二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸及其組合對斑馬魚阿爾茨海默病模型認知障礙的改善作用和機制

黃城益,鄧淑怡,宋 采,2

(1.廣東海洋大學食品科技學院,廣東 湛江 524088;2.廣東海洋大學深圳研究院,廣東 深圳 518117)

β淀粉樣蛋白(β-amyloid,Aβ)沉積、膽堿能遞質缺失、神經炎癥和神經元凋亡等在阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease,AD)的發生與發展中起著至關重要的作用。有關AD發病的起因與機制眾說紛紜。其中Aβ假說認為,氧化應激促進β-分泌酶(beta-site amyloid precursor protein cleaving enzyme 1,Bace1)和γ-分泌酶先后切割淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein,APP),產生了Aβ并沉積于腦內,損傷神經元,最終引發AD[1]。而炎癥假說對其進一步解釋,可溶性Aβ寡聚體(Aβ oligomers,O-Aβ)能夠過度激活小膠質細胞釋放促炎因子,小膠質細胞上的Tyro3-Axl-MerTK(TAM)受體酪氨酸激酶之一Axl酶的水平降低,從而降低了小膠質細胞的吞噬作用,進一步加劇了Aβ的積聚[2]。細胞凋亡假說認為,可溶性O-Aβ使電壓依賴性陰離子通道-1(voltage dependent anion channel-1,VDAC1)水平上升,誘導促凋亡蛋白從線粒體內膜釋放到細胞質中,如B淋巴細胞瘤-2(B cell lymphoma-2,Bcl-2)、Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)[3]以及半胱天冬酶(Caspase)家族的Caspase-3和Caspase-9[4],這些促凋亡蛋白使神經元凋亡。已有研究報道,炎癥反應能夠使乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase,AChE)水平上升,而AChE除了能夠導致乙酰膽堿(acetylcholine,ACh)降解,阻礙神經信號傳遞外,還能使細胞對凋亡誘導更敏感,進一步促進細胞凋亡[5],最終導致AD的發生。

已有研究證明Al3+能夠成功誘導斑馬魚AD模型,并應用于阿爾茨海默病的病因和治療研究中,但Al3+誘導AD的中樞神經炎癥機制仍有待研究[6]。我們假設,Al3+一方面使腦內產生Aβ的前體APP,導致Aβ的積累,另一方面使外周炎癥發生,釋放促炎細胞因子進入大腦,激活小膠質炎癥亞型并抑制其吞噬作用,從而加劇Aβ的積累,誘導了促凋亡機制的發生,使神經元細胞死亡,AChE水平上升,導致認知障礙,引發了AD。

當前針對AD的治療藥物療效差,尚無準確靶向中樞神經炎癥的藥物,且副作用大。而omega(n)-3多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acids, PUFAs)作為海洋生物活性物質,是細胞膜的重要組成成分,也是維持人體正常生理活動的必需脂肪酸,具有明顯的抗炎效果且無毒副作用。二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid,EPA)和二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid,DHA)是主要的n-3 PUFAs,增加飲食中EPA的攝入,能夠明顯改善中樞神經炎癥[7]。增加DHA的攝入,能夠明顯改善免疫疾病中氧化損傷、外周炎癥水平等[8]。我們和他人的大量研究證明EPA和DHA能夠改善M1型小膠質細胞的過度激活,減少促炎細胞因子的釋放,增加神經營養因子合成,且均能夠抑制細胞凋亡[9]。但是,我們曾報道EPA具有強大的抗炎、抗氧化作用,而DHA促進神經發育和再生,似對記憶的改善作用更強[10]。由于兩者在食物、衰老和疾病中的比值多變,其單一和最佳組合的功效不明。本團隊曾在Aβ誘導的SH-SY5Y 細胞AD模型上發現,EPA+DHA(1 ∶2)對抗氧化、抗炎和神經保護的作用最佳[11]。本實驗擬解決的關鍵問題是利用Al3+誘導斑馬魚AD 模型比較研究EPA、DHA及EPA+DHA (1:2)對認知障礙及神經炎癥的改善作用及其機制。

本研究通過新物體識別及獎賞記憶實驗評估了斑馬魚的認知和記憶能力;通過ELISA法檢測Aβ、q-PCR檢測APP、Bace1和Axl用于評估斑馬魚腦內Aβ沉積情況及小膠質細胞的吞噬能力;q-PCR測定腦內IL-6和TNF-α,評估斑馬魚炎癥水平;q-PCR檢測腦內VDAC1、Bax、Caspase-3和Caspase-9,評估斑馬魚細胞凋亡情況;q-PCR檢測腦內AChE,進一步評價斑馬魚的認知障礙;利用GC-MS檢測并評估斑馬魚軀干多不飽和脂肪酸的組成和濃度。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑6～8月齡野生型斑馬魚(上海佳譽水族館);棕櫚油(益海嘉里金龍魚糧油有限公司,批號:20200406);EPA(純度:85%,批號:TZSW210310-1)、DHA(純度:85%,批號:TZSW210315-1)均購自西安通澤生物科技有限公司;六水合氯化鋁(西隴科學股份有限公司,批號:7784-13-6);Trizol RNA 提取試劑(廣州齊云生物科技有限公司);HiScript ? Ⅱ Q Select RT SuperMix反轉錄試劑盒(批號:7E472J0)和SYBR qPCR Master Mix熒光染料試劑盒(批號:7E551A1)均購自南京諾維贊生物科技有限公司;RNA引物由上海生物工程股份有限公司合成。

1.2 實驗方法

1.2.1分組及處理方式 野生型斑馬魚隨機分成5組:對照組、模型組、DHA、EPA和DHA+EPA (2 ∶1)治療組。其中DHA+EPA的比例,根據團隊中已發表的研究選擇2 ∶1。對照組在pH值為6.0±0.2 的清水中并飼喂含棕櫚油質量分數為1%的飼料;將模型組以及治療組的斑馬魚暴露在含Al3+質量濃度為100 μg·L-1,pH值亦為6.0±0.2的清水中,模型組飼喂含棕櫚油質量分數為1%的飼料,治療組分別喂食含DHA、EPA和DHA+EPA(2 ∶1)質量分數均為1%的飼料;每天測量并使用鹽酸溶液調節水的pH值。實驗周期為30 d。

1.2.2行為學實驗 新物體識別實驗于T形迷宮中評價成年斑馬魚的認知能力。T形迷宮由透明有機玻璃制成,外部各臂粘有黑色塑料自黏膜,利用不透光的黑色塑料自黏膜鏤空裁出三角形、正方形和圓形,并將自黏膜分別粘于起始臂、訓練臂和新臂。將斑馬魚放入起始臂,關閉新臂,使其在起始臂和訓練臂中自由活動30 min,24 h后打開新臂,將斑馬魚仍從起始臂放入,使其自由探索迷宮5 min,記錄到達新臂的潛伏期、進入新臂的次數以及在新臂中活動的時長。獎賞記憶實驗亦于T形迷宮中,利用斑馬魚對食物的偏好性,評價斑馬魚的記憶水平。將斑馬魚放入起始臂,自由活動30 min,在訓練臂和獎勵臂各放置一個投食環,僅在獎勵臂的投食環中每10 min投放少量飼料,24 h后,撤去兩端的投食環,將斑馬魚仍從起始臂放入,使其自由探索迷宮5 min,記錄第一次到達獎勵臂的潛伏期。當天結束試驗后,使斑馬魚在迷宮中自由活動20 min,在獎勵臂的投食環中每10 min投放少量飼料,進行強化記憶訓練。第2、3和4天重復第1天的實驗步驟,第4天測試結束后不再進行強化訓練。

1.2.3GC-MS檢測脂肪酸 脂肪酸提取及甲酯化:稱取斑馬魚軀體200 mg,加入適量氯仿-甲醇溶液(2 ∶1)研磨均勻,室溫離心(3 600 r·min-1, 2 min)取上清加入圓底玻璃試管中,與7 mL氯仿-甲醇溶液混合,充滿氮氣后充分渦旋。加入2.5 mL 生理鹽水,充滿氮氣后充分渦旋,室溫離心(500 r·min-1, 20 min)。吸取下層溶液過濾于無水硫酸鈉,3 mL 氯仿緩慢滴洗后收集濾液并用氮氣吹干。于樣品中加入2 mL 0.5 mol·L-1NaOH的甲醇溶液, 90 ℃水浴15 min。冷卻后加入2 mL 14% 三氟化硼-甲醇溶液, 90 ℃水浴30 min。冷卻后加入2 mL 飽和氯化鈉溶液和3 mL 正己烷,萃取2次,僅收集上層溶液。合并2次上層溶液,氮氣吹干,得到脂肪酸甲酯,加入正己烷稀釋至所需濃度,用0.45 μm濾膜過濾,可于-20 ℃保存待測。GC-MS儀器參數:色譜柱InterCap Pure-WAX(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為氦氣,流速1 mL·min-1,分流比1 ∶50,進樣器溫度250 ℃,檢測器溫度250 ℃,進樣量1 μL。采用程序升溫:80 ℃保留2 min,以10 ℃·min-1升至120 ℃,保留5 min,以10 ℃·min-1升至180 ℃,保留5 min,以10 ℃·min-1升至240 ℃,保留8 min。MS條件及參數:離子源溫度:230 ℃,接口溫度:250 ℃,采集方式:Q3 Scan。

1.2.4qPCR檢測 取適量斑馬魚腦組織,利用Trizol提取RNA,測定RNA濃度,利用ddH2O稀釋統一RNA質量,根據反轉錄試劑盒說明書操作,得到cDNA,利用熒光染料試劑盒于PCR儀檢測IL-6、TNF-α、CD206、APP、Bace1、Axl、AChE、VDAC1、caspase-3、caspase-9、和Bax的mRNA水平,并計算得到相對mRNA水平。各引物序列如Tab1。

Tab1 Primer sequence of qPCR

2 結果與分析

2.1 EPA、DHA及其組合對Al3+誘導斑馬魚記憶障礙的改善作用由Fig1所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯增加了d 1～4天斑馬魚進入獎勵臂的潛伏期(P<0.01,P<0.01);與模型組相比,給予DHA(P<0.01,P<0.01)和DHA+EPA(2 ∶1)(P<0.01)均明顯改善了d 1～4斑馬魚進入獎勵臂的潛伏期,且DHA+EPA的改善效果更好,而EPA僅明顯改善了d 2～4的潛伏期(P<0.01)。

Fig1 DHA, EPA and their combination significantly inhibited memory deficit of zebrafish induced by Al3+ exposure(n=11-12)

2.2 DHA及其與EPA的組合抑制甚至逆轉了Al3+誘導的斑馬魚認知障礙由Fig2所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯增加了斑馬魚到達新臂的潛伏期(P<0.01),明顯降低了進入新臂的持續時間(P<0.05)和次數(P<0.05);與模型組相比,DHA+EPA(2 ∶1)均明顯逆轉了Al3+暴露后到達新臂的潛伏期(P<0.01)、進入新臂的持續時間(P<0.01)和次數(P<0.01),而DHA 僅明顯改善了到達新臂的潛伏期(P<0.01),EPA則均無明顯的改善作用。上述結果表明組合的抑制效果最佳。

Fig2 DHA and DHA+EPA significantly reduced or even reversed increased latency of zebrafish to reach new arm (A), the duration in new arm (B) and the number of entries into new arm (C) in Al3+

2.3 EPA與DHA改善Al3+對斑馬魚軀體omega-3多不飽和脂肪酸的降低由Fig3所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯降低了斑馬魚軀體EPA(P<0.01)、DPA(P<0.01)和DHA(P<0.05)的濃度,明顯增加了AA(P<0.05)的濃度;與模型組相比,單獨EPA明顯增加了斑馬魚軀體EPA(P<0.05)和DPA(P<0.05)的濃度,明顯降低了AA的濃度(P<0.05);DHA明顯增加了軀體DHA的濃度(P<0.05),明顯抑制了AA濃度的增加(P<0.01);DHA+EPA(2 ∶1)明顯逆轉了AA的濃度增加(P<0.01),對AA濃度的降低效果最佳。

Fig3 DHA, EPA and their combination significantly ameliorated decrease in EPA (A), DHA (B) and DPA concentration (C),while inhibited AA (D) in zebrafish

2.4 EPA、DHA及其組合對Al3+暴露后斑馬魚腦內神經病理變化的改善作用

2.4.1EPA、DHA及其組合對Aβ蛋白濃度以及APP和Bace1 mRNA表達的干預作用 由Fig4.1所示,與對照組相比,Al3+暴露后明顯增加了斑馬魚腦內Aβ蛋白濃度以及APP和Bace1的mRNA水平,DHA和EPA則明顯逆轉了APP(P<0.01,P<0.01)和Bace1(P<0.01,P<0.01)的mRNA水平變化,DHA和DHA+EPA(2 ∶1)均明顯抑制了Aβ蛋白濃度的上升(P<0.05,P<0.05)。其中單獨EPA對APP mRNA表達具有最佳的抑制作用。

Fig4.1 DHA, EPA and their combination significantly reduced level of Aβ related parameters in zebrafish brain of Al3+ model group: Aβ protein concentration (A) and relative mRNA level of APP (B) and Bace1

2.4.2EPA、DHA及其組合對神經炎癥、小膠質亞型及其吞噬清除能力的作用 Fig4.2顯示,與對照組相比,Al3+明顯增加了斑馬魚腦內TNF-α(P<0.01)和IL-6 (P<0.01)的mRNA水平,明顯降低了小膠質細胞M2型標志物CD206(P<0.01)和吞噬清除Aβ相關基因Axl(P<0.01)的mRNA水平;與模型組相比,3種藥物治療明顯降低IL-6的mRNA表達水平(均為P<0.01)明顯增加CD206的mRNA水平(均為P<0.01);而DHA及DHA+EPA明顯上調甚至逆轉了Axl mRNA水平的降低(分別為P<0.001,P<0.05),DHA和EPA則明顯逆轉了TNF-α mRNA的增加(均為P<0.01)。從P值可以看出,單獨DHA對IL-6和Axl水平的變化具有最佳的逆轉作用。

Fig4.2 DHA, EPA and their combination significantly inhibited and even reversed increase of TNF (A) and IL-6 (B) and decrease of CD206 (C) and Axl (D) in zebrafish brain after

Fig4.3 DHA, EPA and their combination reversed increase of AChE in zebrafish brain after Al3+exposure(n=6-8)

2.4.3EPA、DHA及其組合對AChE mRNA表達的抑制作用 Fig4.4顯示,與對照組相比,Al3+明顯增加了斑馬魚腦內AChE(P<0.01)的mRNA水平;與模型組相比,DHA(P<0.01)、EPA(P<0.01)、DHA+EPA(2 ∶1)(P<0.01)均明顯改善甚至逆轉了Al3+暴露后AChE的mRNA水平,其中單獨DHA和DHA+EPA(2 ∶1)的改善效果優于單獨EPA,且作用相似。

Fig4.4 DHA, EPA and their combination significantly alleviated and even reversed increased apoptosis related factors mRNA level in zebrafish brain after Al3+exposure: VDAC1 (A), caspase-3 (B), caspase-9 (C) and Bax (D)(n=7-9)

2.4.4EPA、DHA及其組合對腦內神經元凋亡的抑制作用 由Fig4.3所示,與對照組相比,Al3+明顯增加了斑馬魚腦內VDAC1(P<0.01)、Caspase-3(P<0.01)、Caspase-9(P<0.05)和Bax(P<0.05)的mRNA水平;EPA、DHA及組合治療均降低了Al3+增加Caspase-3(均為P<0.01)、Caspase-9(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.01)和Bax(分別為P<0.05,P<0.01,P<0.01)的mRNA水平。而單獨給予DHA(P<0.01)和DHA+EPA(2 ∶1)(P<0.01)明顯改善甚至逆轉了VDAC1的mRNA水平。P值進一步顯示,DHA+EPA (2 ∶1)對Caspase-3和Bax水平的升高有更好的改善作用。

3 討論

眾多動物實驗和臨床研究證明,n-3 PUFA作為重要的膜成分之一,通過增加膜流動性、減少氧化應激、抑制神經炎癥反應和凋亡途徑[12],從而改善或預防神經退行性疾病。本研究首次比較了EPA和DHA及其組合對Al3+誘導的斑馬魚AD模型中認知障礙和神經病理性變化的不同作用,然后探討EPA和DHA在該模型中的潛在協同作用。根據這些結果,我們發現DHA和EPA及其組合具有改善甚至逆轉認知障礙和神經病理性變化的作用。其機制涉及不同程度地抑制神經炎癥反應,恢復小膠質細胞的吞噬作用,降低AChE水平上升,減少神經元凋亡。本研究將從以下幾個發現進行討論。

3.1 EPA和DHA的組合對認知障礙具有最佳的逆轉作用本研究結果顯示,與AD患者的行為相似,暴露于Al3+的斑馬魚出現認知與記憶障礙,說明Al3+誘導的斑馬魚AD模型成立。臨床實驗表明,長期攝入n-3 PUFAs能改善衰老和早期AD引起的認知和記憶衰退[13],本研究的行為結果進一步支持該臨床研究發現。在獎賞記憶實驗中,DHA和EPA及其組合均明顯降低了斑馬魚進入獎勵臂中的潛伏期,其中兩者的組合具有最佳的改善記憶的作用。在新物體識別實驗中,單獨EPA無明顯改善作用,單獨DHA則明顯降低了斑馬魚到達新臂的潛伏期,而DHA+EPA的組合不僅明顯降低了到達新臂的潛伏期,還明顯增加了在新臂中的持續時間以及進入新臂的次數,說明在Al3+暴露下,此組合比單獨DHA或EPA對記憶和認知障礙具有更好的抑制作用,其組合的作用機制可能與以下討論結果相關。

3.2 EPA和DHA的組合對AA濃度上升具有最佳的抑制作用我們在機制方面首先探討了三種治療方式對斑馬魚軀干中EPA、DHA、DPA和AA濃度的干預效果。結果表明,Al3+明顯降低了斑馬魚軀體中EPA、DPA和DHA的濃度,明顯增加了AA的濃度,這些結果證明Al3+抑制抗炎omega-3,增加促炎omega-6 PUFAs合成, 前人在其他動物AD模型上也有類似的結果。并且我們發現,給予單獨EPA明顯增加了Al3+暴露后斑馬魚軀干中EPA和DPA的濃度,明顯降低了AA的濃度;單獨DHA明顯改善DHA濃度的降低和AA濃度的升高;而DHA+EPA的組合雖然對EPA、DPA以及DHA沒有明顯的干預效果,但對AA濃度上升的抑制作用最佳。已有動物實驗表明,AA濃度反映了動物體內的炎癥水平,且與記憶和認知能力呈負相關[14]。因為我們認為,在本研究中,DHA和EPA在這個比例的組合具有協同作用,可能是通過降低斑馬魚軀干AA的濃度來抑制斑馬魚體內的炎癥水平,從而改善Al3+誘導的斑馬魚記憶和認知障礙。

3.3 EPA、DHA及其組合對Aβ蛋白濃度及其相關蛋白水平表達的抑制作用有研究發現,給予的飼料中降低n-3/n-6比例能夠使APP/PS1轉基因小鼠大腦中Aβ濃度增加[15],且我們團隊曾發現EPA的抗炎活性能夠抑制IL-1β誘導的Aβ前體APP的表達[16]。本研究的結果證明,給予單獨DHA或EPA均明顯逆轉了Al3+誘導斑馬魚腦內Bace1和APP的mRNA水平的增加。雖然單獨DHA與組合均明顯降低了Aβ的蛋白濃度,但兩者之間無明顯差異。因此我們認為DHA+EPA的組合可能主要不是通過干預Aβ的生成而達到改善斑馬魚記憶和認知障礙的最佳效果。這一結果間接地提示多年來作用于Aβ的藥物研發屢屢失敗的潛在原因。

3.4 單獨DHA對神經炎癥、小膠質細胞激活及其吞噬清除能力有最佳的逆轉效果本研究也同樣發現,與對照組相比,Al3+成年斑馬魚腦內M1標志物CD11表達增加,抗炎M2型小膠質細胞標志物表達明顯降低,與之對應,促炎細胞因子的表達明顯上升,說明Al3+的刺激能夠誘導斑馬魚腦內炎癥的發生,使小膠質細胞功能紊亂。由于小膠質細胞具有吞噬Aβ的功能,對AD的發生與發展起到了重要的作用[17]。本研究發現Al3+的刺激不僅引發了中樞神經炎癥,還降低了小膠質細胞的吞噬能力,由此加劇了Aβ在腦內的積累,誘導了斑馬魚AD的發生。3種PUFAs干預后,DHA對降低炎癥指標TNF-α和IL-6、抑制小膠質細胞過度激活并恢復其吞噬功能具有最佳的效果,說明單獨DHA可能是通過恢復小膠質細胞的對Aβ的吞噬作用而干預Al3+誘導的斑馬魚認知和記憶障礙。但未知組合PUFAs干預斑馬魚認知和記憶障礙最佳療效的作用機制。

3.5 DHA+EPA的組合對AChE水平的增加和腦內神經元凋亡的抑制作用最佳AChE在膽堿能突觸間能夠降解ACh,阻礙神經信號傳遞,AChE過度活躍是引起記憶和認知障礙的原因之一[5]。本研究發現,單獨DHA和EPA以及兩者組合均明顯降低了AChE的mRNA水平,其中組合的干預作用最佳,說明DHA和EPA在這個比例下對AChE水平的降低具有協同作用。

3.6 PUFAs組合對細胞凋亡的抑制作用最佳AD的細胞凋亡假說認為,可溶性O-Aβ使神經元細胞的陰離子通道VDAC1水平上升,誘導促凋亡蛋白從線粒體內膜釋放到細胞質中,如Bcl-2相關X蛋白(Bcl-2 associated X,Bax)[3]以及Caspase家族的Caspase-3和Caspase-9[4]這些蛋白使神經元凋亡。本研究發現,Al3+明顯增加腦內VDAC1、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA表達水平,說明Al3+模型符合AD的細胞凋亡假說。EPA和DHA及其組合干預均逆轉了VDAC1、Bcl-2、Bax、Caspase-3和Caspase-9的mRNA水平的上升,而DHA+EPA的組合具有最佳的干預效果。綜上所述,DHA和EPA的比例為2 ∶1時,在抑制細胞凋亡相關蛋白的表達方面具有協同作用,并且對AChE表達的最佳抑制作用可進一步降低了神經元與細胞凋亡相關蛋白的結合,從而實現對Al3+誘導的斑馬魚記憶和認知障礙的最佳干預效果。