基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討平陽(yáng)益心飲治療射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭的作用機(jī)制

湯嘉慧 王新東 董其美

1.南京中醫(yī)藥大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院心血管內(nèi)科，江蘇 南京 210028；2.南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院心血管內(nèi)科，江蘇 南京 210028

流行病學(xué)表明射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭（heart failure with preserved ejection fraction，HFpEF）已成為全球心力衰竭（heart failure，HF）的主流[1]，它是指左室射血分?jǐn)?shù)≥50%，以左室等容舒張延長(zhǎng)、左室舒張末壓增加和左室充盈緩慢為特征的HF[2]。目前尚無(wú)確切治療顯示可以降低HFpEF 患者發(fā)病率或病死率，因此降低HFpEF 患者的發(fā)病率或病死率成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

中醫(yī)古籍中并未記載“射血分?jǐn)?shù)保留型心力衰竭”這一病名，參考其臨床表現(xiàn)可歸類于中醫(yī)“心力衰竭病”的范疇。HF 是以氣喘、心悸、水腫等為主癥的一種病證，是許多心系疾病的最終歸宿[3]。中醫(yī)藥因其顯著優(yōu)勢(shì)獲得社會(huì)認(rèn)可，被廣泛應(yīng)用于治療HF。

平陽(yáng)益心飲由白茅根、丹參、枸杞子、紅景天、焦梔子、鹿銜草、路路通、桑葉、絲瓜絡(luò)9 味中藥組成，是南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬江蘇省中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院治療HFpEF 的經(jīng)驗(yàn)方，已在臨床應(yīng)用多年，但其具體分子機(jī)制尚未明確。本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)挖掘平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的藥效靶點(diǎn)和信號(hào)通路，系統(tǒng)闡述平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的科學(xué)內(nèi)涵。

1 資料與方法

1.1 獲取平陽(yáng)益心飲的藥物靶點(diǎn)

通過(guò)HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://herb.ac.cn/）獲得平陽(yáng)益心飲化學(xué)成分和化合物結(jié)構(gòu)，將化合物結(jié)構(gòu)導(dǎo)入Swiss ADME平臺(tái)（http:/www.swissadme.ch/）。設(shè)置納入標(biāo)準(zhǔn)：①腸胃吸收（gatrointestinal absortion；GIabsortion）為“ High”；②5 類藥性（Egan、Lipinski、Ghose、Muegge、Veber）中≥2 個(gè)為“ Yes”，將鑒定出的化學(xué)成分分子結(jié)構(gòu)圖上傳至SwissTarget Prediction 數(shù)據(jù)庫(kù)（http:/www.swisstargetprediction.ch/），按Probability>0 篩選靶點(diǎn)，獲取相關(guān)的潛在靶點(diǎn)。

1.2 獲取HFpEF的疾病靶點(diǎn)

在PhamGKB（https://www.pharmgkb.org/）、OMIM（https://omim.org/）、GeneCards（https://www.genecards.org/）數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索“ HFpEF”的相關(guān)靶點(diǎn)，去除重復(fù)值，得到HFpEF 的疾病靶點(diǎn)。

1.3 篩選平陽(yáng)益心飲-HFpEF交集靶點(diǎn)

運(yùn)用Venny 2.1.0（https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/）取藥物和疾病的交集靶點(diǎn)并繪制韋恩圖。

1.4 構(gòu)建“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

以平陽(yáng)益心飲內(nèi)含有的藥物名稱、有效成分及疾病靶點(diǎn)為節(jié)點(diǎn)，構(gòu)建“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)。

1.5 構(gòu)建蛋白互作網(wǎng)絡(luò)（protein-protein interaction networks，PPI）及篩選核心靶點(diǎn)

在STRING 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://string-db.org/）輸入平陽(yáng)益心飲和HFpEF 的交集靶點(diǎn)，構(gòu)建PPI 拓?fù)渚W(wǎng)絡(luò)。運(yùn)用CytoHubba 插件篩查核心靶點(diǎn)，篩查條件包括Degree 值、Closeness 值、Network 值、Betweenness 值、Eigenvector 值和LAC 值。

1.6 通路富集分析

在Metascape 平臺(tái)導(dǎo)入交集靶點(diǎn)，分別進(jìn)行京都基因組百科全書(shū)通路富集分析（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）和基因本體功能富集分析（gene ontology，GO）分析，應(yīng)用微生信平臺(tái)（http：//www.Bioinformatics.com.cn）繪制通路富集分析圖和生物功能分析圖。

2 結(jié)果

2.1 平陽(yáng)益心飲靶點(diǎn)

運(yùn)用HERB 數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)平陽(yáng)益心飲相關(guān)的活性成分的作用靶點(diǎn)，去重后得到566 個(gè)活性成分和1309 個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 疾病靶點(diǎn)的獲取

從OMIM、PhamGKB 及GeneCards 數(shù)據(jù)庫(kù)獲取HFpEF 靶點(diǎn)，去重后獲得3199 個(gè)HFpEF 靶點(diǎn)。

2.3 成分靶點(diǎn)-疾病靶點(diǎn)交集獲取

將上述獲取的成分靶點(diǎn)與疾病靶點(diǎn)導(dǎo)入Venny 2.1.0中，共得到交集靶點(diǎn)524 個(gè)，韋恩圖見(jiàn)圖1。

圖1 平陽(yáng)益心飲藥物-HFpEF 疾病靶點(diǎn)交集韋恩圖

2.4 “成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化

使用Cytoscape 3.9.0 軟件將524 個(gè)候選治療靶點(diǎn)進(jìn)行“成分-疾病靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)可視化（圖2）。

圖2 成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 PPI的構(gòu)建及核心靶點(diǎn)的篩選

利用STRING 對(duì)2.3 項(xiàng)中得到的524 個(gè)候選治療靶點(diǎn)構(gòu)建PPI 網(wǎng)絡(luò)，篩選后得到524 個(gè)節(jié)點(diǎn)和10 371 條邊的互作網(wǎng)絡(luò)（圖3）。

圖3 候選治療靶點(diǎn)的PPI 圖

對(duì)交集靶點(diǎn)做核心靶點(diǎn)篩查：將524 個(gè)蛋白輸入Cytoscape 3.9.0 軟件中，利用CytoHubba 插件進(jìn)行篩選。首先以Betweenness>21.28、Closeness>0.03、Degree>6.56、Eigenvector>833.26、LAC>0.04、Network>9.36，進(jìn)行第一次篩選，由524 個(gè)蛋白篩選至54個(gè)，接下來(lái)再以Betweenness>75.85、Closeness>0.11、Degree>18.54、Eigenvector>3543.57、LAC>0.18、Network>34.89 進(jìn)行第2 次篩選，由54 個(gè)蛋白篩選得到12 個(gè)，推測(cè)這12 個(gè)蛋白為平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的核心治療靶點(diǎn)，依次為STAT3、SRC、AKT1、MAPK1、MAPK3、HRAS、GRB2、RELA、JUN、FYN、ESR1、EGFR。

2.6 GO分析及KEGG分析

借助Metascapes 平臺(tái)進(jìn)行GO 分析及KEGG通路分析。GO 分析中篩選出生物過(guò)程（biological processes，BP）、分子功能（molecular functions，MF）和細(xì)胞成分（cellular components，CC）的前10 位進(jìn)行制圖（圖4）。結(jié)果提示，平陽(yáng)益心飲可能參與細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、系統(tǒng)進(jìn)程調(diào)節(jié)、循環(huán)系統(tǒng)過(guò)程、磷酸化的正調(diào)控等過(guò)程；在膜筏、突觸后、細(xì)胞體、受體復(fù)合物等細(xì)胞組分中起作用；激活了蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性、激酶結(jié)合、神經(jīng)遞質(zhì)受體活性等分子功能。KEGG 共富集到235 條通路，前20 條通路用氣泡圖展示（圖5），包括癌癥相關(guān)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等。

圖5 KEGG 通路富集分析氣泡圖

3 討論

平陽(yáng)益心飲具有平肝潛陽(yáng)、利水消腫的作用，能顯著改善HFpEF 的癥狀。通過(guò)PPI 網(wǎng)絡(luò)分析，驗(yàn)證了AKT1、SRC、STAT3 等靶點(diǎn)是平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 的核心靶點(diǎn)。AKT1 的激活證實(shí)其可以促進(jìn)心肌細(xì)胞的生長(zhǎng)和增殖，從而強(qiáng)化心臟修復(fù)[4-5]。AKT1 蛋白的缺失可能導(dǎo)致早期收縮功能障礙，進(jìn)而形成HF[6]。SRC 是一種在細(xì)胞黏附、細(xì)胞更迭和細(xì)胞遷移等過(guò)程中發(fā)揮作用的非受體酪氨酸激酶，研究表明，SRC 激酶在糾正心臟肥大及重塑中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[7]。SRC 磷酸化能改善細(xì)胞間通訊，降低心律失常誘導(dǎo)性，改善HF 癥狀[8]。STAT3 是一種轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白和活性因子，研究發(fā)現(xiàn)STAT3 及其相關(guān)的信號(hào)通路在心血管系統(tǒng)中也起著關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用[9-10]。研究表明，STAT3 的激活可以減少心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)心肌分化，從而改善心肌重塑和纖維化[11]。

平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 主要參與調(diào)控癌癥相關(guān)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路、脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化信號(hào)通路等，主要涉及細(xì)胞對(duì)氮化合物的反應(yīng)、磷酸化的正調(diào)控和循環(huán)系統(tǒng)等生物過(guò)程，膜筏、突觸后和細(xì)胞體是參與反應(yīng)的重要細(xì)胞組分，分子功能主要包括蛋白激酶活性、蛋白酪氨酸激酶活性和激酶結(jié)合等。

循證醫(yī)學(xué)證實(shí)，癌癥與HF 具有共同的危險(xiǎn)因素和信號(hào)通路，并且相互促進(jìn)發(fā)展[12]。動(dòng)脈粥樣硬化是心血管疾病的危險(xiǎn)因素之一，能參與血管內(nèi)皮損傷、心臟結(jié)構(gòu)或功能改變等病理過(guò)程。因此，抗動(dòng)脈粥樣硬化治療有助于修復(fù)血管內(nèi)皮損傷和對(duì)抗心肌重構(gòu)，在HF 的發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用[13]。cAMP 的增加可以維持心肌鈣穩(wěn)態(tài)及心肌收縮舒張功能，減少心肌細(xì)胞凋亡[14]。cGMP-PKG 信號(hào)通路通過(guò)調(diào)控炎癥、氧化應(yīng)激和鈣離子濃度來(lái)減少血管硬化，從而影響心室重構(gòu)，改善HF[15]。

綜上所述，平陽(yáng)益心飲治療HFpEF 可能是作用于AKT1、SRC、STAT3 等靶點(diǎn)來(lái)調(diào)節(jié)癌癥相關(guān)通路、cGMP-PKG 信號(hào)通路、cAMP 信號(hào)通路和脂質(zhì)與動(dòng)脈粥樣硬化等信號(hào)通路，主要涉及細(xì)胞凋亡、細(xì)胞增殖等機(jī)制，主要集中于膜筏、突觸后、細(xì)胞體等區(qū)域。這為進(jìn)一步深入探討其作用機(jī)制提供了參考依據(jù)，目前仍需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)。