紫外-可見分光光度法測定贛南風車子中總黃酮的含量

胡宏凱，彭金年，黃 純，賴偉杭，張夢雅，程庚金生*

（1.贛南醫科大學，江西贛州 341000；2.贛州市立醫院，江西贛州 341000）

風車子（Combretum alfrediihance）為使君子科風車子屬植物，別名水番桃、清涼樹、華風車子、四角風，分布于江西、湖南、廣東、廣西等地[1]。風車子屬植物的根、莖、葉、花和種子均可入藥，在不同地區被當作民間藥廣泛用于治療肝炎、痢疾、呼吸道感染甚至癌癥[2,4]。現代藥理研究表明該屬植物具有保肝、抗炎、殺菌、抗癌和抗艾滋病等作用[2,4]，其化學成分主要以二苯乙烯類、三萜化合物及菲類化合物為主，此外還有大環內酯類、黃酮類、脂肪酸類、生物堿類和甾體類化合物等[2-7]。

黃酮類成分可能是風車子屬植物的主要藥效成分之一，但目前對風車子黃酮類化合物的研究相對較少，本論文擬用紫外可見分光光度法測定風車子中總黃酮的含量，建立風車子總黃酮含量比色測定的方法，為風車子的進一步開發利用奠定理論基礎。

1 儀器與試劑

高速萬能粉碎機（WK-1000A，上海新諾儀器設備有限公司），十萬分之一電子天平（AB135-S，瑞士梅特勒有限公司），數控超聲波清洗器（KQ-500DE，昆山市超聲儀器有限公司），紫外-可見分光光度計（UV2600，島津儀器有限公司），旋轉蒸發儀（N-1001，上海愛郞儀器有限公司），超純水系統（Direct-Q 5，默克密理博有限公司）。

蘆丁對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100080-201610），超純水（自制），乙醇、NaNO2、Al(NO3)3、NaOH等試劑均為分析純。風車子（市售）經贛南醫學院彭金年副教授鑒定為使君子科風車子屬植物風車子（Combretum alfredii hance）。

2 方法與結果

2.1 對照品溶液制備

精密稱取105 ℃干燥至恒重的蘆丁對照品20 mg，用60 %乙醇溶解定容至100 mL，配制成0.2 mg/mL的蘆丁對照品溶液。

2.2 供試品溶液制備

將風車子60 ℃烘干，用高速萬能粉碎機粉碎，過40目藥篩。精密稱取1.000 g，置于250 mL圓底燒瓶中，加入60%乙醇后，置于超聲波清洗機中進行提取（料液比1:34，提取時間60分鐘[8-9]），抽濾，濾渣同法再提取2次，合并濾液，用旋轉蒸發儀濃縮至適量，轉移至50 mL容量瓶，以60%的乙醇定容至刻度，得風車子供試品溶液。

2.3 標準曲線繪制

精密吸取蘆丁對照品溶液0.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10 mL，分別置于50 mL容量瓶中，各加60%乙醇溶液至12 mL，分別加入5%亞硝酸鈉溶液2 mL，搖勻，放置6 min，加入10%硝酸鋁溶液2 mL，搖勻后放置6 min，加入4%氫氧化鈉溶液20 mL，搖勻后放置5 min，加60%乙醇溶液至刻度，搖勻后放置15 min。

測量波長的確定：以未加蘆丁對照品溶液的第1瓶溶液作空白，對加入8.0 mL蘆丁對照品溶液的第5瓶溶液在350～600 nm范圍內進行光譜掃描，得蘆丁對照品顯色后的吸收曲線；同法對風車子供試品溶液適量顯色處理后掃描，得到風車子樣品顯色后的吸收曲線，結果見圖1。對比蘆丁對照品和風車子樣品的吸收曲線，選擇508 nm為定量測量波長[9]。

圖1 蘆丁對照品和風車子樣品顯色后的吸收曲線Fig.1 Absorption spectrum of rutin standard and Gannan Combretum alfredii samples after color development

以未加蘆丁對照品溶液的第1瓶溶液作空白，在定量波長508 nm處測定各溶液的吸光度，以蘆丁濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制標準曲線，線性擬合得回歸方程y=8.652x-8.524E-4（R2=0.9986），線性范圍0.008～0.040 mg/mL，見圖2。

圖2 蘆丁標準曲線Fig.2 Rutin standard curve

2.4 風車子總黃酮含量測定

取2.2項下風車子供試品溶液0.5 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3項下方法依次加入顯色劑，在508 nm測定其吸光度，重復測定3次，以吸光度平均值根據回歸方程計算風車子黃酮含量。

計算得贛南風車子樣品總黃酮含量為（58.42±0.19）mg/g(n=3)。

2.5 方法學考察

2.5.1 精密度試驗

取蘆丁對照品溶液5 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3項下方法分別加入顯色劑后測定其吸光度，反復測定6次，以吸光度值計算，RSD為1.01%，表明精密度良好。

2.5.2 穩定性試驗

分別取蘆丁對照品溶液5 mL和風車子供試品溶液2 mL，置于50 mL容量瓶中，依2.3項下方法分別加入顯色劑后，依法分別于0、20、40、60、80、100、120 min測定，以吸光度值計算，RSD為分別為0.86%和1.98%，表明該測定方法2 h內具有良好的穩定性。

2.5.3 重現性試驗

精確稱量風車子粉末6份，按2.2項下方法制備風車子供試液，依2.3項下方法分別加入顯色劑后，用紫外可見分光光度計測定吸光度，以吸光度值計算，RSD（n=6）為2.28%，表明該法具有良好的重現性。

2.5.4 加樣回收率試驗

取已測總黃酮濃度的樣品溶液適量，平行進行6份試驗，加入蘆丁對照品適量，依2.3項下方法分別加入顯色劑后測定其吸光度，根據回歸方程、加樣回收率計算公式，得平均加樣回收率為97.74%，RSD為1.84%，表明該方法準確度良好。

3 結論與討論

風車子中黃酮類化合物經超聲提取、硝酸鋁顯色后，可用紫外-可見分光光度法在508 nm下定量測定。線性擬合得回歸方程y=8.652x-8.524E-4（R2=0.9986），線性范圍0.008～0.040 mg/mL，測得贛南風車子中黃酮含量為（58.42±0.19）mg/g(n=3)，該方法操作簡便、快捷、高效、結果準確、精密度和穩定性好，雜質干擾少。風車子是江西贛南地區的特色中藥材之一，開發利用風車子對促進贛南特色中藥材發展具有一定的意義，本文建立了超聲提取、紫外-可見分光光度法測定風車子總黃酮含量的測定方法，可為開發利用贛南風車子總黃酮提供定量分析方法。