分光光度法測定湖泊水中葉綠素a含量的研究

趙榮龍 梁欣欣 吳玉萍 崔丹 張玲

摘 要：葉綠素a含量是評價(jià)水體富營養(yǎng)化水平的重要依據(jù)，水體營養(yǎng)化程度過高會影響水生生物的生存和繁殖，導(dǎo)致水體生態(tài)系統(tǒng)紊亂，生物多樣性受到破壞。葉綠素a幾乎是所有浮游植物類別都含有的葉綠素類型。所以，葉綠素a含量既是水體富營養(yǎng)化的判斷標(biāo)準(zhǔn)，又是浮游植物現(xiàn)存量的重要推斷依據(jù)。水體富營養(yǎng)化是我國當(dāng)前水環(huán)境面臨的主要問題。為闡明分光光度法測定水體中葉綠素a含量結(jié)果的快速性和準(zhǔn)確性，本研究用研磨機(jī)代替手工研磨進(jìn)行樣品制備，用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行加標(biāo)測定。結(jié)果顯示葉綠素a檢測值符合標(biāo)準(zhǔn)要求。

關(guān)鍵詞：分光光度法，水體，葉綠素a

DOI編碼：10.3969/j.issn.1002-5944.2024.07.041

0 引 言

葉綠素a的含量是評價(jià)水體富營養(yǎng)化水平的重要依據(jù)，通過葉綠素a的含量可以估算出水體中浮游植物生物量[1-2]。浮游植物存量過高會造成水體的透明度降低，陽光難以穿透水面阻礙水體中植物進(jìn)行光合作用，植物本身的呼吸作用會導(dǎo)致水體中氧氣被消耗，所以造成水體局部缺氧，而水體表面的浮游植物通過光合作用又會釋放大量氧氣，這樣會形成水體中缺氧，水面氧氣過飽和的情況，水生動物（如魚類）會因?yàn)槿毖醵劳?；浮游植物生物量過高還會造成底層浮游生物堆積，在厭氧條件下分解發(fā)酵產(chǎn)生有害氣體和毒素，傷害水生生物[3]；營養(yǎng)化程度高的水體中含有大量的硝酸鹽和亞硝酸鹽，高含量硝酸鹽和亞硝酸鹽水體對人類和其他動物飲用水安全有很大危害。所以，如何快速、準(zhǔn)確地檢測水體中葉綠素a含量并對水體中葉綠素a含量進(jìn)行合理控制，這對保護(hù)水資源、改善水環(huán)境尤為重要。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器和材料

玻璃纖維濾膜（孔徑：0.45 μm）。

離心管（PTFE材質(zhì)15 mL）。

研磨珠（材質(zhì)：氧化鋯；規(guī)格：5 mm）。

Tiss-24多樣品組織研磨機(jī)（上海凈信實(shí)業(yè)發(fā)展有限公司）。

DT5-1低速臺式離心機(jī)（北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司）。

D R 2 8 0 0 便攜式可見分光光度計(jì)（美國哈希）。

針式濾器（直徑：25 mm；孔徑：0.45 μm）。

比色皿（1 cm）。

1.2 試劑

丙酮：GR（西隴科學(xué)）。

丙酮溶液（配比9+1：9 0 0 m L丙酮+10 0 m L純水）。

葉綠素a溶液標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（含量：10 0±3% μg /mL；產(chǎn)品編號：BW91697-01，北京普析標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)有限公司）。

葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)中間液：ρ（葉綠素a）=1.00 μg/mL。

移取1.00 mL葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)貯備液于100 mL容量瓶中，用丙酮稀釋至標(biāo)線，混勻。

1.3 樣品

1.3.1 樣品的采集

采集分析葉綠素a樣品的水樣可以使用500 mL的玻璃瓶作為采樣瓶，在距離水面0.5 m的地方進(jìn)行水樣采集，如果水深不足0.5 m時(shí)采集距離水面中部的水樣。如果有泥沙和其他雜物時(shí)應(yīng)將水樣靜止30min后取水面下5 ㎝的水樣作為分析樣品。水樣采集完畢宜盡快送實(shí)驗(yàn)室。

1.3.2 樣品的制備

用量筒準(zhǔn)確量取水樣100 mL，將水樣倒入事先準(zhǔn)備好帶濾膜的過濾裝置上進(jìn)行抽濾，注意抽濾時(shí)負(fù)壓不要過大以免抽破濾膜。待抽濾快結(jié)束時(shí)用水清洗抽濾器內(nèi)壁，抽濾結(jié)束后取出濾膜，撕去多余空白濾膜然后將有抽濾物的部分對折放入離心管中。在每個(gè)離心管中加入一顆研磨珠，將抽濾物和研磨珠壓至離心管底部，用分液器在每支離心管中定量加入丙酮溶液10 mL蓋上蓋子，將離心管移至多樣品組織研磨機(jī)上充分研磨5 min。取出離心管移至離心機(jī)以轉(zhuǎn)速3000 r/min的速度離心10 min，取出離心管用紙包好放入0～4℃的冰箱中避光浸泡提取2 h。以實(shí)驗(yàn)室用水代替樣品做空白實(shí)驗(yàn)。

1.4 分析

打開分光光度計(jì)電源并預(yù)熱15 min，以丙酮溶液進(jìn)行儀器調(diào)零。用針式濾器將浸泡提取好的樣品過濾至比色皿中在波長750 nm、664 nm、647 nm、630 nm處測量并記錄吸光度。波長750 nm處吸光度測量值應(yīng)小于0.005，測定值不滿足要求時(shí)需檢查比色皿中樣品是否存在氣泡，如有必要進(jìn)行二次過濾后測定。

結(jié)果計(jì)算[4]，按照實(shí)驗(yàn)流程首先計(jì)算出定容后提取液中葉綠素a的質(zhì)量濃度為：

然后再計(jì)算出水樣中葉綠素a的質(zhì)量濃度為：

式中：

ρ1——水樣的葉綠素a質(zhì)量濃度，μg/L；

ρ2——提取液的葉綠素a質(zhì)量濃度，mg/L；

A 664——提取液在664 nm波長測定的吸光度；

A 647——提取液在647 nm波長測定的吸光度；

A 630——提取液在630 nm波長測定的吸光度；

A 750——提取液在750 nm波長測定的吸光度；

V1——提取液定容體積，mL；

δ——比色皿光程，cm；

V——水樣體積，L。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析結(jié)果

2.1.1 準(zhǔn)確度

為驗(yàn)證本方法的準(zhǔn)確度對滇池某采樣點(diǎn)（葉綠素a含量：79 ug/L）的水樣進(jìn)行6次加標(biāo)平行檢測，在每個(gè)樣品中加入1.00 ug/mL的葉綠素a標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)0.50 mL。計(jì)算該樣品的加標(biāo)回收率，結(jié)果顯示加標(biāo)回收率為78.00%～106.0%，見表1。

2.1.2 精密度

為驗(yàn)證本方法的精密度分別對滇池某采樣點(diǎn)A（葉綠素a含量：27 ug/L）和樣點(diǎn)B（葉綠素a含量：46 ug/L）的水樣各進(jìn)行10次平行檢測，計(jì)算該樣品分析結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），結(jié)果顯示相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在1.0%～6.0%之間，見表2。

2.2 方法注意事項(xiàng)

（1）丙酮溶液的配制要嚴(yán)格按照90 mL丙酮+10 mL純水的比例進(jìn)行配制，否則在測試過程中可能會造成吸收峰的漂移，影響檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

（2）葉綠素a見光易分解，實(shí)驗(yàn)過程中浸泡提取要注意避光操作。

（3）抽濾的過程中要避免因?yàn)槌闉V壓力過大而造成葉綠素a的損失，因?yàn)檫^大的抽濾壓力會造成樣品細(xì)胞被破壞或穿透濾膜。

（4）為保證浮游植物能夠被充分研磨，研磨時(shí)間至少應(yīng)保證5 min以上，研磨充分的樣品比較容易提取和分離。

3 結(jié) 語

提高工作效率，降低工作負(fù)荷和勞動強(qiáng)度，保護(hù)工作人員身心健康是現(xiàn)代企業(yè)管理的重要組成部分。用研磨機(jī)代替手工研磨進(jìn)行樣品制備，不但能夠有效地降低分析人員的勞動強(qiáng)度，還能減少工作人員在研磨過程中造成葉綠素a的損失，提高分析準(zhǔn)確度。丙酮對人體的傷害極大，人工操作過程中丙酮易揮發(fā)，對研磨過程進(jìn)行密閉處理是不現(xiàn)實(shí)的。所以不論從分析結(jié)果的準(zhǔn)確性、人工操作的安全性還是從人機(jī)功效方面的考慮，采用機(jī)器研磨的方式代替手工研磨都勢在必行。

參考文獻(xiàn)

[1]黃曉麗，羅婭敏，趙志友，等.葉綠素a分光光度法的研究[J].科學(xué)技術(shù)創(chuàng)新，2021（24）：41-42

[2]張婧.水中葉綠素a測定方法的比較研究[J].科技創(chuàng)新與應(yīng)用，2022，12（19）：130-134

[3]鄒敏，蹇川，李文俊.葉綠素a分光光度法測定探討[J].皮革制作與環(huán)?？萍迹?021，2（2）：18-20.

[4]生態(tài)環(huán)境部.水質(zhì) 葉綠素a的測定 分光光度法：HJ 897—2017[S].

作者簡介

趙榮龍，本科，工程師，研究方向?yàn)榄h(huán)境分析與保護(hù)。

（責(zé)任編輯：張瑞洋）