干擾素基因刺激因子激動劑的研究進展

王 婭,吳 碩,李玉環

(中國醫學科學院北京協和醫學院醫藥生物技術研究所,中國醫學科學院抗病毒藥物研究重點實驗室,抗感染藥物研究北京市重點實驗室,北京 100050)

cGAS-STING通路是中樞細胞胞質DNA傳感器,不僅能夠識別病原體入侵所引入的外源DNA,還能夠識別腫瘤細胞、死亡細胞以及破損線粒體所產生的內源DNA,感知機體內的感染、炎癥、癌癥等病理狀態,活化機體免疫防御反應,是一種進化上高度保守的免疫防御機制,在原核生物和真核生物中都存在其同源物,以干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING,又稱為TMEM173/MPYS/MITA/ERIS)為靶點的藥物開發已成為近年創新藥領域的研發熱點。

1 STING蛋白的結構

干擾素基因刺激因子(stimulator of interferon genes,STING,又稱為TMEM173/MPYS/MITA/ERIS)作為一種先天性免疫調節信號分子于2008年首次報道,主要位于細胞內質網(endoplasmic reticulum,ER),由TMEM173基因編碼,人源STING(hSTING)由379個氨基酸組成,鼠源STING(mSTING)由378個氨基酸組成,兩者相似度約 81%。hSTING的N末端結構域(N terminal domain,NTD)主要分為4個跨膜結構域(TM 1～4),與其細胞內位置密切相關。C末端結構域(C terminal domain,CTD)包括配體結合結構域(ligand-binding domian,LBD)和C尾端結構域(C-terminal tail,CTT)兩部分,LBD負責與2′ 3′-cGAMP等配體相結合誘導STING蛋白構象轉變,CTT負責與TANK結合激酶1(TANK binding kinase 1,TBK1)和干擾素調節因子3(interferon regulatory factor 3,IRF3)相結合,促進信號的級聯傳導。

2 cGAS-STING通路激活及其應用

環狀GMP-AMP合成酶(cyclic GMP-AMP synthase,cGAS)包含一個核苷酸轉移酶結構域和兩個DNA結合結構域,當胞質中無雙鏈DNA(double-stranded DNA,dsDNA)時,cGAS會以自我抑制的狀態存在,當存在dsDNA時,cGAS會與dsDNA以序列非特異性的方式相結合,催化ATP和GTP環化,形成2′3′-cGAMP。2′ 3′-cGAMP是內源性環二核苷酸(cyclic dinucleotide,CDN)類化合物,除此之外,在細菌感染的過程中也會產生其他種類的CDNs,如2′2′-cGAMP、3′3′-cGAMP、c-diAMP、c-diGMP等。作為CDNs的下游受體蛋白,靜息狀態下STING以同源二聚體形式存在,與CDNs結合后形成四聚體或多聚體復合物,多聚化STING脫離內質網,轉位到高爾基體,募集TBK1和IRF3。TBK1二聚體自身磷酸化激活其激酶活性,然后將STING CTD磷酸化并將IRF3磷酸化激活,活化的IRF3二聚化并轉位到細胞核,促進Ⅰ型干擾素(interferon,IFN)基因的轉錄表達。除此之外,STING激活后還會激活激酶IKK,催化IκB蛋白的磷酸化,磷酸化的IκB蛋白通過泛素-蛋白酶體途徑降解,從而將NF-κB釋放出來,進入細胞核,與IRF3和其他轉錄因子一起發揮作用,誘導炎癥細胞因子(如TNF、IL-6)的表達。激活后的STING最終會被溶酶體所降解。

cGAS-STING通路是病原體識別和機體免疫防御的橋梁,在機體病原體感染中誘導產生免疫應答發揮保護作用。作為胞質DNA傳感器,cGAS-STING通路對巨細胞病毒、皰疹病毒、腺病毒、痘病毒和乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)等DNA病毒均具有保護作用。后續的研究發現,STING通路激活也可以使機體產生對人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)、熱病病毒(yellow fever virus,YFV)、登革病毒(Dengue virus,DENV)和寨卡病毒(Zika virus,ZIKV)等RNA病毒的抵御作用。抗HIV等逆轉錄病毒的作用源于對逆轉錄生成的DNA中間體的識別,抗其他RNA病毒的具體分子機制尚不清楚,可能是由于病毒的感染導致細胞核或線粒體中原本封閉DNA的“泄漏”。STING還可以直接作為DNA感受器,識別細菌攜帶的CDNs,引發免疫應答。此外,cGAS和STING缺陷的小鼠對惡性瘧原蟲、弓形蟲更易感,小鼠模型顯示更高的寄生蟲負荷和寄生蟲血癥。

cGAS-STING通路的缺陷或下調與多種腫瘤的發生發展相關。在6種惡性黑色素瘤細胞系(G361、MeWo、SK-MEL-5、SK-MEL-2、SK-MEL-28、WM115)、KRAS突變的肺癌細胞系和一些人結直腸癌細胞系中均發現了STING沉默或表達明顯受到抑制。cGAS-STING通路的激活不僅可以阻礙早期腫瘤細胞的進展,促進癌細胞的衰老,幫助腫瘤細胞自主控制腫瘤,還可以上調Ⅰ型IFN的產生,增加免疫細胞如T細胞、自然殺傷細胞(nature killer cell,NK cell)浸潤,誘導炎癥細胞因子、趨化因子等免疫刺激因子的產生,激起宿主免疫應答對抗腫瘤。

3 STING激動劑

cGAS-STING通路在抗感染免疫和抗腫瘤免疫中發揮著重要的作用,研究者們大力開發相關藥物,靶向該通路以達到治療疾病的目的。本文將重點介紹STING激動劑的研究進展。

3.1 CDN類STING激動劑

3.1.1臨床試驗藥物 內源性2′3′-cGAMP可以通過激活cGAS-STING通路,引發機體強有力的固有免疫應答。研究表明,瘤內注射cGAMP,可以有效增強抗腫瘤CD8+T細胞反應,從而控制注射瘤和對側瘤的發生發展進程;阻斷PD1和CTLA4后,cGAMP觸發抗腫瘤免疫的能力進一步增強。天然CDNs分子可有效激活STING,但這些分子對磷酸二酯酶十分敏感,易被降解。

ADU-S100(ML-RR-S2-CDA/MIW815)是一種通過生物電子等排體設計合成的環二腺苷單磷酸類似物,具有硫代磷酸二酯鍵,既能抵抗磷酸二酯酶的水解,又能誘導THP-1細胞表達更高水平Ⅰ型IFN。B16F10小鼠模型中瘤內注射ADU-S100可以使小鼠腫瘤顯著消退,并產生長期的免疫記憶[1]。作為首個進入臨床的STING激動劑,最初應用于頭頸部鱗狀細胞癌和晚期或轉移性實體瘤或淋巴瘤的治療,但在臨床Ⅰ期試驗階段,ADU-S100與PD-1抗體聯用療效不佳,目前該試驗已被終止;后來ADU-S100陸續被應用于鎮痛等其他方面的研究。

Fig1 Structure and function of human STING protein

Fig2 cGAS-STING pathway

默沙東在研藥MK-1454在MC38小鼠模型瘤內注射給藥可產生強大的抗腫瘤細胞因子和有效的抗腫瘤活性。在MC38和B16F10小鼠模型中,MK-1454與完全鼠化的抗鼠PD-1抗體mDX400聯合用藥顯示出協同療效,促使腫瘤進一步縮小[2]。MK-1454用于晚期實體瘤和淋巴瘤的臨床試驗中,單一療法未見明顯療效,而與派姆單抗(Pembrolizumab)聯合用藥組中24%的患者表現出持續6個月以上的反應,但兩個治療組中部分患者都出現了注射部位疼痛、發熱等不良反應。

SB11285不僅能夠全身遞送,而且還可以在不引起機體系統性炎癥反應的同時,促進激活的免疫細胞從外周轉移至腫瘤病灶,CT26小鼠模型顯示出持久完全的抗腫瘤活性[3]。臨床上晚期實體瘤患者靜脈注射,I期臨床試驗結果顯示不管是單藥使用還是和阿替利珠單抗(Atezolizumab)聯合使用都顯示出來很好的耐藥性。

BMS-986301在CT26和MC38小鼠模型中瘤內注射給藥,注射和未注射腫瘤的完全消退率高于90%。CT26小鼠模型中,單用抗PD-1治療無效組,聯合單劑量BMS-986301治療,注射和未注射腫瘤完全消退率高達80%[4]。

BI-1387446是BI-STING類激動劑的一種,該類激動劑通過模擬天然STING配體,瘤內給藥可以產生劑量依賴性的抗腫瘤活性。

已經進入臨床試驗的CDN類STING激動劑相關情況見Tab1。

Tab1 Clinical trials of STING CDN agonists

3.1.2臨床前研究化合物 有研究者通過更換CDNs的核苷組成,發現了環腺苷-磷酸肌苷(cyclic adenosine-inosine monophosphate,cAIMP)類似物,不僅更能抵抗酶切,而且在人類和小鼠免疫細胞系中均具有更強的cGAS-STING通路激活能力,3′3′-cAIMP在小鼠肝癌模型中,瘤內注射給藥可以有效促進CD8+T細胞的增殖,促進腫瘤細胞凋亡,減輕小鼠腫瘤負荷,但對多病灶模型無法解決所有的病變[5]。

在ADU-S100研究的基礎之上,對CDN的堿基和核酸進一步修飾獲得了IACS-8779和IACS-8803兩種2′3′-硫代磷酸CDN類似物,體外實驗顯示出了更為強勁的STING通路激活作用,在B16黑色素瘤小鼠模型中具有更好的系統性抗腫瘤活性[6]。

另一種激動劑JNJ-67544412(JNJ-4412)與STING具有更高的親和能力,可以與人類STING的所有主要等位基因相結合。瘤內注射可以引發促炎細胞因子和CD8+T細胞水平升高,給藥后腫瘤顯著消退。雖有體重減輕的不良反應,但通過減少給藥次數可有效改善。

GSK532激動劑不僅能夠在不同STING單倍型的外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中誘導細胞因子反應,還能夠激活不同臨床前物種(小型豬、狗、小鼠和大鼠等)的STING直系同源物。GSK532在人體全血中表現出高度的穩定性,降解速率明顯減慢,CT26小鼠模型中瘤內注射給藥可以誘導強烈的抗腫瘤作用,治愈小鼠的腫瘤再接種表現出明顯的抗性,表明其參與誘導適應性免疫反應的發展。

3.2 Non-CDN類STING激動劑CDN類STING激動劑受其理化性質的限制,如分子量大、膜通透性差、易被磷酸二酯酶降解、半衰期短等,改造空間和臨床應用受限,越來越多的科研工作者致力于開發新型的Non-CDN類小分子STING激動劑。

3.2.1臨床試驗藥物 DMXAA(也稱作Vadimezan / ASA404 / NSC640488)是黃酮類血管破壞劑,在小鼠體內通過激活STING蛋白,進而誘導IFN-β等細胞因子的產生,可有效抑制多種實體瘤的生長。但是該藥在一項針對非小細胞肺癌的Ⅲ期臨床試驗中,與標準化療聯合使用,未能觀察到明顯的療效。后經結構研究分析表明,DMXAA作為mSTING的直接配體,能夠有效激活mSTING,但卻無法激活hSTING。DMXAA 還被發現在HBV小鼠模型中,可以顯著誘導干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表達,發揮抗HBV作用。目前DMXAA已被廣泛用作臨床前STING激動劑研究的工具化合物。

Fig3 Chemical structure of STING CDN agonists

CMA是吖啶酮類化合物,能有效誘導Ⅰ型IFN的產生,對乙腦病毒具有明顯的治療和預防作用,同樣也是因只能激活mSTING導致臨床試驗失敗。

研究者在核酸堿基之間引入跨環大環橋來鎖定環二核苷酸的生物活性U形構象,從而產生一種拓撲結構新穎的大環橋STING激動劑(MBSA),其對STING的激動效力顯著增強。E7766就是其中一種,在小鼠肝轉移瘤模型中顯示出具有強大的抗腫瘤活性和持久的免疫記憶,且對所有主要人類STING變體具有激活能力[7]。

SNX281也對所有人類主要STING變體均具有激活能力,該化合物穩定性高,可系統給藥。CT26小鼠模型中單次靜脈注射可使腫瘤完全消退,且與抗PD-1抗體具有協同抗腫瘤的療效[4]。

已經進入臨床試驗的Non-CDN類STING激動劑相關情況見Tab2。

Tab2 Clinical trials of STING non-CDN agonists

Tab3 Clinical trials of STING new dosage form agonists

3.2.2臨床前研究化合物 化合物二酮哌嗪(dispiro diketopiperzine,DSDP)和苯甲酰胺類化合物(6-bromo-N-(naphthalen-1-yl)benzo[d][1,3] dioxole-5-carboxamide,BNBC)是基于人肝癌細胞HepAD38/cGAS-STING/ISG54 Luc報告細胞系進行高通量篩選發現的。二者以hSTING依賴的方式誘導IFN主導的細胞因子反應,保護細胞免受YFV、DENV和ZIKV等黃病毒的感染。BNBC還可以誘導樹突狀細胞的細胞因子反應和細胞成熟,可能進一步對CD4+、CD8+等適應性免疫應答進行調節[8-9]。

G10、C11和M04 3種hSTING激動劑是基于人成纖維細胞hSTING-IFN/IRF3報告細胞系進行高通量篩選時發現的,這3種化合物可以激活hSTING介導的IFN/IRF3信號通路,而不激活NF-κB信號通路。其中M04可以促進人樹突狀細胞成熟標志物的表達和CD8+T細胞的增殖活化。G10、C11對委內瑞拉馬腦炎病毒、痘苗病毒、西尼羅河病毒等不同的甲病毒分支具有不同程度的保護作用[10-12]。

diABZI是小分子氨基苯并咪唑(amidobenzimidazole,ABZI)家族的一員,可以與cGAMP競爭結合STING,劑量依賴性誘導STING的激活和IFN-β的分泌,在結直腸癌小鼠模型中可顯著抑制腫瘤的生長[13]。此外,diABZI激活STING還具有顯著的抗病毒活性,如副流感病毒3型和人類鼻病毒16型[14]。近期發現diABZI可以高效限制SARS-CoV-2在細胞和動物中的復制,在小鼠新冠病毒感染模型中,在病毒感染之前或之后通過鼻內給藥diABZI-4可完全保護其免受SARS-CoV-2感染引起的嚴重呼吸系統疾病的侵襲[15]。

苯并噻吩類化合物MSA-2是基于THP1-hSTING-IFNβ報告細胞系在化合物庫中篩選得到的,瘤內注射、皮下注射和口服給藥都能有效激活STING,誘導IFN-β、IL-6等細胞因子水平升高,MSA-2的弱酸性使其能夠選擇性激活腫瘤細胞中的STING,MC38小鼠模型中80%～100%的小鼠給藥后腫瘤消退,再次注射95%的小鼠都沒有出現腫瘤復發的現象,MC38、CT26、B16F10、LL-2多種腫瘤模型中單藥治療有效,與抗鼠PD-1抗體muDX400聯合用藥顯示出協同療效[16]。

SR-717是咪唑噠嗪類化合物,兩分子SR-717可以模擬cGAMP結合并激活mSTING和hSTING,劑量依賴性的升高IFN-β、IL-6等細胞因子的水平,促進CD8+T、NK等免疫細胞的增殖活化,瘤內注射顯示出強勁的抗腫瘤活性,腹腔注射給藥也可以降低腫瘤負荷,在侵襲性黑色素瘤、結直腸癌、肺結節等小鼠模型中均有效,其抗腫瘤效果優于PD-1或PD-L1抗體[17]。

從山竹中提取得到的天然黃酮類化合物的α-Mangostin能夠與hSTING結合,提高其穩定性,激活下游STING-TBK1-IRF3信號通路,產生抗病毒和抗腫瘤活性,同時還能夠誘導巨噬細胞促腫瘤M2表型轉變為抗腫瘤M1表型[18]。

除此之外,一些新型小分子STING激動劑陸續被開發出來。基于結構虛擬篩選和熒光偏振實驗從化合物庫中篩選并經結構改造獲得的三唑喹喔啉類化合物1a可以有效激活STING及其下游TBK1-IRF3信號軸,劑量依賴性地促進人THP-1細胞和小鼠BMDM細胞中IFN-β、CXCL10、IL-6的表達[19]。非核苷酸非環狀Selvita和Ryvu′s STING激動劑可以在PBMC和樹突狀細胞等細胞中有效誘導細胞因子反應,Ryvu′s激動劑在CT26小鼠模型中可使腫瘤完全消退,且形成免疫記憶。TTI-10001可以激活hSTING和mSTING,瘤內注射給藥可以誘導免疫細胞因子的表達,產生良好的抗腫瘤活性。ALG-031048與ADU-S100相比,穩定性更高,瘤內注射給藥腫瘤消退率更高,皮下注射給藥也顯示出很好的抗腫瘤效果,與抗PD-1抗體協同作用,增強對腫瘤生長的抑制。CRD-5500可以通過多種途徑給藥,臨床前數據顯示,瘤內注射和靜脈注射給藥都可以使CT26小鼠模型腫瘤消退,與免疫檢查點抑制劑協同作用,抗腫瘤效果更佳[4]。

3.3 STING激動劑新劑型的開發和應用高劑量的小分子激動劑會激活“脫靶”細胞類型中的STING,如效應T細胞,導致細胞凋亡的發生,最終阻礙免疫記憶的形成。為此,人們陸續通過開發STING激動劑的新劑型以實現cGSA-STING通路的靶向激活。

NBTXR-3新型納米藥物,是一種放射增敏劑,一次性腫瘤內注射給藥,放射療法激活。與單純放療相比,NBTXR3激活后可劑量依賴性地增加cGAS-STING通路的激活,增加了腫瘤細胞的殺傷效率和免疫原性細胞的死亡。臨床前研究顯示,通過NBTXR3、放療和免疫檢查點抑制劑的三重組合,可以“重新編程”局部和遠處腫瘤的微環境,延緩靶向和遠處腫瘤的生長,提高生存率。

SYN-STING(SYNB 1891)是一種可以調控表達DacA蛋白的大腸桿菌工程菌株,DacA蛋白可以催化生成環狀AMP二聚體,模擬cGAMP激活STING。瘤內注射給藥后,在腫瘤組織中表現出定位、持久性、代謝活性和中等水平抗腫瘤活性。在B16F10黑色素瘤、EL4淋巴瘤、CT26結腸癌小鼠模型中可形成有效抗腫瘤免疫和良好的免疫記憶,并激活抗原提呈細胞[20]。

exoSTING(CDK-002)是一種工程化的外泌體,可以選擇性地將裝載的STING激動劑輸送至腫瘤部位抗原提呈細胞,產生更為有效的腫瘤抗原特異性的免疫應答,和抗PD-1抗體聯合治療可進一步增強抗腫瘤免疫反應。

4 STING激動劑研發的挑戰與展望

STING無疑是一個有前途的免疫治療靶點,但在STING激動劑的研究和開發過程中也不乏問題和挑戰。

Fig4 Chemical structure of STING Non-CDN agonists

首先,STING蛋白本身是一把雙刃劍。激活STING可以激發機體的固有和適應性免疫應答,產生良好的抗感染和抗腫瘤活性。但STING的激活也會對機體產生一些負面作用。(1)腫瘤細胞中染色體的不穩定性和基因組DNA的泄漏可能會導致腫瘤細胞以STING依賴的方式增強其侵襲、轉移能力和耐藥性[21];(2)STING對內源性DNA的異常識別和基因突變所致組成性激活與各種自身免疫性疾病的發生密切相關[22];(3)cGAS-STING通路的激活可以加重衰老和老齡化疾病[23],該通路的下調或沉默可以有效改善心血管、脂肪組織炎癥反應,降低心血管疾病、肝臟疾病等慢性疾病的嚴重程度[24]。越來越多的研究表明,STING是一些自身炎癥和自身免疫性疾病發病機制中的核心驅動因素。鑒于此,以STING為靶點抑制劑的研發正在進行中,現有的抑制劑主要包括以Astin C為代表的競爭性拮抗劑和以硝基脂肪酸(NO2-FAs)、硝基呋喃類化合物為代表的共價抑制劑兩種類型。

其次,越來越多的研究發現病原微生物逐漸衍生出了各種針對STING的免疫逃逸策略。如DENV NS2B/3蛋白酶復合體結合并切割STING蛋白;丙型肝炎病毒NS4B蛋白結合并滅活STING;冠狀病毒HCoV-NL63通過木瓜蛋白酶、HBV通過聚合酶可以破壞K63介導的STING的多聚泛素化,而STING的多聚泛素化正是激活IFN信號所必需的[25]。

最后,在STING激動劑的研發過程中還有一些必須要納入考慮的問題。(1)STING的廣泛表達;(2)STING的單核苷酸多態性,目前已發現的STING突變體主要有四種:R232H、R293Q、AQ和HAQ,不同突變體對同一STING激動劑的敏感性是有差別的;(3)經典CDNs激活STING需要一個封閉的“蓋子”構象,而一些激動劑如diABZI卻能在保持構象開放的同時激活STING。因此,STING構象的改變和對下游信號通路激活的傾向性仍需要進一步研究確定。