HPLC-ELSD法同時測定電子煙煙液中的10種甜味劑

葉智蓮，楊文武，況利平

(深圳市吉邇科技有限公司喜馬拉雅實驗室，廣東 深圳 518000)

電子煙是指用于產生氣溶膠供人抽吸的電子傳輸系統[1]。電子煙煙液是配合電子煙煙具使用的霧化物，主要化學成分有煙堿、丙二醇、丙三醇及各類香精香料，不同風味的煙液成分十分復雜[2-3]。甜味劑的應用促進了電子煙水果口味的發展，受到廣大電子煙消費者的追捧[4]。為了克服單一甜味劑的局限性，一般采用甜味劑復配，起到增強甜味和風味，彌補或掩蔽不良口味的作用[5]。甜味劑用量過大，電子煙煙液在霧化過程中會容易出現“糊味”，這與甜味劑的分子量大小、甜味劑純度、霧化溫度、霧化芯材料及結構等因素相關[6]。合理使用甜味劑是安全的，不會對消費者的健康產生風險，但超限量、超范圍，或者使用劣質的人工合成甜味劑，會對消費者的身體健康產生一定的負面影響[7-8]。過度攝入可能會出現皮膚問題、情緒波動、呼吸不暢，導致頭痛、癲癇、過敏等癥狀[9]。甜味劑經過電子煙煙具霧化后產生的氣溶膠比傳統食品等經口攝入方式更為復雜，因此甜味劑的選擇、使用劑量的安全檢測評估極為必要。

甜味劑的檢測方法有分光光度法、高效液相色譜法、離子色譜法、液相色譜-質譜法和氣相色譜法等[10]。目前，電子煙煙液中多種甜味劑的檢測主要采取高效液相色譜串聯質譜法，如廖惠云等[11]采用SPE-HPLC-MS/MS同時測定電子煙煙液中9種甜味劑；楊飛等[12]采用UPLC-MS/MS同時測定電子煙煙液中安賽蜜等5種合成甜味劑。液相色譜串聯質譜儀方法的儀器昂貴、維護成本高。HPLC-ELSD不需要化合物具有發色團或者熒光基團的光學特性，適用領域廣，方法操作簡單，分析時間短，靈敏度高。本研究建立電子煙煙液中常用甜味劑的檢測方法，為電子煙中甜味劑復配和風味開發提供技術支持，同時適用于對電子煙煙液中甜味劑的批量檢測。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

11款不同水果口味的電子煙煙液(均購自國外市場)，編號為：Y1—Y11，其中Y1、Y2為草莓香蕉味；Y3、Y4為藍莓樹莓味；Y5、Y6為草莓味；Y7、Y8為富士蘋果味；Y9為藍莓覆盆子檸檬味；Y10為桃子味；Y11為西瓜味。

安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、愛德萬甜(純度≥98%，上海安譜實驗科技股份有限公司)；阿力甜、紐甜、新甲基橙皮苷二氫查爾酮(純度≥98%，壇墨質檢科技股份有限公司)；羅漢果苷V(純度≥98%，上海麥克林生化科技有限公司)；甲醇、乙腈(HPLC級，壇墨質檢科技股份有限公司)；甲酸、三乙胺、乙酸銨(HPLC級，上海安譜實驗科技股份有限公司)；試驗用水為實驗室自制超純水。

1.2 儀器設備

高效液相色譜儀(LC-2050C 3D) (日本島津公司)；蒸發光散射檢測器(ELSD-16) (日本島津公司)；氮氣發生器(上海析維醫療科技有限公司)；電子天平(上海奧豪斯儀器有限公司)；超聲波清洗儀(深圳潔盟技術股份有限公司)；高速離心機(安徽中科中佳科學儀器有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 標準溶液配制

混合標準儲備液的配制：分別精密稱取安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿力甜、紐甜、阿斯巴甜、NHDC、愛德萬甜、羅漢果苷V各 100 mg，置于 10 mL 容量瓶中。用50%甲醇水定容至刻度線，得到各甜味劑質量濃度均為 10 mg/mL 的混合標準儲備液。

混合標準工作溶液的配制：分別移取混合標準儲備液5、10、25、50、100、250 μL 至6個 10 mL 的容量瓶中，用50%甲醇水稀釋并定容，制得不同質量濃度的標準工作溶液。標準工作溶液中10種甜味劑的質量濃度分別均為5、10、25、50、100、250 mg/L。

1.3.2 樣品前處理

精密稱取 0.5 g 樣品于 10 mL 容量瓶中，加入50%甲醇水定容至刻度線，渦旋振蕩混勻，超聲 20 min，高速離心后，提取液經 0.22 μm 濾膜過濾，取續濾液分析。

1.3.3 色譜條件

色譜柱：HPLC column Shim-pack GIST C18(250 mm×4.6 mm；5 μm)或者等效柱；柱溫：35 ℃；進樣量：15 μL；流速：1 mL/min；流動相A：0.1%甲酸水(用三乙胺調pH=4.5)；流動相B：甲醇；洗脫梯度：0～5 min 80%A，5～10 min 50%A，10～25 min 25%，25～26 min 80%A，26～30 min 80%A。ELSD檢測器：漂移管溫度：40 ℃；載氣流量：3.00 L/min；壓力：0.375 MPa；霧化氣體：氮氣。

2 結果與討論

2.1 液相色譜條件的確定

通過調整流動相流速和配比來優化10種甜味劑的分離度。當流速為 1 mL/min，按照上述洗脫梯度，可以使10種甜味劑得到很好的分離，并且可以有效避開電子煙煙液的干擾峰和磺胺類甜味劑(安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素)的特征峰，得到較為滿意的分離度，如圖1、圖2所示。

1.安賽蜜；2.糖精鈉；3.甜蜜素；4.三氯蔗糖；5.阿斯巴甜；6.阿力甜；7.新甲基橙皮苷二氫查爾酮；8.愛德萬甜；9.羅漢果苷V；10.紐甜。

1.安賽蜜；2.糖精鈉；3.甜蜜素；4.三氯蔗糖；5.阿斯巴甜；6.阿力甜；7.新甲基橙皮苷二氫查爾酮；8.愛德萬甜；9.羅漢果苷V；10.紐甜。

2.2 流動相的確定

實驗考察了甲醇、乙腈作為流動相有機相的差異，用乙腈作為有機相，易導致出峰時間相近的兩個組分共同流出，分離效果不佳，因此選擇甲醇作為有機相。通過不同水相的選擇，改變流動相體系，考察不同流動相體系對分離效果的影響，對比了甲醇-水、甲醇-0.1%甲酸水、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨(含0.1%甲酸)等不同體系下目標化合物的色譜峰強度、峰形和分離效果。結果表明：以水作為水相時，安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素不出峰，可能與三種化合物均呈堿性有關，容易在C18柱上吸附，難以洗脫，而且紐甜的峰形矮胖。以甲醇-5 mmol/L 乙酸銨、甲醇-5 mmol/L 乙酸銨(含0.1%甲酸)作為水相時，甜蜜素均出現拖尾現象且峰形矮胖；安賽蜜、糖精鈉的分離度變差。為了延長色譜柱的使用壽命，減少銨鹽的使用，本研究對0.1%甲酸水進行pH值調試進而改善峰形、色譜峰強度和分離度；分別將0.1%甲酸水的pH值用三乙胺調節成3.0、4.0、4.5、5.0、7.5，隨著pH值升高，安賽蜜作為第一個出峰的物質，出峰時間從 3.5 min 推移到 4.8 min，當pH值升至4.5后，甜蜜素的拖尾現象得到完全解決，三氯蔗糖和阿斯巴甜、愛德萬甜和羅漢果苷V得到很好的分離效果，而且多種甜味劑的色譜峰強度達到最高，見圖3。因此，確定甲醇-0.1%甲酸水溶液(pH=4.5)作為流動相，10種甜味劑得到很好的分離效果，并且可以跟電子煙煙液的其他雜質峰、3種磺胺類甜味劑的特征峰完全分離，10種甜味劑混合標準溶液色譜圖見圖1。

圖3 流動相pH值對目標化合物色譜峰強度的影響

2.3 ELSD檢測器參數的確定

影響ELSD的主要參數有漂移管溫度和載氣流量。參照ELSD-16型號的使用要求，進氣口最大壓力≤0.5 MPa，調節氮氣發生器的閥門，使氮氣的壓力在推薦使用范圍0.35～0.4 MPa 之間，調節至 0.375 MPa。ELSD中漂移管的溫度設置在30～80 ℃ 之間，可以根據流動相的成分而定。漂移管溫度設置低時，流動相得不到充分揮發，背景噪聲增加；漂移管溫度設置過高時，流動相沸騰，背景噪聲也會增加，同時可能會造成部分熱敏性物質的分解或揮發。通過調整載氣流量分別為2.5、3.0、3.5 L/min 和漂移管溫度分別為35、40、45、50 ℃。實驗表明，載氣流量和漂移管溫度對組分的保留時間基本沒有影響，選擇載氣流量為 3.0 L/min 和漂移管溫度為 40 ℃ 時，噪聲小、靈敏度高、色譜圖基線平穩，滿足實驗要求。

2.4 標準曲線、線性范圍和檢出限

在1.3.3條件下，將配制的系列標準溶液分別進樣 15 μL 進行分析測試，以峰面積為縱坐標，以標準溶液的質量濃度為橫坐標，繪制二次曲線，即：y=ax2+bx+c。以信噪比(S/N)為3時的進樣質量濃度為各種甜味劑的檢出限(LOD)，以信噪比(S/N)為10時的進樣質量濃度為各種甜味劑的定量限(LOQ)。結果表明，各種甜味劑在5～250 mg/L 的質量濃度范圍內線性關系良好，相關系數大于0.998，可以滿足定量分析的要求，見表1。

表1 10種甜味劑的標準工作曲線、相關系數、檢出限和定量限

2.5 方法準確度和精密度

選取一款在售的電子煙煙液，通過對樣品進行加標回收來驗證方法的準確度。分別進行低、中、高三水平的加標實驗，每個水平進行重復測試6次，計算樣品中各種甜味劑的回收率和RSD，通過回收率和RSD評價該方法的準確度和精密度，結果見表2。回收率在90.0%～110.0%，RSD在0.774%～7.65%，表明該方法有較好的準確度和重復性，能夠滿足測試需求。

表2 不同質量濃度下10種甜味劑的加標回收與精密度試驗

2.6 樣品實測分析

對市場上11款不同口味的電子煙煙液進行2次平行實驗，結果見表3。常應用于電子煙的甜味劑有三氯蔗糖、紐甜等，含量一般在0.5%以下，其它類型的甜味劑應用較少，可能與樣本量較少、三氯蔗糖和紐甜的甜度、風味較好相關。甜味劑復配可能帶來多種風味，并且創造新穎的口感，以滿足不同消費者的需求。

表3 11款電子煙樣品中甜味劑含量的測定結果 ρ/(mg·g-1)

3 結論

建立了HPLC-ELSD同時測定電子煙煙液中的安賽蜜、糖精鈉、甜蜜素、三氯蔗糖、阿斯巴甜、阿力甜、新甲基橙皮苷二氫查爾酮、愛德萬甜、羅漢果苷V、紐甜的檢測方法。10種甜味劑在5～250 mg/L 范圍內線性良好，相關系數高于0.998，回收率在90.0%～110.0%，RSD在0.774%～7.65%，具有良好的重現性和穩定性。該方法實驗步驟簡單、分析時間短，改善了部分標準方法中只能滿足單種或者幾種甜味劑檢測的不足，為電子煙煙液中甜味劑的篩查和檢測提供了準確、可靠的分析方法，能夠滿足實驗室的日常檢測需求。