毛蘭素調節(jié)Slit2/Robo1信號通路對糖尿病腎病模型大鼠腎小球內皮細胞血管生成的影響

張菊云，陳綿雄，華炳紅，蒙緒標

（中南大學湘雅醫(yī)學院附屬海口醫(yī)院，海南海口 570208）

糖尿病腎病（diabetic nephropathy，DN）是糖尿病的常見并發(fā)癥，其患病率逐年上升，嚴重影響人類生命和健康，也是終末期腎病的重要因素［1］，臨床上表現為持續(xù)存在白蛋白尿和腎小球濾過率進行性下降［2］。腎小球是由內皮細胞、足細胞和系膜細胞組成的緊密毛細血管簇［3］，其中在DN 中腎小球內皮細胞表現為細胞增殖增加、內皮完整性破壞、血管生成不成熟和內皮-間充質轉化增加等［4-5］。有研究表明，腎小球內皮細胞增殖和血管生成在DN 早期促進腎小球肥大。此外，一些抗血管生成藥物可改善腎小球肥大和高濾過以及DN 早期的白蛋白尿排泄，提示腎小球血管生成可能是DN 早期病理事件的原因［6-7］，因此抑制腎小球內皮細胞血管生成將可能成為治療DN的有效途徑。

石斛（Dendrobii Caulis）是中醫(yī)常用的滋補藥材，用于益胃生津、潤肺補腎和改善視力等［8］。毛蘭素（erianin）是石斛中主要存在的聯芐基化合物，可抑制癌細胞侵襲、遷移和血管生成，發(fā)揮抗腫瘤作用［9］。研究表明，毛蘭素可通過抑制活性氧/絲裂原活化蛋白激酶/NF-κB（reactive oxygen species/mitogen-activated protein kinases/NF-κB，ROS/MAPK/NF-κB）信號通路來阻止高糖誘導的腎小管上皮細胞功能障礙［10］，腎小管上皮細胞和腎小球內皮細胞均為構成腎單位的重要細胞類型，但毛蘭素對DN中腎小球內皮細胞血管生成的影響尚未闡明。

slit 同源蛋白2（slit homolog 2 protein，Slit2）主要表達于血管內皮細胞和平滑肌細胞，通過與不同的軸突導向受體蛋白（roundabout homolog，Robo）受體結合發(fā)揮其生物學功能。Robo1 是Robo 家族成員之一［11-12］。研究報道，抑制Robo1 表達可通過抑制腎小球內皮細胞血管內皮生長因子表達而抑制血管生成，其可能是抑制早期DN 異常血管生成的有效靶點［13］。Slit2/Robo1 信號通路參與血管新生的調控，該通路激活可促進腎小球血管形成和腎單位發(fā)育［14］，促進早期DN 腎小球血管新生［15］。因此提示，抑制Slit2/Robo1 信號通路可能減輕DN 模型大鼠腎小球內皮細胞血管生成。本研究制備DN模型大鼠，研究毛蘭素對DN 模型大鼠腎小球內皮細胞血管生成的影響以及Slit2/Robo1 信號通路的作用，為DN 治療提供新靶點，并為毛蘭素作為DN的候選治療藥物提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

毛蘭素（批號：HY-N0517），美國MCE 公司，用0.5%羧甲基纖維素鈉配成混懸液；鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）（批號：S0130），美國Sigma公司；尿蛋白定量試劑盒（批號：C035-2-1），南京建成生物工程研究所；過碘酸雪夫氏（periodic acidsciff，PAS）染色試劑盒（批號：C0142S）和RIPA 裂解液（批號：R0010），北京索萊寶科技公司；小鼠抗人血小板內皮細胞黏附分子31（platelet endothelial cell adhesion molecule-31，CD31）抗體（批號：3528S）、兔抗人Slit2 單克隆抗體（批號：47600S）、兔抗人3-磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）單克隆抗體（批號：5174S）、辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標記的山羊抗兔lgG 抗體（批號：7074S）和HRP 標記的馬抗小鼠lgG 抗體（批號：7076S），美國CST公司；兔抗人Robo1多克隆抗體（批號：ab7279），英國Abcam 公司；小鼠抗人足細胞標志蛋白（podocalyxin，PCX）抗體（批號：39-3800），美國Thermo Fisher 公司。Catalyst One?全自動生化分析儀，美國IDEXX 公司；DM2500 熒光顯微鏡，上海徠卡顯微系統(tǒng)有限公司。

1.2 動物、模型制備和分組

55 只雄性SPF 級SD 大鼠，體重180～200 g，購自浙江維通利華實驗動物技術有限公司桐鄉(xiāng)分公司，動物許可證號：SCXK（浙）2021-0006。大鼠飼養(yǎng)溫度23～25 ℃，濕度50%～70%，并在12 h/12 h光暗循環(huán)的房間中自由攝食飲水。本研究經海口市人民醫(yī)院動物倫理委員會批準，倫理審批號：2021034。

大鼠適應性飼喂7 d 后，隨機分為正常對照組10 只和模型組45 只。模型組每天飼喂高糖高脂飼料（由10%豬油、10%蔗糖、5%蛋白粉、1%膽固醇和10%普通飼料組成）持續(xù)56 d（8周），正常對照組飼喂正常飼料。8周后，模型大鼠禁食12 h，ip給予由枸櫞酸緩沖液稀釋的1%STZ注射液（35 mg·kg-1），正常對照組ip 給予等體積枸櫞酸緩沖液。7 d 后測空腹血糖（fasting plasma glucose，FPG）和24 h尿蛋白，FPG≥16.7 mmol·L-1且24 h 尿蛋白＞20 mg，視為DN 大鼠模型制備成功［16］。將造模成功的40只大鼠隨機分為模型組、模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1（ig，持續(xù)8 周）［17］，每組10 只。正常對照組和模型組每日ig 給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，持續(xù)8周。

1.3 樣本制備

給藥8 周后，留取大鼠24 h 尿液，1000×g離心5 min 取上清，用于尿蛋白檢測。大鼠尾靜脈采血，4 ℃，1500×g離心10 min 獲得血清，置于-80 ℃冰箱備用。采血結束后，處死大鼠，取腎。一部分腎組織用4%多聚甲醛固定；另一部分暫存于-80 ℃，用于Western 印跡實驗。

1.4 尿蛋白定量試劑盒檢測大鼠24 h尿蛋白水平

取1.3 制備的24 h 尿液上清，按照尿蛋白定量試劑盒說明操作，檢測24 h尿蛋白。

1.5 全自動生化分析儀檢測大鼠血清FPG 和血肌酐（serum creatinine，Scr）水平

取1.3 制備的血清樣本，全自動生化分析儀測定各組大鼠血清FPG和Scr水平。

1.6 PAS染色觀察大鼠腎組織病理變化

取1.3制備的經4%多聚甲醛固定的腎組織，固定48 h 后依次進行脫水、包埋、制備4 μm 厚切片。根據PAS 染色試劑盒說明將切片進行染色，光學顯微鏡下觀察各組大鼠腎組織病理變化。

1.7 免疫熒光法檢測大鼠腎組織CD31 和PCX 蛋白表達

取1.6 制備的石蠟切片，進行抗原修復，放入3%雙氧水溶液，血清封閉，加入一抗（1∶800）（抗CD31 或抗PCX 抗體），4 ℃過夜孵育，加入HRP 標記二抗（1∶4000），37 ℃孵育1 h，3，3′-二氨基聯苯胺（3，3′-diaminobenzidine，DAB）顯色，復染，封片，熒光顯微鏡下觀察和拍照。紅色表示CD31表達，綠色表示PCX 表達。每組選3 張切片使用Image J軟件分析熒光強度，用熒光強度表示CD31和PCX蛋白相對表達水平。

1.8 Western印跡法檢測大鼠腎組織Slit2和Robo1蛋白表達

取1.3 中暫存于-70 ℃的腎組織，剪成小碎塊加入RIPA 裂解液，提取蛋白，BCA 法定量蛋白，電泳，轉膜，5%脫脂乳封閉2 h，一抗（Slit2，1∶1000；Robo1，1∶1000；GAPDH，1∶1000）4 ℃孵育過夜，室溫孵育二抗（1∶1000）1 h，ECL 曝光。用Image Lab?軟件分析蛋白條帶積分吸光度值，以目標蛋白與內參蛋白積分吸光度值比值表示目標蛋白相對表達水平。

1.9 統(tǒng)計學分析

實驗結果數據用±s表示，用Graphpad Prism7.0 軟件進行統(tǒng)計學分析。多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSDt檢驗。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠血清FPG 和Scr水平及尿液中24 h尿蛋白水平的影響

表1 結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠FPG、Scr和24 h尿蛋白水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，模型+毛蘭素10，20和40 mg·kg-1組大鼠FPG、Scr和24 h尿蛋白水平明顯降低（P＜0.01）。

Tab.1 Effect of erianin on fasting plasma glucose（FPG），serum creatinine（Scr）and 24 h urine protein levels in urine of diabetic nephropathy（DN）model rats

2.2 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織病理變化的影響

圖1 結果顯示，正常對照組大鼠腎小球結構清晰，形態(tài)正常；模型組可見許多新生腎小球毛細血管，并出現腎小球肥大和系膜面積擴張；模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠新增腎小球毛細血管、腎小球肥大和系膜面積擴張現象減輕。

Fig.1 Effect of erianin on pathological changes in renal tissue of DN model rats（HE staining，×400）. See Tab.1 for the rat treatment. Black arrows show neoplastic glomerular capillaries while red ones show glomerular hypertrophy and expansion of the tethered membrane area.

2.3 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中CD31表達的影響

圖2結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠CD31 在腎小球內皮中表達增加（P＜0.01）；與模型組比較，模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠CD31在腎小球內皮中表達減少（P＜0.05，P＜0.01）。

2.4 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織中CD31和PCX共表達的影響

圖3 結果顯示，正常對照組CD31 染色管狀區(qū)域和相鄰的PCX 染色程度相當；模型組大鼠存在非管狀CD31 染色，缺少相鄰PCX 染色，以及部分CD31 管狀區(qū)域染色也缺乏相鄰的PCX 染色；模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠CD31 管狀區(qū)域染色與PCX足細胞區(qū)域染色基本相鄰。

Fig.3 Effect of erianin on CD31 and podocalyxin（PCX）co-expression in renal tissue of DN model rats（×1000）.See Tab.1 for the rat treatment.Cells stained red were CD31 positive and cells stained green were PCX positive.

2.5 毛蘭素對糖尿病腎病模型大鼠腎組織Slit2 和Robo1蛋白表達的影響

圖4結果顯示，與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織Slit2和Robo1蛋白表達明顯升高（P＜0.01）；與模型組相比，模型+毛蘭素10，20 和40 mg·kg-1組大鼠腎組織Slit2 和Robo1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05，P＜0.01）。

Fig.4 Effect of erianin on expressions of slit homolog 2 protein（Slit2）and roundabout homolog1（Robo1）proteins in renal tissue of DN model rats by Western blotting. See Tab.1 for the rat treatment.B was the semi-quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=10.＊＊P＜0.01，compared with normal control group；#P＜0.05，##P＜0.01，compared with model group.

3 討論

本研究結果表明，DN 模型大鼠出現早期DN 的特征性變化，如多食多尿、白蛋白尿排泄增加和腎小球肥大；毛蘭素可顯著抑制DN 模型大鼠FPG、Scr 和24 h 尿蛋白水平，減輕腎小球肥大和系膜面積擴張，表明毛蘭素在DN 中具有腎保護作用。免疫熒光染色結果顯示，DN 模型大鼠腎小球內皮CD31 顯著增加，毛蘭素可下調CD31 表達。內皮細胞CD31 染色和足細胞PCX 染色的雙重標記結果顯示，DN 模型大鼠存在非管狀CD31 染色，缺少相鄰PCX 染色，一些CD31 管狀區(qū)域也缺乏相鄰的PCX 染色，這2 種類型的腎小球血管在結構上顯示出腎小球血管發(fā)育不成熟；毛蘭素可顯著改善該現象，表現為大多數CD31 內皮區(qū)域染色與PCX 足細胞區(qū)域染色相鄰，提示毛蘭素可抑制DN 模型大鼠腎小球內皮細胞血管生成，減少不成熟血管的生成，從而減少蛋白尿產生。

研究報道，Slit2/Robo1信號通路在血管生成中發(fā)揮作用［18］。Slit2 通過Robo1 和Robo2 介導促進內皮細胞遷移，在小鼠出生后視網膜和眼部新生血管疾病模型中有選擇地促進血管生成，推測抑制Slit2 可能用于抑制眼部新生血管疾病患者的血管生成［19］。另有研究報道，Slit2/Robo1信號通路參與暴露于糖尿病樣環(huán)境的腎小球內皮細胞的血管生成［10］，從而推測毛蘭素可能通過抑制Slit2/Robo1信號通路而抑制腎小球內皮細胞血管生成。本研究結果表明，DN 模型大鼠腎組織中Slit2 和Robo1蛋白表達顯著升高，毛蘭素顯著降低DN 模型大鼠腎組織中Slit2和Robo1蛋白表達，提示毛蘭素可能通過抑制Slit2/Robo1 信號通路從而抑制DN 模型大鼠腎小球內皮細胞血管生成。

綜上所述，本研究表明，DN 早期出現過度的腎小球內皮細胞增殖和血管生成，這種現象導致新形成的腎小球毛細血管可能是有缺陷的未成熟血管，結構缺陷導致這些血管的通透性增加，并可能導致白蛋白尿。毛蘭素可能通過抑制Slit2/Robo1 信號通路而抑制DN 模型大鼠腎小球內皮細胞血管生成，推測毛蘭素對DN 腎小球內皮細胞增殖和新生血管形成有治療作用。但本研究尚存在不足之處，僅探究信號通路中Slit2 和Robo1 蛋白表達，未進一步檢測該通路上下游相關蛋白表達。后續(xù)將通過檢測該通路上下游蛋白表達，并增加功能實驗進一步研究Slit2/Robo1信號通路在毛蘭素抑制腎小球內皮細胞血管生成中的作用，以闡明毛蘭素的作用機制。