人參皂苷Rb1通過(guò)AMPK/SIRT1/PGC-1α軸調(diào)節(jié)線粒體裂變?nèi)诤暇徑庀瓪獾姥装Y

韓 雪,白巧云,申 林,卜佳亮,吳 枧,李卓俊,延光海,宋藝蘭,樸紅梅

(1. 吉林省過(guò)敏性常見(jiàn)疾病免疫與靶向研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,2. 延邊大學(xué)附屬醫(yī)院呼吸內(nèi)科,3. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室,4. 延邊大學(xué)醫(yī)學(xué)院,吉林 延吉 133000)

哮喘(bronchial asthma)以氣道炎癥和高反應(yīng)性為主要特征,嚴(yán)重危害人類(lèi)健康[1]。AMP-activated protein kinase(AMPK)作為氧化還原蛋白,能有效調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激,可通過(guò)激活高度保守的NAD+依賴(lài)性去乙酰化酶Sirtuin 1(SIRT1)/NF-κB通路抑制哮喘[2]。 PPARγ coactivator-1α(PGC-1α)在線粒體生物合成和功能調(diào)節(jié)中得到廣泛應(yīng)用[3]。人參皂苷Rb1是人參根莖的重要提取物,具有抗炎,抗凋亡,能夠抑制哮喘氣道高反應(yīng)性等作用[4]。本研究探討了Rb1可能通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)軸改善小鼠支氣管上皮細(xì)胞在CRE誘導(dǎo)下發(fā)生的氧化應(yīng)激線粒體動(dòng)力學(xué)障礙,最終有效緩解哮喘氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展。

1 材料方法

1.1 小鼠哮喘模型的建立及分組動(dòng)物隨機(jī)分成5組(n=9),對(duì)照組(Control)、CRE組、人參皂苷Rb1低劑量(Rb1-L)和高劑量組(Rb1-H)、地塞米松組(Dex)。CRE組小鼠第1～5 d使用濃度為1 g·L-1的CRE溶液經(jīng)鼻內(nèi)(in)給藥致敏。對(duì)照組則給予50 μL生理鹽水。第11-15天,每天用同濃度的CRE(i.n.)在淺麻醉下對(duì)小鼠進(jìn)行連續(xù)激發(fā)。Rb1處理組小鼠灌胃Rb1(10和20 mg·kg-1),連續(xù)5 d,1次/d。對(duì)照組用50 μL生理鹽水灌胃。所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程均已被批準(zhǔn),批準(zhǔn)文號(hào)(SYXK(JI)2020-0009)。

1.2 病理學(xué)染色分析與ROS檢測(cè)用HE和Masson染色肺石蠟切片,使用DCFH-DA(熒光探針?lè)跤?7 ℃,10 min,檢測(cè)細(xì)胞總ROS。用Dihydroethidium(DHE)溶液對(duì)冰凍肺切片染色檢測(cè)組織ROS。

1.3 Western blot提取蛋白后,測(cè)定Drp1、p-Drp1(Ser616)、MFN1、SIRT1、PGC-1α、AMPK和P-AMPK蛋白表達(dá)情況。

2 結(jié)果

2.1 Rb1對(duì)CRE誘導(dǎo)的哮喘小鼠氣道炎癥的影響與CRE模型組相比,Rb1可依照劑量依賴(lài)性降低BALF中嗜酸性粒細(xì)胞占比(P<0.01),并且明顯減輕氣道周?chē)装Y細(xì)胞浸潤(rùn)和膠原沉積。Rb1可明顯降低TH2細(xì)胞因子IL-4、IL-5和IL-13水平(P<0.01),升高IFN-γ表達(dá)(P<0.05),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Rb1還可減少血清中總IgE和CRE-特異性IgE的水平及縱膈淋巴結(jié)中的CD4+IL-4+細(xì)胞比例,增加CD4+IFN-γ+細(xì)胞比例(均P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 Rb1對(duì)肺組織氧化應(yīng)激的作用DHE染色肺組織發(fā)現(xiàn),與CRE組比較,Rb1可隨劑量依賴(lài)性抑制ROS和丙二醛(MDA)的產(chǎn)生,并同時(shí)上調(diào)肺組織內(nèi)過(guò)氧化氫酶(CAT)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量(均P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.3 Rb1對(duì)AMPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路的影響CRE可明顯抑制P-AMPK/SIRT1/PGC-1α蛋白表達(dá),而對(duì)總 的AMPK表達(dá)無(wú)明顯影響。Rb1治療后P-AMPK/SIRT1/PGC-1α蛋白水平明顯升高,且呈劑量依賴(lài)(均P<0.01),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 Rb1對(duì)線粒體裂變?nèi)诤系挠绊慍RE組DRP1和P-DRP1(ser616)蛋白的表達(dá)均明顯上調(diào),MFN1相反,提示CRE誘導(dǎo)了哮喘小鼠肺組織內(nèi)線粒體裂變/融合失衡。然而,這一現(xiàn)象均被Rb1所逆轉(zhuǎn)(均P<0.01)。

3 討論

Rb1提高心肌中的線粒體密度的同時(shí)可激活SIRT1途徑,促進(jìn)線粒體內(nèi)ATP生成,從而保護(hù)心肌細(xì)胞[5]。Chen等[6]報(bào)道,Rb1可明顯抑制Th2細(xì)胞、增加Th1細(xì)胞數(shù)量,糾正哮喘中Th1/Th2的失衡。本研究結(jié)果也證實(shí)了以上觀點(diǎn)。綜上,本研究闡明了Rb1對(duì)CRE誘導(dǎo)哮喘小鼠氣道炎癥的抑制作用及作用機(jī)制。這種機(jī)制可能是通過(guò)激活A(yù)MPK/SIRT1/PGC-1α信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的。由此推測(cè),Rb1有望成為治療過(guò)敏性哮喘的有效化合物。