腸侵襲性大腸埃希菌噬菌體DK-13 的生物學特性及應用

王夢雅 劉家齊 姜海霖 李菁華 趙春燕 黃紅蘭

（吉林大學基礎醫學院病原生物學系，長春 130021）

大腸埃希菌（Escherichia coli, E.coli）屬于革蘭氏陰性桿菌，廣泛存在于自然界中，絕大多數屬于正常菌群，但其在具有某些特定毒力因子時具有致病性，能引起人和動物共同感染［1］。且可通過污染被屠宰動物或其他動物源性食品等途徑從食物鏈感染人體［2］，可引起腹部絞痛，帶血和黏液的腹瀉等癥狀［3］。抗生素一直是抗菌的重要手段之一，但由于抗生素的濫用，耐藥菌株的大量出現，導致了未來沒有針對耐藥菌的藥物可用的情況［4］。因此迫切需要開發具有替代作用的新的抗菌策略［5］。

噬菌體在自然界中種類繁多，具有高度多樣化，基本感染現存的所有細菌［6］。其基因組編碼的蛋白質可用于食品安全防治、耐藥菌株引起的感染治療等［7］。噬菌體還被發現在對養殖場飼養的牲畜的殺菌方面有較好的效果，從而限制病原體進入食物鏈的風險，還可用于檢測動物源性食品中的病原體［8］。例如，噬菌體產品SalmoFreshTM和EcoShiledTM已被開發并批準用于食品工業，以抑制食源性微生物［9-10］。噬菌體裂解細菌的功效已經在各種研究中得到證實，使用噬菌體成為用于食品安全防治的有效方法［11-12］。由于多數噬菌體裂解宿主菌的專一性，需篩選并分離新的噬菌體以擴增噬菌體庫以增加宿主范圍，為未來雞尾酒噬菌體制劑應用提供數據參考［13］。

本研究分離得到一株特異性較強的能裂解腸侵襲性大腸埃希菌的噬菌體，是一種潛伏期短、裂解效率高、耐高溫以及耐酸堿的烈性噬菌體，具有應用于食品安全防治的潛力，為以后解決食品污染問題提供了一種新的解決策略。另外本研究還進行全基因組測序并分析預測了裂解宿主菌的相關基因，為進一步研究噬菌體應用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和污水樣品 宿主菌腸侵襲性大腸埃希菌D1 從污染肉制品分離，由吉林大學基礎醫學院病原生物學系保存，經PCR 鑒定為腸侵襲性大腸埃希菌，實驗所用其他大腸埃希菌，蠟樣芽孢桿菌，金黃色葡萄球菌均由吉林大學基礎醫學院病原生物學系保存［14］。污水樣品采集于吉林大學第一醫院污水處理中心。

1.1.2 培養基、主要試劑和儀器 營養瓊脂（NA）、營養肉湯（NB）、改良克氏雙糖鐵培養基管，青島高科園海博技術有限公司；聚乙二醇（PEG8000），Beijing Biotopped Science； DNaseI 酶，RNaseA 酶，大連TaKaRa 公司；SM 緩沖液，武漢卡諾斯科技有限公司；乙二胺四乙酸（EDTA）、Tris 堿,北京康為世紀生物科技有限公司；無水乙醇、冰醋酸，天津市化學試劑有限公司；硫酸，錦州古城化學試劑有限公司；氫氧化鈉，湖北鑫潤德化工有限公司。

1.2 方法

1.2.1 宿主菌的分離與鑒定 吸取20 μL EIEC 凍干粉溶解液加入10 mL NB 中，37℃，160 r/min 培養5 h 后，用無菌接種環蘸取菌液進行分區劃線，過夜37℃培養，第2 天觀察形態，挑取單菌落加入NB中培養后保存。挑取EIEC 單菌落進行PCR 確認試驗以鑒定。

1.2.2 裂解性噬菌體的初步篩選 將未經處理的醫院污水取出300 mL 加入1.8 g 固體CaCl2（0.6%）靜置30 min，5 000 r/min 離 心10 min，取100 mL 的污水上清液和100 mL NB，并與5 mL EIEC 的新鮮菌液混合，37℃培養過夜。次日5 000 r/min 離心3 min，經0.45 μm 濾器過濾后得到噬菌體初提液。取500 μL EIEC 菌液加入試管中，再加入5 mL 半固體培養基（50℃左右），凝固后在表面中心處滴加2-3滴噬菌體初提液，晾干后倒置放入培養箱，37℃培養過夜。次日觀察平板中心是否出現噬菌斑。

1.2.3 噬菌體的分離純化及測定滴度 挑出形態最好的噬菌斑加入宿主菌液中培養8 h，5 000 r/min 離心3 min，所得上清液用0.45 μm 濾器過濾，得到噬菌體純化液。取100 μL 噬菌體液倍比稀釋液與100 μL 宿主菌液混合于試管中，再加入5 mL 半固體培養基（50℃左右），混勻后倒在瓊脂平板上，凝固后37℃倒置培養過夜。次日觀察平板上的噬菌斑形態，挑取單個噬菌斑重復上述操作7-10 次，最終得到純化后的純種噬菌體。

將純化后的噬菌體液進行倍比稀釋，重復一次純化的步驟，37℃恒溫培養過夜后，次日觀察并記錄各稀釋梯度平板上噬菌斑的數量，依據公式算出噬菌體的滴度。

1.2.4 噬菌體形態觀察 參考《分子克隆實驗指南》［15］中關于噬菌體顆粒的PEG/NaCl 沉淀提取法進行噬菌體純化顆粒制備，噬菌體顆粒溶于SM 緩沖液中，4℃保存備用；用負染色法對噬菌體顆粒進行染色，取20 μL 噬菌體顆粒與20 μL 濃度為0.5%的戊二醛混合，滴在銅網上靜置15 min，使噬菌體顆粒固定。用2%的磷鎢酸對噬菌體顆粒進行負染色1-2 min，用濾紙吸干多余液體，用透射電鏡在80 kV 電壓下觀察。拍照并儲存。

1.2.5 噬菌體最佳感染復數（multiplicity of infection,MOI）測定 將培養至對數期，OD600nm≈0.2，菌液濃度約為1×109CFU/mL 的宿主菌液，與已知滴度的噬菌體液（2×109CFU/mL）倍比稀釋，按照噬菌體滴度與宿主菌濃度的比值分別為100、10、1、0.1、0.01、0.001、0.000 1 的比例混勻，37℃，160 r/min培養4 h，取出后用0.45 μm 濾器過濾，濾液倍比稀釋后測定各體系下的噬菌體滴度，滴度最高的體系的比值即噬菌體的最佳感染復數，重復3 次。

1.2.6 噬菌體一步生長曲線及爆發量測定 取最佳MOI 對應的宿主菌液和噬菌體液各500 μL，放入培養箱，37℃培養10 min，將混合液8 000 r/min 離心30 s，吸棄上清液，然后加入1 mL NB 吹打使沉淀重懸，重復兩次。在錐形瓶中加入此懸液，再加19 mL 營養肉湯，放入搖床，37℃，160 r/min，開始每5 min 取樣1 mL，30 min 后，每10 min 取樣1 mL，至100 min 停止取樣。每次取樣都需用0.45 μm 濾器過濾，然后暫時放入4℃保存，待全部取樣完成后，統一取出進行倍比稀釋，測定噬菌體滴度，重復3 次。

1.2.7 噬菌體的熱穩定性和pH 穩定性試驗

（1）噬菌體熱穩定性。將噬菌體液分成4 組，每組6 mL，分別放入50℃、60℃、70℃、80℃的水浴中，每隔10 min 取1 mL 噬菌體液稀釋10 倍，防止高溫影響實驗結果，暫時放入4℃保存，待全部取樣完成后，統一取出進行倍比稀釋，測定噬菌體滴度，重復3 次。

（2）噬菌體pH 穩定性。取1 mL 的噬菌體液加入9 mL 不同pH（1-14）的營養肉湯中，37℃恒溫培養1 h，取出后進行倍比稀釋，用上文的方法測定噬菌體滴度，重復3 次。

1.2.8 噬菌體宿主范圍測定 將實驗室保存的其他大腸埃希菌、蠟樣芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌全部復蘇并培養至對數期，取500 μL 菌液加入小試管中，再加入5 mL 半固體培養基（50℃左右），混勻后使半固體培養基平鋪在瓊脂平板上，凝固后在中心處滴加2-3 滴噬菌體液，晾干后37℃倒置培養過夜。次日觀察各個平板中心是否出現噬菌斑。

1.2.9 噬菌體DK?13 全基因組測序及分析 按1.2.4方法獲得的500 μL 噬菌體濃縮液，加入2.5 μL DNase I（1 mg/mL） 和0.5 μL RNase A（1 mg/mL），之 后 加 入25 μL EDTA，25 μL 蛋 白 酶K 和20 μL SDS，56℃水浴1 h,裂解噬菌體。隨后使用苯酚-氯仿-異戊醇（25∶24∶1）提取噬菌體DNA，送至杭州聯川生物技術股份有限公司進行全基因組測序。使用在線軟件tRNAscan?SE 預測噬菌體中是否含有tRNA;CG view 展示序列中GC skew? 和GC skew+等特性情況的圓形基因圖。

使用ORFs Finder 預測噬菌體DK?13 的開放閱讀 框（ORF）；使 用BLAST（Basic Local Alignment Search Tool）預測并注釋每個開放閱讀框的功能；使用VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）數據預測噬菌體DK?13 是否含有毒力基因；使用CARD（The Comprehensive Antibiotic Resistance Database）數據庫檢索預測噬菌體DK?13 是否含有耐藥基因。

選取噬菌體DK?13 的保守基因DNA 連接酶進行BLASTP（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/），尋找同源性蛋白，再使用MEGA6（https://www.megasoftware.net/）軟件鄰域連接構建噬菌體DNA 連接酶的系統發育進化樹進行進化關系分析。

1.2.10 細菌污染豬肉模型制備及不同溫度下噬菌體DK?13 對污染豬肉的殺菌效果 參考Li 等［16］的實驗方法，將從超市購買的豬里脊肉部分用無菌刀片切成邊長約為2 cm 的正方形薄片，用1 mL PBS 緩沖液沖洗，紫外滅菌2 h，使肉片充分滅菌。滴加100 μL 濃度為1×107CFU/mL 的宿主菌液滴在肉片表面，使其充分接觸，靜置10 min，得到濃度為1×106CFU/sample 的EIEC 污染的豬肉樣品，放入4℃冰箱保存。

取最佳感染復數的宿主菌液的噬菌體液滴在豬肉樣品表面，使其與樣品充分接觸進行殺菌，對照組則滴加等體積的PBS 緩沖液，分別放入4℃冰箱和37℃恒溫培養箱培養6 h。每隔1 h 取樣一次，加入裝有PBS 緩沖液的離心管中，充分震蕩后在相應溫度下，5 000 r/min 離心1 min，吸棄上清后再加1 mL PBS 緩沖液，重懸后在相應溫度下5 000 r/min 離心1 min，重復兩次。將最后一次懸液梯度稀釋，取100 μL 菌液均勻涂布在平板上，37℃倒置培養過夜。次日對平板上菌落進行計數。重復3 次。

2 結果

2.1 噬菌體的分離及其滴度測定

從醫院未經處理的污水中分離出了一株烈性噬菌體，命名為DK?13，采用雙層平板法純化后，得到了純化后的單一噬菌體，噬菌體DK?13 的噬菌斑為圓形，透明且無暈環，直徑約為1-2 mm。結果如圖1?A 所示。

圖1 噬菌體DK-13 的形態特征Fig.1 Morphological characteristics of phage DK-13

通過計算可以得出噬菌體DK?13 的滴度約為2×109PFU/mL。

2.2 噬菌體形態學觀察

如圖1?B 所示，噬菌體DK?13 呈典型的蝌蚪狀外形，包含一個直徑約為100 nm 的正二十面體的頭部和一個可收縮的螺旋對稱的尾部，根據ICTVdb 數據庫的規則分類，噬菌體DK?13 屬于有尾噬菌體目（Caudovirales）肌尾噬菌體科（Myoviridae）T4 噬菌體亞科（Tevenvirinae）噬菌體。

2.3 噬菌體最佳感染復數的測定

噬菌體DK?13 與宿主菌EIEC 的感染復數為0.01時，產生子代噬菌體的數量最多，效價為2.8×1010PFU/mL, 說明噬菌體DK?13 的最佳感染復數為0.01（圖2?A）。

圖2 噬菌體DK-13 的生物學特性Fig.2 Biological characters of phage DK-13

2.4 噬菌體一步生長曲線及爆發量的測定

取最佳感染復數0.01 對應的宿主菌液和噬菌體液各500 μL，測定不同時間噬菌體的滴度。以時間為橫軸，噬菌體滴度的對數為縱軸，繪制一部生長曲線。結果如圖2?B 所示，噬菌體DK?13 的潛伏期約為10 min，裂解期約為70 min，平均爆發量為164 PFU/cell。

2.5 噬菌體穩定性的測定

2.5.1 噬菌體在不同溫度下的穩定性 本試驗測試了噬菌體DK?13 在50℃、60℃、70℃和80℃的條件下，1 h 之內的活性情況。結果如圖3?A 所示，在50℃和60℃時，噬菌體的活性幾乎不發生變化；70℃下噬菌體活性下降，20 min 后完全失活；溫度升高至80℃，噬菌體10 min 后完全失活。結果表明噬菌體DK?13 受溫度影響較小。

圖3 噬菌體DK-13 的生物學特性Fig.3 Biological characteristics of phage DK-13

2.5.2 噬菌體在不同pH 下的穩定性 噬菌體DK?13在pH 1-14 的環境下，1 h 之內的存活情況測試結果如圖3?B 所示：在pH 5-10 的條件下，對噬菌體DK?13 的活性并沒有很大的影響，噬菌體均體現了較高的活性；在pH 4 或pH 11 的條件下，噬菌體的活性略有下降，但依然有大量噬菌體存活；在pH＜4或pH＞11 的條件下，幾乎檢測不到存活的噬菌體。

2.6 噬菌體宿主范圍的測定

將實驗室保存的其他15 株大腸埃希菌，2 株蠟樣芽孢桿菌，3 株金黃色葡萄球菌全部復蘇并培養至對數期，用噬菌體DK?13 進行裂解測定，結果顯示噬菌體DK?13 不能裂解以上任何細菌，只能裂解宿主菌EIEC。說明噬菌體DK?13 的特異性非常強。詳細結果見表1。

表1 噬菌體DK-13 宿主范圍Table 1 Host range of DK-13 phage

2.7 噬菌體全基因組分析

測序結果顯示：噬菌體DK?13 基因組全長172 275 bp，GC 含量為40.18%。tRNAscan?SE 分析結果顯示：噬菌體DK?13 基因組中含有tRNAMet、tRNAArg。噬菌體DK?13 的全基因組信息已上傳至GenBank，登錄號為MT611523。

2.8 噬菌體功能注釋

目前在VFDB 中尚未檢索到噬菌體DK?13 存在毒力基因；在CRAD 數據庫中也尚未檢索到噬菌體DK?13 存在耐藥基因。使用ORFs Finder 和BLAST預測噬菌體DK?13 的開放閱讀框并注釋其功能，預測其共有293 個開放閱讀框（ORF），其中已知功能的ORFs 共有125 個，可分為6 個模塊：復制/重組模塊、包裝基因模塊、結構基因模塊、核苷酸代謝基因模塊、轉錄/翻譯模塊和其他功能模塊，使用DNAMAN 繪制噬菌體DK?13 的基因組注釋圖譜（圖4）。具體包括：（1）復制/重組模塊：DNA 聚合酶（ORF73）在催化合成DNA 中有著重要作用，相關基因還有DNA 連接酶（ORF47）、DNA 解旋酶（ORF92、140、167）。（2）包裝基因模塊：末端酶小亞基（ORF3）和末端酶大亞基（ORF13）。在噬菌體復制過程中，需要對DNA 進行包裝這需要ATP 引導的末端酶蛋白負責將DNA 切成大小序列。T holin 溶解介體（ORF101）是DK?13 參與裂解宿主菌的相關基因，在裂解宿主菌的過程中起著重要作用。（3）結構基因模塊：與結構相關的蛋白編碼基因包括主要頭部蛋白（ORF22）、小外衣殼蛋白（ORF152）及短尾纖維蛋白（ORF7），它們在噬菌體吸附或感染起到重要作用。（4）核苷酸代謝基因模塊：包括還原酶小亞基（ORF76），核苷三磷酸焦磷酸水解酶（ORF155）等核苷酸代謝所需的相關酶類。（5）轉錄/翻譯模塊：與噬菌體的轉錄和翻譯有關的基因有轉錄修飾子（ORF135）和翻譯阻遏蛋白（ORF175）等7 個噬菌體基因在噬菌體合成相關蛋白過程中發揮作用。（6）其他功能基因：這一模塊主要是一些目前對其在噬菌體內的功能尚不可知的蛋白。

圖4 噬菌體DK-13 基因組注釋圖譜Fig.4 Annotation diagram of the genome of DK-13 phage

2.9 噬菌體進化分析

基于噬菌體DK?13 的DNA 連接酶序列，使用MEGA6 軟件，對噬菌體DK?13 做進化關系分析。在GenBank 中BLAST 同源蛋白建立系統發育樹。結果如圖5 所示，噬菌體DK?13 與大腸埃希菌噬菌體vB_EcoM_VR20 具有較近的親緣關系。

圖5 噬菌體DK-13 的進化關系分析Fig.5 Phylogenetic analysis of phage DK-13

2.10 噬菌體DK?13在不同溫度下對污染豬肉殺菌效果的評價

實驗在4℃和37℃的條件下使用噬菌體DK?13處理被EIEC 污染的豬肉樣品。結果如圖6 所示，在4℃條件下，對照組的EIEC 數量在6 h 內幾乎沒有變化，實驗組在噬菌體DK?13 的作用下，EIEC 數量第1 小時后減少了約1.5 個數量級，隨后保持穩定；在37℃條件下，對照組的EIEC 數量在6 h 內不斷增加，共增長了約2 個數量級，實驗組在噬菌體DK?13 的作用下，EIEC 數量第1 小時后減少了約1.5個數量級，6 h 后增長了0.5 個數量級。從結果中可以看出，噬菌體DK?13 在處理被EIEC 污染的豬肉樣品時，4℃的殺菌效果好于37℃。

圖6 不同溫度下噬菌體DK-13 對污染豬肉的殺菌效果Fig.6 Sterilization effect of phage DK-13 at different temperatures on contaminated pork

3 討論

食源性疾病是常見的全球公共衛生問題，引起腹瀉，腹痛等癥狀，主要因烹飪時生熟不分，食品保存不當或廚師不注意衛生所致［17］。EIEC 很容易通過污染的水源和食物進行傳播。研究發現，耐碳青霉烯類腸桿菌科細菌在動物源、零售肉制品源及人源等3 種樣本中傳播，且大腸埃希菌耐藥率最高［18］。由于病原體對食品的污染，食品類行業每年都遭受巨大損失［19］。噬菌體類生物制劑的出現對于食品安全的防治起到了重要作用。

噬菌體是地球上最豐富的生物體，約是全球細菌數量的10 倍［20］，噬菌體是所有新鮮食物中正常微生物中的一部分，已從各種食物中分離出來并且數量通常很多［21］。由于常見的食品滅菌法，如巴氏殺菌法和食品高壓加工法等會影響食品的外觀及營養價值［22］，且因此噬菌體可被用作食品安全的生物防治劑，且噬菌體具有高度安全性，能夠特異性針對某些細菌的感染，并且保留一些食品原有特性和營養價值［23-25］。Perera 等［26］的研究表明，使用ListShieldTM——一種專門針對單核細胞增生李斯特菌的市售噬菌體混合物，處理污染的生菜和煙熏鮭魚等食物后細菌數量顯著降低的同時沒有改變食物的感官特性（包括味覺、視覺和嗅覺）。

本研究從污水中分離一株EIEC 噬菌體DK?13，根據其透射電鏡形態及進化分析表明是一株新的噬菌體，國際病毒分類委員會將其歸類為有尾噬菌體目（Caudovirales）肌尾噬菌體科（Myoviridae）T4噬菌體亞科（Tevenvirinae）噬菌體。噬菌體DK?13潛伏期很短（10 min）,暴發期較短（30 min），暴發量適中（164 PFU/cell）,表明DK?13 在短時間內就可以開始繁殖，在較短時間內就可完成裂解細菌的過程，因此在未來的應用實踐中可較快地發揮作用；DK?13 屬于窄譜噬菌體，與Yuan 等［27］的大腸桿菌噬菌體DY1 同樣特異性較高。一方面專門針對宿主菌，對微生物群影響較小，然而另一方面卻限制了噬菌體的治療范圍［28］。因此，未來使用“雞尾酒療法”噬菌體組合可以更廣泛地覆蓋不同種屬的細菌［29］；DK?13 酸堿耐受性和溫度穩定性較強，具有較寬的工作范圍，對環境要求低。通過生物信息學對DK?13 進行全基因組及進化樹分析，發現噬菌體DK?13 與大腸埃希菌vB_EcoM_VR20 進化關系較為相近，同屬T4 樣噬菌體［30］，有功能的編碼區具有一定程度上的一致性，但沒有明顯的重排。噬菌體DK?13 在4℃下6 h 內對于污染豬肉的EIEC 的殺菌效果比37℃較好。噬菌體可能具有不同的生理特性，在低溫下比高溫更有效，同時也證明噬菌體能夠顯著降低肉制品中大腸埃希菌的污染［31］。噬菌體DK?13 基因組不存在毒力基因與耐藥基因，用于污染肉制品的防治是安全有效的，未來作為生物防治劑,具有應用前景。

當前在食品衛生防治領域，針對幾種主要的食源性致病菌，目前已生產出了相對應的噬菌體制劑：一種針對李斯特的商用單噬菌體制劑可以有效降低切片火腿中李斯特菌的水平，且效果優于乳酸鏈球菌素和乳酸鈉［32］；另一種針對志賀氏菌的噬菌體雞尾酒制劑ShigaShieldTM可以將生菜、雞胸肉和鮭魚等食物中志賀氏菌的水平顯著降低［33］。然而，仍需確定噬菌體對人體的作用及影響，對其生物學特性，免疫特性及基因分析進行更深層次的探究。隨著生物技術的發展，在未來噬菌體將很快被用于食品安全的防治［34］。

4 結論

從醫院污水中新分離的EIEC 噬菌體DK?13，裂解性強，特異性強，對溫度及酸堿穩定性良好，在污染的豬肉樣品中具有較好的殺菌效果。