經(jīng)》，土木香性微溫，味辛苦，無(wú)毒，入肺、肝、脾三經(jīng)。有健脾和胃、行氣止痛之效，臨床用于治胸腹脹滿疼痛、嘔吐泄瀉、痢疾、瘧疾等。土木香中主要的化學(xué)成分是倍半萜內(nèi)酯類，包括土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、土木香醇、土木香酸、二氫土木香內(nèi)酯等。其中土木香內(nèi)酯和異土木香內(nèi)酯是《中國(guó)藥典》土木香質(zhì)量評(píng)價(jià)的對(duì)照品成分[12]。土木香內(nèi)酯的藥理作用包括抗菌、抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)痛、保肝等[1,13-18]。然而，土木香內(nèi)酯作為土木香中主要藥效和質(zhì)量評(píng)價(jià)成分，關(guān)于其臨床應(yīng)用、治療由病毒感染引發(fā)的瘟疫熱癥的藥理作用及機(jī)制研究匱乏，限制了土木香及其活性成分藥用價(jià)值提升和藥物研發(fā)。

VSV、H1N1 和EMCV 病毒是抗病毒研究中常用的RNA 模式病毒[19-22]，因此本研究利用流式細(xì)胞術(shù)、qRT-PCR 等技術(shù)證明了土木香內(nèi)酯可在細(xì)胞水平抑制VSV-GFP、H1N1 和EMCV 病毒復(fù)制，并發(fā)現(xiàn)土木香內(nèi)酯預(yù)處理和在病毒吸附后處理其抗病毒效應(yīng)最優(yōu)，這提示土木香內(nèi)酯可能通過(guò)影響宿主細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)因素發(fā)揮抗病毒功能。通過(guò)生物信息學(xué)分析結(jié)合qRT-PCR 驗(yàn)證土木香內(nèi)酯單獨(dú)處理可誘導(dǎo)IFN-I 編碼基因Ifna1、Ifnb1表達(dá)，并同時(shí)誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因Ifit1、Isg15表達(dá)，即土木香內(nèi)酯可直接激活細(xì)胞IFN-I信號(hào)通路。接著在Ifnar1?/?A549細(xì)胞中證明土木香內(nèi)酯抗病毒功能與IFN 通路的部分依賴關(guān)系。此外，土木香內(nèi)酯在H1N1 感染的小鼠模型中表現(xiàn)出提升小鼠生存率、降低肺組織病毒載量的作用。

IFN 是對(duì)病毒感染的先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵效應(yīng)因子。通過(guò)結(jié)合IFNAR 誘導(dǎo)下游ISGs 的表達(dá)。這些ISGs基因能夠抑制病毒復(fù)制和促進(jìn)病毒清除[23]。本研究結(jié)果表明，藥物處理細(xì)胞后抗病毒通路相關(guān)的基因包括Ifna1、Ifnb1、Ifi44、Isg15、Ifit1被顯著上調(diào)。其中，IFIT 蛋白在人體內(nèi)包含4 個(gè)家族成員（IFIT1、IFIT2、IFIT3 等）[24-25]，在病毒感染或IFNs誘導(dǎo)后，IFIT 家族蛋白能夠與其他家族蛋白以及數(shù)種RNA 結(jié)合蛋白形成復(fù)合體，從而清除病毒[24]。ISG15 編碼的蛋白ISG15 是一個(gè)類泛素蛋白，該家族蛋白能夠與IFN 誘導(dǎo)的抗病毒因子如蛋白激酶R（protein kinase R，PKR）、三磷酸鳥苷（guanosine triphosphate，GTP）酶MxA、HuP 家族結(jié)合將靶蛋白ISG化，從而促進(jìn)這些抗病毒因子的表達(dá)活性[25]。

綜上，本研究表明土木香內(nèi)酯通過(guò)激活I(lǐng)FN-I通路誘導(dǎo)干擾素誘導(dǎo)基因表達(dá)，在體內(nèi)外發(fā)揮抵抗病毒復(fù)制的作用。為土木香及蒙藥四味土木香散的抗病毒研究提供扎實(shí)的科學(xué)數(shù)據(jù)支持，并為其臨床應(yīng)用提供重要的科學(xué)理論支撐。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突