應用二代測序技術檢測73例骨髓增生異常綜合征患者基因突變的結果及其臨床特征與預后關系的研究

王利萍 李鳳麗 汪安友 王興兵 劉 欣

中國科學技術大學附屬第一醫院 安徽省立醫院血液科，安徽 合肥 230001

骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一組起源于造血干細胞的異質性髓系克隆性疾病，其特點是髓系細胞發育異常，表現為無效造血、難治性血細胞減少，高風險向急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）轉化[1]。MDS 在老年患者中發病率高，在當今人口老齡化的背景下，MDS 的發病率在未來將會大幅度增加，因此，準確的診斷和評估疾病的進展風險是必要的[2]。通過二代測序（second generation sequencing，NGS）評估臨床重要突變是定義診斷、確定預后風險、監測可測量的殘留疾病和揭示預測性突變標記物及治療靶點的強大工具，是血液疾病檢查和監測的常規組成部分，基因組學已經成為診斷檢查的標準組成部分，并成為決策的關鍵因素[3]。很多突變基因是影響MDS 患者總生存期（overall survival，OS）變化獨立因素。NGS 使得MDS 的基因突變譜系更加清晰明了，但涉及基因突變在MDS 發生、發展及演變中的具體分子及其作用機制時，臨床尚知之甚少，這一現狀一定程度上阻礙了NGS 在臨床實踐中的具體應用。另一方面，雖然目前已經研發出許多針對突變基因的分子靶向藥物，但這些藥物中的大多數尚處于Ⅰ、Ⅱ期臨床試驗階段，并未真正用于臨床治療實踐中，至于其最終臨床療效及改善程度如何，尚有待進一步驗證[4]。本研究回顧性分析73 例MDS 患者的基因突變與臨床特征及生存預后的相關性，從而對MDS 的基礎研究、診斷、精準治療及預后評估提供更多理論支持。

1 資料與方法

1.1 一般資料

回顧性分析2016 年4 月至2022 年6 月在安徽省立醫院（本院）行NGS 檢測基因突變的初診并接受治療的73 例MDS 患者。本研究經本院醫學倫理委員會批準。納入標準：①根據WHO（2016 年）診斷分型與血液病診斷及療效標準的診斷標準[5]，收集所有患者的骨髓細胞形態、染色體核型、融合基因和免疫表型等數據結果來加以確診；②確診后在本院行NGS 檢測基因突變的患者；③臨床數據及隨訪資料完整者；④年齡>14 歲者。排除標準：①既往在外院診斷治療，缺乏完整臨床資料者；②未進行NGS 檢測基因突變者。③除MDS外存在其他惡性腫瘤及血液系統疾病者；④繼發性MDS 患者。

1.2 NGS檢測

選擇患者兩側髂后上棘或髂前上棘穿刺部位，行骨髓穿刺，并采集骨髓標本（3 ml），抗凝管保存并送檢行骨髓涂片檢查、染色體核型分析及NGS 檢測基因突變等。運用illumina 測序儀對標本進行高通量測序，即可得到測序后的結果。骨髓標本由本院研究中心檢驗完成。

1.3 臨床數據收集

收集患者的性別、年齡、WHO（2016）分型、危險度分層（revised international prognostic scoring system，IPSS-R）、染色體核型分析、基因突變、患者生存狀態、生存時間等數據資料。

1.4 統計學處理

采用SPSS 26.0 統計學軟件進行數據分析，非正態分布計量資料以[M（P25，P75）]表示，采用Mann-WhitneyU檢驗和Kruskal-WallisH檢驗，計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。P< 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 基因突變特征

本研究共檢測到29 種基因突變，其中58 例（79.45%）患者有基因突變，15 例（20.55%）患者無基因突變。22 例（30.14%）患者僅發生1 個基因突變，16 例（21.92%）患者發生2 個基因突變，20 例（27.40%）患者發生3 個及3 個以上基因突變，突變基因頻率大于5%的依次為：ASXL1、TP53、TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1、SRSF2、RUNX1、IDH1、ETV6、WT1。見表1 ～2。

表1 各突變基因頻數及頻率

表2 突變基因數目的例數及占比

2.2 基因突變與各因素分析

對突變頻率較高的基因做與性別、年齡、分型、分層、核型等因素的分析，不同性別的突變基因比較，差異無統計學意義（P> 0.05）。TP53（P=0.030）、TET2（P< 0.001）、SRSF2（P=0.027）突變基因均在老年MDS 患者中發生率較高，差異有統計學意義（P< 0.05）。DNMT3A（P=0.034）、SF3B1（P=0.002）、IDH1（P=0.017）、WT1（P=0.017）突變基因在各WHO（2016）分型之間分布差異有統計學意義（P< 0.05）。各個突變基因在不同危險度分層頻率分布差異無統計學意義（P> 0.05）。TP53、U2AF1突變基因在不同染色體核型分布差異有統計學意義（P< 0.05）。見表3 ～7。

表3 突變基因與性別的關系

表4 突變基因與年齡的關系

表5 突變基因與WHO（2016）分型的關系

表6 突變基因與危險度分層的關系

表7 突變基因與染色體核型的關系

2.3 基因突變與OS及預后意義

采用Kaplan-Meier 曲線對基因突變頻率較高的突變基因做與OS 的相關性分析發現，TP53 突變與預后不良相關，差異有統計學意義（P< 0.05）。見表8。

表8 突變基因與OS的關系

3 討論

基因突變在MDS 的發生、發展中扮演著極其重要的作用。隨著NGS 技術的廣泛應用，越來越多突變基因被發現，進一步完善了血液惡性腫瘤疾病的基因突變譜。本研究分析包括MDS 患者中常見基因突變與性別、年齡、染色體核型、WHO（2016）分型、IPSS-R 危險度分層等臨床特征的相關性，并分析各基因突變與OS 的關系及其對評估MDS 患者預后、指導治療的作用。

本研究結果發現，其中79.50%的患者至少發生1 個基因突變，21.92%的患者發生2 個基因突變，27.40%的患者發生3 個及以上基因突變。其中突變基因頻率最高的是ASXL1（27.40%），余下突變依次為TP53、TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1、SRSF2、RUNX1、IDH1、ETV6、WT1，這些突變基因與以往相關文獻研究的常見突變基因基本一致，Haferlach等[6]篩查了944例MDS患者的104個基因，其中845（89.50%）例MDS 患者檢測出至少一種基因突變，其中突變頻率較高的有TET2、SF3B1、ASXL1、SRSF2、DNMT3A 和RUNX1 等。一項研究[7]納入了2043 例MDS 患者，其中1630 例（80%）患者出現一個或多個突變。各突變基因在不同年齡患者中的分布有差異，其中TP53、TET2、SRSF2 在老年MDS 患者中發生率較高，差異有統計學意義（P< 0.05）。在突變基因分布與WHO（2016）分型的關系中分析發現，DNMT3A、SF3B1、IDH1、WT1 突變基因在各分型之間分布差異有統計學意義（P< 0.05）。SF3B1 主要分布在MDS-RS 中，這一分析發現與既往文獻研究發現SF3B1 突變與MDS 亞型之間有明確的聯系，MDS 伴環形鐵粒母細胞（MDS-RS）和單系或多系發育不良（MDS-RS-SLD，MDS-RS-MLD）[8]結果一致，且SF3B1 作為MDS-RS 特征性分子生物學標志，已納入MDS-RS 的診斷標準中。有相關研究發現SF3B1 與較低的骨髓細胞百分比、較高的白細胞計數和較高的中性粒細胞計數、較高的中位血小板計數之間存在關聯[9]。根據危險分層不同，發現各突變基因頻率分布差異無統計學意義（P> 0.05）。雖然既往多次研究及相關專家共識表明基因突變和危險度評分均能作為評估患者預后的一項重要指標，但本研究結果未發現兩者之間的聯系，有待于進一步研究。臨床上發現有部分患者的實際預后與其風險評分不一致，這可以用體細胞突變來解釋，例如，來那度胺用于治療低風險的del（5q）患者，結果反應良好，且低風險的del（5q）患者進展為AML 的頻率較低[10-11]。雖然修訂后的國際預后評分系統的引入提高了臨床預測MDS 患者預后的能力，就目前的MDS 評分系統而言，其基于疾病特異性因素，包括細胞計數、細胞減少程度、輸血依賴和細胞遺傳學，未考慮其他患者相關因素，如共病、虛弱和性能狀態[12]。隨著越來越多的研究探索突變狀態在預后評分中的效用，如何調整IPSS-R 以結合遺傳信息和復合突變MDS 的生物學復雜性將變得越來越清楚。

本研究發現TP53 突變是OS 的獨立不良預后因素，除TP53 突變外，國內外專家共識及多個文獻報道許多基因都與預后相關，本研究發現的突變頻率較高的有：ASXL1、TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1、SRSF2、RUNX1，早在2011 年，Thol 等[13]直接測序了193 例MDS 患者的DNA 中是否存在ASXL1 突變，并評估了它們對預后的影響，從單因素分析結果中發現，ASXL1 突變患者的OS 明顯短于野生型ASXL1 患者，且ASXL1 突變與中等風險核型相關，但與其他臨床參數無關。一項薈萃分析顯示ASXL1 突變與MDS 的不良預后相關，這可能有助于該疾病的風險分層和預后評估[14]。Idossa 等[15]研究發現MDS 中的ASXL1 突變預示著去甲基化藥物和來那度胺治療的不良反應。Walter 等[16]通過對151 例MDS 患者的研究發現，與無DNMT3A突變的患者相比，DNMT3A 突變患者的OS 更差（P=0.005），且更快速的進展為AML（P=0.007），這表明DNMT3A 突變患者的突變狀態可能對早期MDS 有預后價值。一項研究[17]生存時間相關因素的報道表明，正常核型與較高的緩解率和較長的生存期相關，另有一項[18]多變量分析表明，復雜的細胞遺傳畸變以及簡單和復雜易位與不良預后獨立相關。大約50%的MDS 患者具有正常的細胞遺傳學，與AML 相比，MDS 中平衡結構異常，如易位和倒置，在MDS 中相對罕見[19]。

綜上所述，本研究利用NGS 技術分析了MDS患者的基因突變情況，并分析描述基因突變在不同臨床特征中的分布特點及與OS 的相關性。但是本研究存在樣本數量相對較少和隨訪時間較短等局限性。部分MDS 患者存在共突變、聯合突變等，其預后意義有著更高的價值，本研究未能進行充分的分析，有待進一步對基因及聯合基因突變進行描繪及預后追蹤，了解突變基因更為確切的臨床意義，更好地進行療效預測、預后評估，而治療方面，具有顯著性改變MDS 患者預后傾向的新型治療藥物的開發落后于許多其他血液腫瘤疾病。對于MDS 來說，真正的精準醫療仍在未來。