制備液相色譜法在輔酶Q10分離純化中的應(yīng)用研究

王洪宇，張慧君，黃 超，汪群杰

（天津中科博蘊(yùn)生物技術(shù)有限公司，天津 300300）

0 引言

在當(dāng)代醫(yī)學(xué)和健康領(lǐng)域，輔酶Q10（Coenzyme Q10，CoQ10）作為一種重要的生物分子，扮演著調(diào)節(jié)能量代謝和維護(hù)細(xì)胞健康的關(guān)鍵角色。同時(shí)，5-脫甲氧基輔酶Q10的存在也引發(fā)了科研人員的關(guān)注，因?yàn)樗赡軐?duì)輔酶Q10的效能產(chǎn)生不利影響。隨著對(duì)輔酶Q10在健康和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究不斷深入，如何高效地分離純化輔酶Q10成為一個(gè)備受關(guān)注的課題。

本研究將采用液相色譜法作為核心技術(shù)手段，通過吸附材料的選擇和洗脫液的設(shè)計(jì)，嘗試在純化輔酶Q10的過程中去除5-脫甲氧基輔酶Q10。實(shí)驗(yàn)中，我們將制備輔酶Q10粗提物，并在實(shí)驗(yàn)條件下對(duì)吸附材料和洗脫液進(jìn)行優(yōu)化。通過定量分析洗脫液中輔酶Q10的含量，我們將評(píng)估制備液相色譜法在純化輔酶Q10中的應(yīng)用效果。最終，本文總結(jié)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，探討液相色譜法在輔酶Q10純化中的優(yōu)勢(shì)和局限，并展望其未來的應(yīng)用前景。

1 輔酶Q10的制作與挑戰(zhàn)

1.1 輔酶Q10的制備

從合適的原料中提取茄尼醇（CoQ10）的前體物質(zhì)。也就是對(duì)氫氧基苯酚和異戊二烯反應(yīng)，生成輔酶Q10的前體物質(zhì)。此后，通過一系列催化和氧化反應(yīng)，將前體物質(zhì)逐步轉(zhuǎn)化為輔酶Q10。

1.2 5-脫甲氧基輔酶Q10的形成與影響

然而，輔酶Q10的生產(chǎn)過程中容易產(chǎn)生5-脫甲氧基輔酶Q10這一副產(chǎn)物。5-脫甲氧基輔酶Q10的存在可能降低輔酶Q10的生物活性，從而影響其應(yīng)用效果。

1.3 當(dāng)前純化方法的限制與挑戰(zhàn)

在探索輔酶Q10的生物學(xué)功能和應(yīng)用潛力時(shí)，純化輔酶Q10的方法也面臨著一系列挑戰(zhàn)。目前的純化方法盡管能夠獲得較高純度的輔酶Q10，但仍存在一些限制。其中之一是針對(duì)5-脫甲氧基輔酶Q10的純化效果不佳，由于其與輔酶Q10的相似性，常難以被有效分離。

2 液相色譜法在輔酶Q10純化中的應(yīng)用

2.1 液相色譜法原理與分類解析

液相色譜法（Liquid Chromatography，簡稱LC）是一種分離和純化復(fù)雜混合物中目標(biāo)成分的強(qiáng)大技術(shù)。其基本原理是將待分析的混合物通過液相載流相，與固定相相互作用后在固定相中分離。根據(jù)不同的分離機(jī)理和載流相的性質(zhì)，液相色譜法可以細(xì)分為不同的類型，如高效液相色譜法（HPLC）、氣相色譜法（GPC）、離子色譜法（IC）等。

2.2 液相色譜法的應(yīng)用和優(yōu)勢(shì)

液相色譜法在制備液相色譜法（PLC）中的應(yīng)用，對(duì)于純化復(fù)雜混合物中的目標(biāo)物質(zhì)具有重要意義。PLC在輔酶Q10的純化中可實(shí)現(xiàn)以下優(yōu)勢(shì)：

（1）液相色譜法通過優(yōu)化流動(dòng)相的選擇和固定相的性質(zhì)，能夠?qū)崿F(xiàn)高效的分離，有效去除5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)。

（2）制備液相色譜法適用于大樣品量的純化，從而實(shí)現(xiàn)高產(chǎn)率的目標(biāo)產(chǎn)物獲取。

（3）液相色譜法操作參數(shù)可精確控制，使得純化過程穩(wěn)定可控。

2.3 為什么選擇液相色譜法作為解決方案

選擇液相色譜法作為輔酶Q10純化的解決方案，是基于其在復(fù)雜混合物純化中的卓越表現(xiàn)，液相色譜法可以高效地分離具有相似結(jié)構(gòu)的化合物，使得去除5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)成為可能。利用液相色譜法，可以獲得高純度的輔酶Q10產(chǎn)物，滿足高質(zhì)量產(chǎn)品的需求。液相色譜法的操作參數(shù)可調(diào)節(jié)，確保生產(chǎn)過程的可控性和穩(wěn)定性。液相色譜法在科研和工業(yè)生產(chǎn)中得到廣泛應(yīng)用，為其在輔酶Q10純化中的實(shí)施提供了實(shí)踐基礎(chǔ)。

3 實(shí)驗(yàn)方法與參數(shù)優(yōu)化

3.1 樣品制備與前處理的具體步驟

本發(fā)明涉及一種純化高純度輔酶Q10的方法，以下詳細(xì)描述了樣品制備與前處理步驟：

（1）樣品提取：采集含有輔酶Q10的生物樣品，可以是通過植物細(xì)胞培養(yǎng)法或微生物發(fā)酵法獲得。隨后，對(duì)樣品進(jìn)行細(xì)胞破碎或其他適當(dāng)?shù)奶幚恚葬尫拍繕?biāo)物質(zhì)。

（2）溶解提取物：將輔酶Q10粗提物溶解于適當(dāng)?shù)娜軇┲校苽錆舛葹?0 mg/mL的上樣溶液。

（3）前處理：對(duì)上樣溶液進(jìn)行前處理，例如通過抽濾等方法去除固體顆粒和大分子雜質(zhì)。

3.2 吸附材料的選擇與優(yōu)化

本發(fā)明中的純化方法涉及特定的吸附材料，吸附材料的選擇與優(yōu)化步驟：

吸附材料選擇：在該方法中，選擇具有極性有機(jī)官能團(tuán)鍵合硅膠或含有極性有機(jī)官能團(tuán)的有機(jī)烴類鍵合硅膠作為吸附材料。極性有機(jī)官能團(tuán)包括但不限于二醇基、酯基、氨基、酰胺基、脲基等。

優(yōu)化條件：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，優(yōu)化吸附材料的類型和特性，確保其能夠有效吸附目標(biāo)物質(zhì)輔酶Q10。

3.3 洗脫液組成與流速的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

在本發(fā)明的純化方法中，洗脫液的組成和流速對(duì)純化效果至關(guān)重要。以下是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的詳細(xì)描述：

（1）上樣與吸附：將制備好的上樣溶液，濃度為30 mg/mL，以3倍柱體積/小時(shí)的流速泵入裝填有選定吸附材料的吸附柱中。上樣量為1.5倍柱體積。

（2）洗脫步驟：使用正己烷/乙酸乙酯(90/10，v/v)的混合物作為初始流動(dòng)相，以5倍柱體積/小時(shí)的流速進(jìn)行洗脫。首先進(jìn)行正己烷/乙酸乙酯混合物的洗脫（7倍柱體積），然后切換至純乙酸乙酯進(jìn)行洗脫（1倍柱體積）。

（3）收集洗脫液：收集3～5倍柱體積的洗脫液，其中含有已純化的輔酶Q10合格品。其余的洗脫液可以合并收集。

（4）濃縮和固化：采用減壓旋蒸工藝對(duì)合格品及其余洗脫液進(jìn)行濃縮。合格品經(jīng)抽濾后，通過晾干等方法制得輔酶Q10的固體粉末。

（5）分析與驗(yàn)證：對(duì)合格品進(jìn)行分析，使用藥典中規(guī)定的方法，確認(rèn)輔酶Q10的高純度。在本實(shí)驗(yàn)中，結(jié)果顯示輔酶Q10的收率為92%，5-脫甲氧基輔酶Q10的含量為0%。

3.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

本節(jié)將呈現(xiàn)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并通過插圖進(jìn)行更直觀地展示。

圖1：純化后樣品圖，不含5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)

圖1 純化后樣品圖

圖1 展示了經(jīng)過本發(fā)明純化方法處理后的樣品圖，可以明顯看出樣品中不含有5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)。

圖2：純化前樣品檢測(cè)圖，1為5-脫甲氧基輔酶Q10；2為輔酶Q10

圖2 純化前樣品檢測(cè)圖

圖2 呈現(xiàn)了純化前樣品的檢測(cè)結(jié)果，其中1代表5-脫甲氧基輔酶Q10，2代表輔酶Q10。

圖3：5-脫甲氧基輔酶Q10分離典型層析在線圖，1為5-脫甲氧基輔酶Q10；2為輔酶Q10

圖3 5-脫甲氧基輔酶Q10分離典型層析在線圖

圖3 展示了典型的層析在線圖，清楚地顯示了5-脫甲氧基輔酶Q10和輔酶Q10的分離情況。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

在這一部分，我們將詳細(xì)呈現(xiàn)實(shí)際實(shí)驗(yàn)的結(jié)果，并對(duì)這些結(jié)果進(jìn)行深入的分析和解釋。

4.1 洗脫液中輔酶Q10純度與產(chǎn)率的定量結(jié)果

首先，我們將輔酶Q10粗提物溶解于正己烷中，形成濃度為30 mg/mL的上樣溶液。通過將上樣溶液以3倍柱體積/小時(shí)的流速泵入酰胺基鍵合硅膠吸附柱，我們成功地將輔酶Q10富集在柱中。接著，我們使用正己烷/乙酸乙酯（90/10，v/v）的混合物作為流動(dòng)相，以不同的流速洗脫，最終得到了純化的輔酶Q10合格品。

在這一步驟中，我們收集了3～5倍柱體積的洗脫液，經(jīng)過濃縮和冷凝處理后得到固體粉末。經(jīng)過抽濾和晾干，我們得到了最終的純化輔酶Q10產(chǎn)品。

4.2 5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)去除效果評(píng)價(jià)

本實(shí)驗(yàn)的重要目標(biāo)是除去5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)。通過采用2015版藥典中輔酶Q10的檢測(cè)方法，我們對(duì)純化后的樣品進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，純化后的輔酶Q10合格品中，5-脫甲氧基輔酶Q10的含量為0%，說明我們的純化方法成功地去除了這一雜質(zhì)。

4.3 實(shí)驗(yàn)參數(shù)對(duì)結(jié)果的影響分析與解釋

在本實(shí)驗(yàn)中，我們注意到實(shí)驗(yàn)參數(shù)的選擇對(duì)結(jié)果具有重要影響。首先，上樣溶液的濃度、流速以及洗脫液的組成和流速都會(huì)影響純化效果。通過精確調(diào)控這些參數(shù)，我們可以實(shí)現(xiàn)較高的輔酶Q10收率和純度，同時(shí)有效去除雜質(zhì)。

此外，吸附材料的選擇也是關(guān)鍵因素。酰胺基鍵合硅膠的使用，具有良好的親和性，能夠高效地富集目標(biāo)產(chǎn)物。通過對(duì)實(shí)驗(yàn)參數(shù)的仔細(xì)分析和調(diào)整，我們能夠優(yōu)化純化過程，達(dá)到理想的純化效果。

5 應(yīng)用前景與推廣

5.1 液相色譜法在制備高純度輔酶Q10中的廣泛應(yīng)用前景

本研究所開發(fā)的液相色譜法在輔酶Q10純化中取得的成功為制備高純度輔酶Q10提供了一種有效的方法。隨著保健品和藥物市場(chǎng)的不斷擴(kuò)大，對(duì)高純度輔酶Q10的需求也在不斷增加。該方法不僅能夠高效地去除5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)，還能夠?qū)崿F(xiàn)較高的產(chǎn)率和純度，滿足市場(chǎng)對(duì)高質(zhì)量產(chǎn)品的需求。

除了輔酶Q10，這種液相色譜法在其他生物分子的純化中也有廣泛的應(yīng)用前景。這種方法基于分子的親和性和互作性，可以應(yīng)用于多種分子的分離和富集，從而提高產(chǎn)品的純度和質(zhì)量。

5.2 行業(yè)內(nèi)其他分子純化問題的潛在解決方案

液相色譜法作為一種高效分離技術(shù)，在生物制藥、食品工業(yè)、化學(xué)工業(yè)等領(lǐng)域都具有廣泛的應(yīng)用。除了輔酶Q10，許多分子的純化問題也面臨著類似的挑戰(zhàn)，如結(jié)構(gòu)相似的同分異構(gòu)體、雜質(zhì)的去除等。本研究的成功經(jīng)驗(yàn)為這些問題的解決提供了有益的借鑒和參考，為行業(yè)內(nèi)其他分子純化問題的解決方案提供了新的思路。

5.3 推廣實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可行性及可持續(xù)性考量

本研究所提出的純化方法在實(shí)驗(yàn)中取得了顯著的效果，但其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性和可持續(xù)性需要進(jìn)一步考量。在推廣該方法時(shí)，需要關(guān)注成本、資源、環(huán)保等因素，確保在工業(yè)化生產(chǎn)中能夠保持高效、穩(wěn)定的純化效果。此外，為了確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可復(fù)現(xiàn)性，需要建立標(biāo)準(zhǔn)化的操作流程和質(zhì)量控制體系。

6 結(jié)論與展望

本章將對(duì)本研究的主要成果進(jìn)行總結(jié)，并強(qiáng)調(diào)其創(chuàng)新點(diǎn)，同時(shí)展望液相色譜法在輔酶Q10純化中的應(yīng)用前景。此外，我們還將提出一些進(jìn)一步的研究方向和技術(shù)改進(jìn)建議，以推動(dòng)該領(lǐng)域的深入發(fā)展。

6.1 研究成果總結(jié)與創(chuàng)新點(diǎn)強(qiáng)調(diào)

通過本研究，我們成功開發(fā)了一種基于液相色譜法的高效純化輔酶Q10的方法。該方法不僅能夠有效地去除5-脫甲氧基輔酶Q10雜質(zhì)，還能夠?qū)崿F(xiàn)高產(chǎn)率和高純度的輔酶Q10產(chǎn)品。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在本方法的指導(dǎo)下，輔酶Q10的收率達(dá)到了92%，5-脫甲氧基輔酶Q10的含量降低至0%。這一成果在輔酶Q10的制備工藝中具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

6.2 制備液相色譜法在輔酶Q10純化中的應(yīng)用前景

基于本研究的成功經(jīng)驗(yàn)，可以預(yù)見制備液相色譜法在輔酶Q10純化領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。隨著市場(chǎng)對(duì)高純度輔酶Q10需求的不斷增加，該方法有望成為制備高質(zhì)量產(chǎn)品的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)之一。此外，該方法的原理和思路也可以應(yīng)用于其他分子的純化中，為生物制藥、食品工業(yè)等領(lǐng)域提供有力的解決方案。

6.3 進(jìn)一步研究方向與技術(shù)改進(jìn)建議

盡管本研究取得了顯著的成果，但仍有一些進(jìn)一步的研究方向和技術(shù)改進(jìn)建議值得關(guān)注：

（1）工業(yè)化應(yīng)用： 在將該方法應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)時(shí)，需要考慮實(shí)際生產(chǎn)規(guī)模、成本效益等因素，確保其在實(shí)際應(yīng)用中的可行性。

（2）其他分子純化： 探索該方法在其他分子純化中的應(yīng)用，尤其是類似結(jié)構(gòu)的分子，拓展其應(yīng)用范圍。

（3）環(huán)保考量： 在方法推廣和應(yīng)用中，考慮環(huán)保因素，如洗脫液的處理和再利用，減少環(huán)境負(fù)擔(dān)。