鄰苯二甲酸二異丁酯
——新型的ANO2通道開放劑

鄭曉恬,白立川,王惠杰,吳 瓊

(中國醫科大學 1.盛京醫院,遼寧 沈陽 110000;2.藥學院,遼寧 沈陽 110122;3.中國醫科大學生命科學院,遼寧 沈陽 110122)

鄰苯二甲酸二異丁酯(diisobutyl phthalate縮寫為DIBP)是塑料工業中廣泛應用的增塑劑和軟化劑,其作用是增加塑料的可塑性和韌性,提高塑料強度。近些年來研究表明該類物質以分子間作用與高分子塑料結合,隨著時間的推移該類物質會逐漸地從塑料制品中釋放出來,從而對環境、生物與食品造成污染,并可通過呼吸、飲食和皮膚進入人體內,對人體健康造成危害。研究提示,DIBP會造成動物的生殖和發育損害[1-3]。目前,只有澳大利亞對DIBP作了風險評估,但在報告中指出有關毒理學數據缺乏,還需完善毒理學資料。基于DIBP與健康密切相關,人們對它的許多安全隱患尚不明確,因此對該物質的毒理學安全性研究和評價就顯得尤為重要。國內外關于其他鄰苯二甲酸酯類物質的神經毒性文獻已有少量報道,如Andral等通過研究指出DEHP孕期染毒,可使新生大鼠下丘腦視前交叉區芳香化酶表達量減低,抑制其活性產生影響導致大鼠神經功能異常[4-5]。DIBP與DEHP為同系物,被廣泛作為增塑劑使用并具有造成神經系統不良影響的潛在危險。如王龍等[6]報道的鄰苯二甲酸二丁酯引發顯著的小鼠學習記憶障礙,而鈣離子通道阻斷藥物尼莫地平對這一毒性作用具有良好的拮抗作用但具體的作用機制還尚未明確。

ANO2(ANOCTAMIN2)又名TMEM16B,屬于TMEM16的成員之一,作為鈣激活的電壓依賴性氯通道調節細胞內外的氯離子跨膜轉運,目前研究表明其主要表達在中樞神系統如嗅覺、聽覺神經元及嗅細胞、視網膜細胞上,生理條件下參與了嗅覺、視覺及聽覺的產生及信號傳遞過程[7-12],而病理條件下異常激活的鈣激活的電壓依賴性氯通道如TMEM16A參與了高鹽飲食誘導的小鼠腦動脈重構[13]。國內外尚未進行廣泛的ANO2的晶體結構、功能調節的研究,嚴重阻礙了靶向ANO2特異性藥物的開發進程,也阻礙了深入研究ANO2通道介導疾病的病理生理機能研究。

本研究基于鄰苯二甲酸酯類物質的神經毒性和ANO2在中樞神經系統內的神經信息傳遞功能,探索鄰苯二甲酸酯類物質是否可通過直接作用在ANO2靶點產生各種神經系統的毒性損傷。研究結果表明DIBP可直接作用于ANO2靶點提高已激活ANO2通道的電導能力,其為小分子量化學分子,結構簡單,故可作為ANO2特異性藥物的先導化合物,為開發靶向ANO2的藥物提供結構信息、為獲得優化的ANO2特異性配體提供堅實的理論基礎。

1 材料與試劑

1.1 實驗材料Human Embryonic Kidney 293細胞(HEK293細胞)購于(中國中科院上海細胞庫),PEGFP-ANO2質粒(中國吉瑪基因),10%聚丙烯酰胺凝膠(上海雅酶生物醫藥科技有限公司),聚丙烯酰胺膜PVDF(美國伯樂公司),硼硅酸鹽玻璃電極(美國Sutter Instrument公司),35 mm培養皿、共聚焦皿(Thermo Fisher)等。

1.2 試劑實驗藥品DIBP、IL-8及鈣熒光染料Fluo-4/F-127(美國Invitrogen公司),ECL發光試劑(中國Biosharp)、脫脂奶粉(美國BD公司)、CsCl、EGTA、NMDG、HEPES、Sucrose等(德國Sigma-Aldrich公司),liposome 2000(美國Invitrogen公司),高糖DMEM培養基(美國Gibco公司),Fetal bovine serum(FBS)(烏拉圭Lonsera公司)等、ANO2抗體(ab113443)、β-actin抗體(ab8226)、辣根過氧化物酶標記的兔抗大鼠二抗(中國Biosharp)等、PCR擴增引物及相應熒光染料(上海生工生物工程股份有限公司)。

2 方法

2.1 細胞復蘇、培養取出液氮罐保存的HEK293細胞,37 ℃水浴中快速融化,1 000 r·min-1離心5 min去上清,10% FBS/DMEM培養基重懸,細胞計數板計數后取適量細胞置于35 mm培養皿中37 ℃、5% CO2培養箱中培養。

2.2 轉染用nanodrop測定經純化后的質粒小提試劑盒提取的DH5α大腸桿菌中的PEGFP-ANO2質粒濃度,按1 μg每35 mm培養皿的劑量,應用liposome2000試劑進行轉染,轉染后6 h更換新鮮的培養液以消除脂質體對細胞的毒性損傷。

2.3 免疫印記及Real-time PCR技術鑒定ANO2的分子身份常規收集培養好的轉染PEGFP-ANO2質粒的HEK293細胞,分別應用RIPA強裂解液、PMSF及超聲的方法破碎細胞,12 000 r·min-1提取蛋白并應用BCA法進行蛋白定量,應用20 μg的總蛋白量電泳分離及恒流轉移到PVDF膜上,5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后分別應用抗ANO2抗體及β-actin抗體4 ℃孵育搖床過夜,隔日加入辣根過氧化物酶標記抗體室溫孵育2 h,TBST 3次清洗后應用ECL發光試劑盒檢測ANO2是否成功表達;應用TRIzol試劑提取總RNA,namodrop檢測總RNA的純度和濃度,應用熒光染料SYBR Green法行real-time PCR檢測ANO2是否特異性表達,上游引物5′-GTCGTTCTTGAAGATCAAAG-3′,下游引物5′-CGA AGAAGGTGTCCTTTTC-3′;β-actin作為內參,上游引物5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′,下游引物5′-CCTGGCACCCAGCACAAT-3′,反應條件95 ℃ 30s、95 ℃ 15s和60 ℃ 30 s、40個循環,單△CT法分析ANO2是否成功表達。

2.4 膜片鉗技術鑒定ANO2分子身份及DIBP對激活狀態下ANO2通道的藥理作用應用美國AXON200b放大器/digita1550B模數轉換器膜片鉗系統進行ANO2的特異性配體的篩選,常規配置電極外液、1 μmol·L-1鈣離子濃度的電極內液,在熒光顯微鏡下采用全細胞記錄模式記錄EGFP陰性/陽性表達的HEK293細胞膜上的氯電流,觀察并記錄加入DIBP藥物前后ANO2氯電流的電生理特性的改變。

2.5 共聚焦顯微鏡檢測IL-8、DIBP對HEK293胞內Ca2+信號的作用將細胞生長狀態良好的HEK293細胞傳入共聚焦皿內繼續培養24 h,貼壁后應用Hanks液洗滌,終體積為1 mL加入3 μL Fluo-4/1 μL F-127的預混鈣離子熒光染料,避光37 ℃孵育45 min后加入1 mL的D-HANKS液清洗3遍。共聚焦顯微鏡下分別檢測10 μmol·L-1IL-8和10 μmol·L-1DIBP對HEK293細胞中鈣離子濃度的影響。

2.6 膜片鉗技術檢測DIBP對靜息狀態下ANO2的藥理作用熒光顯微鏡下選擇綠色熒光蛋白陽性表達的ANO2過表達的HEK293細胞,應用無鈣電極內液填充玻璃微電極及全細胞記錄模式檢測IL-8和DIBP對靜息狀態ANO2的藥理作用。

3 結果

3.1 DIBP的分子特性及化學結構式DIBP為無色、無味、粘稠狀液體,并且熱穩定性好,為鄰苯二甲酸與異丁醇酯化反應生成的化合物,其基本結構見Fig1。

Fig1 The molecular structure of DIBP

3.2 免疫印記、real-time PCR及膜片鉗技術鑒定ANO2的分子身份研究中應用EGFP標記的ANO2表達載體構建其過表達的HEK293細胞模型,采用免疫印記、熒光定量PCR及膜片鉗技術分別從蛋白水平、核酸水平及分子功能水平加以表達鑒定。免疫印記在過表達ANO2表達載體的HEK293細胞中檢測到了特異性表達條帶,實時熒光定量PCR過表達ANO2表達載體的HEK293細胞提取的總RNA中檢測到了ANO2的表達,且溶解曲線為單峰,提示引物特異性強(Fig2);膜片鉗技術在過表達ANO2表達載體的HEK293細胞中檢測到了鈣激活的電壓依賴性氯電流(Fig3)。因此,分別從分子表達水平和功能水平證實成功建立了ANO2過表達的細胞模型,可用于ANO2特異性配體的篩選。

Fig2 Identification of ANO2 expression level after HEK293 cells transfected with EGFP-marked ANO2 overexpression vector

Fig3 The function identification of ANO2 expression after HEK293 cells transfected with EGFP-marked ANO2 overexpression vector

3.3 DIBP對激活狀態ANO2的藥理作用應用膜片鉗技術里的電壓鉗全細胞記錄模式,在1 μmol·L-1Ca2+電極內液的條件下應用ramp和step電壓刺激波形(Fig3)及全細胞記錄模式記錄ANO2激活時的氯電流;待電流穩定后加入10 μmol·L-1的DIBP,結果顯示DIBP明顯增加ANO2通道介導的外向整流的氯電流,其整流能力較加藥前也顯著增強,見Fig4,結果證實DIBP可提高激活狀態下的ANO2介導的氯電流的幅度,即通過延長單通道的開放時間或增加單通道的開放頻率來增強ANO2介導的氯電導。

Fig4 Effect of DIBP on chloride current mediated by activating ANO2

3.4 DIBP對HEK293胞內鈣信號的影響ANO2作為一種鈣激活的電壓依賴性氯通道,其氯離子電導能力與胞漿內的鈣離子濃度成正相關關系,DIBP增強活化狀態ANO2的氯電導作用可能是通過升高胞質內鈣離子濃度介導的。本研究應用Fluo-4/F-127預混的鈣離子敏感的熒光染料孵育HEK293細胞,分別用10 μmol·L-1IL-8(作為陽性對照藥物)和10 μmol·L-1DIBP即時給藥后檢測胞內鈣離子的濃度變化。結果所示,IL-8給藥后可引起胞內游離的鈣離子濃度增加,而DIBP給藥后胞內游離的鈣離子濃度未見改變;結果證實DIBP并非通過升高胞內游離鈣離子濃度間接發揮增強ANO2的氯電導作用,見Fig5。

Fig5 Action of DIBP on intracellular calcium signal in HEK293 cells

3.5 DIBP對靜息狀態ANO2的藥理作用基于某些鈣離子門控離子通道的激動劑可直接開放離子通道,為了證實DIBP是否通過這一作用形式產生ANO2激活作用,故應用膜片鉗-全細胞記錄模式及無鈣電極內液記錄條件下,分別檢測10 μmol·L-1IL-8和10 μmol·L-1DIBP即時給藥后的ANO2介導的氯電流,結果顯示IL-8給藥后可記錄到ANO2介導的外向整流的氯電流,而DIBP給藥后尚未記錄到ANO2介導的外向整流的氯電流,結果表明DIBP并不能直接激活靜息狀態下ANO2,見Fig6。

Fig6 The pharmacological activity of DIBP on resting ANO2 overexpressed in HEK293 cells

4 討論

DIBP為小分子的塑化劑,具有較高的脂溶性,可通過呼吸、飲食和皮膚進入人體內,進而對機體內多種組織器官產生毒性損傷,比如神經毒性、生殖毒性等等,但其致毒性損傷的機制尚未明確,嚴重妨礙了臨床治療DIBP的毒性損傷的治療策略,因此,積極尋找DIBP毒性損傷的特異性靶點具有重要的臨床意義,為開發治療DIBP毒性損傷疾病的藥物提供新的靶點和研究方向。ANO2作為鈣激活的電壓依賴性氯通道,調節細胞內外的氯離子跨膜轉運,目前研究表明,其主要功能活動介導了嗅覺及聽覺的產生及信號傳遞過程,基于ANO2的晶體結構尚未闡明,導致了開發特異性配體藥物研發的延遲。ANO1和ANO2同屬TMEM16(ANOCTAMIN)家族成員,兩者蛋白一級結構中有約60%的氨基酸序列存在一致性,兩者都是作為鈣激活電壓依賴性的氯通道,開發ANO1的特異性配體的研究策略可用于ANO2配體的研究,ANO1的晶體結構于2017年被成功破解,為開發特異性ANO1的配體藥物提供了堅實的基礎[14],近期有研究者證實很多ANO1通道的特異性配體可能并非直接作用于ANO1結構上,而是通過改變胞內游離鈣離子的信號轉導進而產生活化或抑制ANO1的氯通道功能[15],如Eact促進TRPV1介導的鈣離子內流而活化ANO1通道[16]。本研究分別檢測DIBP對ANO2介導的氯電導的作用及DIBP對HEK293胞內鈣信號的作用,結果證實DIBP通過直接作用調節激活狀態下的ANO2的氯電導,此作用是非間接胞內鈣信號介導的。離子通道電導的大小取決于膜上離子通道的數量、單個離子通道開放的時間及單個離子通道的開關頻率[17],本研究中采用過表達ANO2的HEK293細胞為研究對象,其單個記錄細胞膜上的ANO2分子數量在膜片鉗實驗中穩定不變,故推測DIBP可能通過影響單個ANO2氯通道的開放時間或開放頻率提高氯電導作用的,研究中還證實DIBP在電極內液無鈣條件下不能直接活化ANO2,提示DIBP不改變ANO2對電壓的敏感性且不能獨立的活化靜息狀態的ANO2分子,其可能是通過增強ANO2對鈣離子的敏感性進而延長單通道開放時間或開放頻率增強其氯電導。基于ANO2的晶體結構未知,DIBP在ANO2上的特異性結合位點尚無法應用MOE軟件進行預測,后續實驗將要檢測DIBP對ANO1通道電流的作用并進行相應的ANO1/ANO2位點交互突變以尋找特異性的ANO2上的DIBP結合位點。本研究首次證實DIBP具有顯著的增強ANO2氯電導的作用,其可作為ANO2特異性配體的先導化合物,為醫藥企業開發靶向ANO2的特異性配體藥物提供良好的結構信息基礎。

綜上所述,本研究證實DIBP這種小分子化合物,以胞內鈣離子依賴性的方式活化ANO2通道介導的氯電導,該化合物的結構信息為開發靶向ANO2的藥物提供了豐富的結構信息,同時也為深入研究ANO2功能調節機制提供了新的視角,為研究ANO2介導的生理功能及病理功能機制提供了有力的工具藥物。