蛇莓提取物通過GPX4誘導鐵死亡抑制腎癌細胞OS-RC-2增殖

游贛花,安群英,何 娟,李 凱,楊 萌,文 周,錢 城,朱建國

(1.貴州省第二人民醫院科研科,貴州 貴陽 550004; 2.衡水市第六人民醫院全科醫學科,河北 衡水 053200;3.貴州中醫藥大學第二附屬醫院口腔科,貴州 貴陽 550003;4.貴陽學院生物與環境工程學院,貴州 貴陽 550005;5.遵義醫科大學 研究生院,貴州 遵義 563000;6.中國人民解放軍聯勤保障部隊第九二五醫院質量管理科,貴州 貴陽 550000;7.貴州省人民醫院泌尿外科,貴州 貴陽 550000)

腎細胞癌(renal cell carcinoma,RCC)是泌尿系統最常見的腫瘤之一,也是泌尿系腫瘤中致死率最高的腫瘤之一[1]。2020年,全球新患RCC病例43.1萬例,因RCC死亡17.9萬例[2]。世界衛生組織根據其分子、遺傳特征形態對腎癌進行了分類,腎透明細胞癌是RCC中最常見的亞型。在診療過程中,約30%的RCC患者在診斷時被發現腫瘤細胞已經發生轉移,30%～70%的RCC患者在手術治療后仍有可能復發[3]。因此,進一步明確RCC的發病機制,并開發出新型、高效、低毒的化療藥物對于治療這種惡性腫瘤至關重要。

鐵死亡是一種調節性細胞死亡形式,由鐵依賴性的脂質過氧化引起[4-5],谷胱甘肽過氧化物酶4(glutathione peroxidase 4,GPX4)通過將脂質氫過氧化物轉化為無毒脂質醇來預防鐵死亡[6-7]。研究表明,抑制GPX4誘導鐵死亡已成為觸發癌細胞死亡的治療策略之一[8]。因此,通過誘導腎癌細胞發生鐵死亡可能是一種有前景的治療策略。

本研究旨在探討蛇莓醇提物誘發活性氧(reactive oxygen species,ROS)積累引發RCC細胞發生鐵死亡,進一步抑制腎癌細胞OS-RC-2增殖,為開發具有潛在抗RCC作用的新藥提供理論基礎。

1 實驗材料

1.1 蛇莓蛇莓購買于貴州省貴陽市中藥材市場,由貴州省食品藥品檢驗所中藥室專家進行鑒定,鑒定結果為薔薇科蛇莓屬植物蛇莓Duchesneaindica(Andr.) Focke。

1.2 細胞株OS-RC-2腎透明細胞癌細胞購買于武漢普諾賽公司,經過STR鑒定。

1.3 主要試劑胰酶(美國Gibco,批號:2428760);RPMI 1640培養液(美國Gibco,批號:8122551);胎牛血清(以色列BI,批號:2351431);ROS分析試劑盒(江蘇凱基,批號:20220621);流式凋亡試劑盒(Meilunbio,批號:MA0220);谷胱甘肽(glutathione,GSH)檢測試劑盒(上海索萊寶,批號:20220408);丙二醛(malondialdehyde,MDA)檢測試劑盒(上海索萊寶,批號:20220414);細胞活力(cell counting kit,CCK-8)檢測試劑盒(日本同仁,批號:SX748);BCA蛋白濃度測定試劑盒(上海索萊寶,批號:20220225);超敏化學發光試劑(新賽美,批號:20230208);NAC(MCE,HY-134495);Fer-1(MCE,HY-100579);GAPDH抗體(CST,5174S);GPX4抗體(三鷹,67763-1-lg); HO-抗體(Abcam,ab68477); SLC7A11抗體(Abcam,ab275411);Transferrin抗體(Abcam,ab214039);Dulcitol(上海MCE,CAS號:608-66-2)。

1.4 主要儀器CO2細胞培養箱(日本SANYO);流式細胞儀(美國Beckman);酶標儀(美國Bio-teck);化學發光成像系統(美國SYNGENE)。

2 主要方法

2.1 蛇莓活性成分及潛在作用靶點的獲取利用HERB本草組鑒數據庫(http://herb.ac.cn/)獲取蛇莓化學成分,Swiss target數據庫(https://swisstargetprediction.ch)獲取蛇莓各成分對應的靶點。利用Genecards(https://www.genecards.org/)數據庫,以“ferroptosis”為關鍵詞進行檢索,以種屬為“Homo(智人)”,相關性大于“1”為篩選標準,獲取鐵死亡的相關基因,用Cytoscape3.5.1軟件展示蛇莓-成分-靶點的關系。

2.2 蛇莓活性成分和鐵死亡核心靶點的分子對接利用pubchem數據庫(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)獲取蛇莓成分的分子結構,保存為SDF格式,利用MOE2020.09軟件對分子結構進行能力最小化;利用RCSB PDB(https://www.rcsb.org/)數據庫,獲取GPX4的蛋白結構,編號為“2OBI”,利用MOE2020.09軟件對蛋白結構去除配體、水分子、計算電荷,隨后對蛇莓化合物配體和GPX4蛋白受體進行分子對接,對接次數為30次。

2.3 藥物的提取及配制蛇莓醇提物:取適量干燥的蛇莓全葉粉碎后用70%乙醇浸泡2 h,回流提取3次(每次1 h),隨后合并提取液,過濾后,減壓回收溶劑至無醇味,得到浸膏。稱取浸膏100 mg充分溶解于DMSO中,加細胞培養液定容至20 mL,0.22 μm小濾器過濾,制備成母液(5 g·L-1)備用。根據需要稀釋至所需濃度給藥(DMSO終濃度<0.2%)。

2.4 細胞的培養快速從液氮罐中取出細胞,經37 ℃水浴,再加入5～10倍體積的完全培養液低速離心5 min后棄上清液,加入1 mL 10%培養液重懸細胞后,加培養液至4 mL,置于37 ℃含5% CO2培養箱內,24 h后更換新培養液。

2.5 CCK-8檢測按4×103個OS-RC-2細胞接種于96孔板,細胞貼壁后進行藥物處理,每組分別設3個復孔,并設置2個調零孔,繼續培養72 h,然后加入10 μL CCK-8在37 ℃下孵育1.5 h,用酶標儀在450 nm處測量吸光度值。

2.6 ROS水平檢測按1×106個/孔將細胞接種于6孔板,按照不同分組分別對相應的孔進行處理,CO2培養箱內培養24 h。向孔中加入DCFH-DA使終濃度為10 μmol·L-1,吹打混勻后放入培養箱內避光孵育。流式細胞儀上機檢測,使用488 nm激發波長,525 nm發射波長,各組細胞的平均熒光強度反映了細胞內的ROS水平。

2.7 流式細胞凋亡檢測將對數生長期的OS-RC-2細胞接種于6孔板內,進行所需的處理(加藥或不加藥),48 h后終止培養。收集細胞,加入600 μL 1×Binding Buffer輕輕重懸細胞,加入5 μL Annexin V-FITC輕輕混勻后室溫避光孵育20 min,加入10 μL PI染色液,混勻,冰浴避光放置5 min,在30 min內進行流式細胞檢測。

2.8 GSH檢測5×106個OS-RC-2細胞加入1 mL GSH檢測試劑,在液氮或37 ℃水浴鍋中反復凍融3次,8 000×g離心10 min,取上清置于冰上待測,并按說明書進行操作。蛋白濃度計算GSH含量(μg·mg-1prot)=x÷Cpr(Cpr:上清液蛋白質濃度,x為標準曲線斜率)。

2.9 MDA檢測5×106個細胞離心收集后,超聲波破碎,取上清,測定管和空白管分別加入300 μL MDA工作檢測液,測定管加入100 μL樣品,空白管加入100 μL蒸餾水;混合液在100 ℃水浴中放置60 min,置于冰浴中冷卻,10 000g常溫離心10 min。吸取200 μL上清液于96孔板中,測定各樣本在532 nm和600 nm處的吸光度。MDA含量(nmol·mg-1prot)=53.763×ΔA÷Cpr(Cpr:樣本蛋白質濃度,g·L-1)

2.10 Western blot蛋白表達檢測提取細胞總蛋白,上樣濃度為每孔40 μg,利用SDS-PAGE進行電泳,將蛋白條帶轉移到PVDF膜上,牛奶封閉液中室溫下搖床封閉1 h;加入GPX4、SLC7A11、Transferrin、HO-1一抗工作液置4 ℃冰箱過夜;TBST 緩沖液(pH 7.4)洗膜,室溫下孵育稀釋的二抗1.5 h;TBST洗膜,ECL發光液顯影。同法封閉、孵育GAPDH。ImageJ軟件對條帶進行灰度分析。

2.11 統計學分析使用GraphPad 9.0軟件對數據進行統計分析,結果表示為。對數據進行正態分布檢驗,服從正態分布時,兩兩比較采用LSD-t檢驗,多組間比較采用單因素方差分析;不服從正態分布時,采用Mann-Whitney或Kruskal-Wallis分析兩個或多個組之間的差異,檢驗水準α=0.05。

3 結果

3.1 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞增殖、ROS水平的影響CCK-8檢測不同濃度(0～24 mg·L-1)的蛇莓醇提物給藥24、48、72 h后對OS-RC-2細胞活力的影響。結果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物可呈時間及濃度依賴性抑制OS-RC-2的細胞活力,見Fig1A。

Fig1 Duchesnea indica (Andr.) Focke alcohol extract inhibited OS-RC-2 cell proliferation and increased ROS

采用ROS試劑盒檢測蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞ROS水平的影響。結果顯示,與對照組相比,5、15 mg·L-1兩個濃度的蛇莓醇提物明顯促進了OS-RC-2細胞的ROS水平,見Fig1B、1C。

3.2 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞凋亡的影響流式細胞儀檢測蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞凋亡的影響。結果顯示,與DMSO對照組相比,1.25、2.5、5、10、20 mg·L-1的蛇莓醇提物給藥明顯促進OS-RC-2細胞凋亡。然而,5、10、20 mg·L-1的給藥濃度引起的各組間細胞凋亡率并無顯著差異,提示蛇莓醇提物抑制OS-RC-2細胞增殖可能并非通過凋亡途徑,見Fig2。

Fig2 Effect of Duchesnea Indica extract on apoptosis of OS-RC-2

3.3 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞GSH、MDA含量的影響檢測5、10、15 mg·L-1蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞GSH、MDA含量的影響。結果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物給藥后明顯降低OS-RC-2細胞的GSH含量,見Fig3A;而MDA含量顯著增加,見Fig3B。

Fig3 Effect of Duchesnea Indica (Andr.) Focke alcohol extract on content of OS-RC-2 GSH and

3.4 鐵死亡抑制劑、ROS抑制劑對蛇莓醇提物抑制OS-RC-2細胞增殖的影響為進一步研究蛇莓醇提物抑制OS-RC-2細胞增殖的機制,本課題利用鐵死亡抑制劑Fer-1或ROS抑制劑NAC預處理細胞,并將實驗分為4組,即:DMSO對照組、Fer-1(1 μmol·L-1)組、蛇莓醇提物(10 mg·L-1)組、Fer-1+蛇莓醇提物聯合給藥組,或:DMSO對照組、NAC(5 mmol·L-1)組、蛇莓醇提物(10 mg·L-1)組、NAC+蛇莓醇提物聯合給藥組,用CCK-8進行細胞活力檢測。結果顯示,相較于蛇莓醇提物單獨給藥組,Fer-1與蛇莓聯合給藥組顯著回復蛇莓醇提物單獨給藥引起的細胞活力降低,見Fig4A;相較于蛇莓醇提物單獨給藥組,ROS抑制劑NAC與蛇莓聯合給藥組逆轉了蛇莓醇提物單獨給藥引起的細胞活力降低,見Fig4B。

Fig4 Effects of ferroptosis and ROS inhibitors on proliferation of OS-RC-2

3.5 網絡藥理學、分子對接研究蛇莓中潛在的藥效物質利用Herb數據庫對蛇莓的主要成分進行查詢,蛇莓草藥編號為:HERB004977,數據庫顯示蛇莓主要成分有Ducheside A(蛇莓苷A)、Ducheside B(蛇莓苷B) 、Rosamultin(野薔薇苷)、Pomolic acid(坡模醇酸)、Dulcitol (衛矛醇)、Roseoside(玫瑰花苷)、Ponalactone A(波那內酯A)等。

隨后利用Cytoscape軟件對蛇莓-成分-靶點進行可視化,如Fig5A;接下來,利用MOE軟件對蛇莓的主要成分與鐵死亡的核心靶點GPX4進行分子對接。結果顯示,衛矛醇與GPX4蛋白受體-配體復合物結合穩定,結合能為-6.5 kJ·mol-1。衛矛醇與GPX4蛋白受體的ARG-152、ILE-129、LYS-135存在四對相互作用并存在4個氫鍵,見Fig5B,這提示蛇莓中的衛矛醇可能直接作用于GPX4誘導OS-RC-2細胞發生鐵死亡。

Fig5 Composition and target of Duchesnea Indica (Andr.) Focke

3.6 蛇莓醇提物對OS-RC-2細胞鐵死亡蛋白標志物的影響因蛇莓醇提物明顯降低OS-RC-2細胞的GSH含量并增高MDA含量和ROS水平,鐵死亡抑制劑Fer-1和ROS抑制劑NAC逆轉了蛇莓醇提物引起的細胞活力下降,且網絡藥理學和分子對接發現蛇莓醇提物中的衛矛醇可能作用于鐵死亡的關鍵靶點GPX4,表明蛇莓醇提物誘發了OS-RC-2細胞鐵死亡。為明確蛇莓醇提物引起OS-RC-2細胞發生鐵死亡的分子機制,進行了Western blot檢測。結果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物明顯增加Transferrin、HO-1蛋白水平并降低了GPX4,SLC7A11蛋白水平,見Fig6A、6B。

Fig6 Effect of Duchesnea Indica (Andr.) Focke alcohol extract on level of ferroptosis

接下來,將實驗分為以下四組:DMSO對照組、Fer-1(1 μmol·L-1)組、蛇莓醇提物(10 mg·L-1)組、Fer-1+蛇莓醇提物聯合給藥組。Western blot結果顯示,Fer-1與蛇莓聯合給藥組能明顯逆轉蛇莓單獨給藥所引起的Transferrin、HO-1蛋白水平升高及GPX4,SLC7A11蛋白水平降低,見Fig6C、6D。

3.7 衛矛醇對OS-RC-2細胞增殖及GPX4蛋白表達的影響為明確蛇莓醇提物中的衛矛醇對OS-RC-2細胞增殖能力及對鐵死亡關鍵蛋白GPX4蛋白表達的影響,課題組用CCK-8檢測不同濃度的衛矛醇(0～80 μmol·L-1)給藥48、72 h后對OS-RC-2細胞活力的影響,并用Western blot檢測衛矛醇給藥48 h后GPX4蛋白表達水平的變化。

結果顯示,與DMSO對照組相比,蛇莓醇提物中的衛矛醇可抑制OS-RC-2的細胞活力,見Fig7A、7B;并顯著降低GPX4的蛋白表達,見Fig7C、7D。

Fig7 Effect of Dulcitol on cell proliferation and protein

4 討論

蛇莓為薔薇科蛇莓屬植物的葉,其化學成分較為明確,主要包括蛇莓苷A、蛇莓苷B、烏蘇酸、齊墩果酸、β-谷甾醇、薔薇酸、對羥基桂皮酸和芹菜素等[9]。現代藥理學研究表明,蛇莓具有抗炎、抗病毒、抗腫瘤的作用[10-11]。如蛇莓提取物可通過MEK/ERK途徑抑制MMP-2活性,從而降低口腔癌細胞的轉移潛能[12];此外,蛇莓提取物還具有抑制膀胱癌、宮頸癌[13-14]等腫瘤細胞的增殖作用,但在腎透明細胞癌中的作用及其機制尚不清楚。

本研究發現蛇莓呈濃度及時間依賴性抑制腎透明細胞癌OS-RC-2細胞的增殖,并顯著增加細胞ROS水平。隨后,在與細胞活力呈濃度依賴的范圍內(0～20 mg·L-1)進行了細胞凋亡檢測,結果顯示當蛇莓濃度超過5 mg·L-1后,即使藥物濃度增加至20 mg·L-1,OS-RC-2細胞的凋亡率并未隨之增加,提示蛇莓引起的細胞活力降低并非由凋亡驅動。

接下來進行了GSH、MDA的含量檢測,結果顯示蛇莓給藥降低OS-RC-2細胞GSH含量并增加MDA的含量。GSH含量降低、MDA含量增加均是鐵死亡的標志性事件之一[15],且ROS的積累,導致氧化失衡是鐵死亡的必經過程[16]。課題組利用鐵死亡的抑制劑Fer-1和活性氧的抑制劑NAC進行了回復實驗,探索蛇莓抑制OS-RC-2細胞增殖是否由鐵死亡驅動,結果表明Fer-1和NAC均在一定程度上逆轉了蛇莓引起的細胞活力降低,提示蛇莓醇提物通過誘導鐵死亡發揮抑制OS-RC-2細胞增殖作用。對蛇莓給藥后OS-RC-2細胞的鐵死亡關鍵蛋白表達進行檢測,顯示蛇莓給藥后降低了細胞GPX4、SLC7A11蛋白表達水平。

GPX4是鐵死亡的關鍵調節因子[17],研究顯示,GPX4活性對于維持細胞中的脂質穩態、防止有毒脂質ROS的積累,從而阻斷鐵死亡的氧化引起的非凋亡性細胞死亡模式至關重要[18]。為研究蛇莓中潛在的藥效物質,我們利用網絡藥理學和分子對接的方式對蛇莓的成分和靶點進行分析,并與鐵死亡關鍵調控因子GPX4進行了分子對接,結果顯示蛇莓主要成分衛矛醇與GPX4蛋白受體-配體復合物結合穩定,結合能為-6.5 kJ·mol-1。現代藥理學研究表明,衛矛醇可以通過SIRT1/p53途徑抑制肝細胞癌的增殖和遷移[19];可通過調節自噬途徑對大鼠C6膠質瘤發揮抑制作用[20],表明衛矛醇可能是一種有潛力化療劑。為進一步驗證衛矛醇的抑癌作用及作用機制,課題組進行了CCK-8及Western blot實驗,結果表明衛矛醇可抑制OS-RC-2細胞增殖并降低GPX4的蛋白水平。綜上,提示衛矛醇可能直接作用于GPX4驅動腎癌細胞發生鐵死亡。

蛇莓醇提物中成分眾多,針對類似混合物的研究僅僅使用網絡藥理學分析的策略可能存在一定的局限性,結合液相-質譜技術對混合物的成分進行檢測,隨后再進行網絡藥理學分析可能對其藥效成分的探索更具有科學性,本次研究僅僅在細胞層面上證實了蛇莓中的衛矛醇可能是一種鐵死亡的驅動劑,但仍需要進一步在動物或者更多的細胞系上驗證。

本次研究結果表明,蛇莓中的活性成分衛矛醇可能作為一種潛在的腎癌鐵死亡誘導劑,通過降低GPX4的表達,驅動腎癌細胞發生ROS積累、脂質過氧化,進一步驅動腎癌細胞發生鐵死亡,此研究有望為開發具有潛在抗RCC作用的新藥提供理論基礎。