眼鏡蛇神經毒素分離純化及其經大鼠直腸給藥吸收的實驗研究

張 昊,廖 明,張學榮,周 怡,孔露平,胡少聰,肖曼琪,張子彥,羅小玲,3

(廣西醫科大學1.基礎醫學院、2.生命科學研究院, 3.廣西醫科大學附屬腫瘤醫院實驗研究部,廣西 南寧 530021)

神經毒素是眼鏡蛇屬蛇毒的主要致死成分,是一種分子量約為7 ku的堿性小分子多肽。神經毒素的肽鏈結構包含15～18種氨基酸類別和60～74個氨基酸數量[1]。眼鏡蛇神經毒素是一種從眼鏡蛇蛇毒中分離出來的短鏈肽,具有中樞鎮痛作用,該神經毒素在鎮痛方面有著高效性、無耐受性、無成癮性、不良反應少等特點[2]。

經口給藥是最常見的給藥方式,對口服藥物,需要考慮在胃腸道惡劣的消化環境中,保證藥物的穩定性和利用率[3]。將藥物遞送到作用靶點以及提高藥物的利用率,一直是口服藥物待解決的重要難題。選擇直腸給藥的方式可以避免胃腸道的破壞和肝臟的首過效應,藥物通過直腸黏膜快速吸收達到一定血藥濃度,從而發揮藥理作用。避免了口服給藥、靜脈注射等方式帶來的不良反應[4]。對部分肝臟毒性較強、刺激性較強的藥物是一種安全可替代給藥途徑。同時,由于直腸內具有沒有消化液并且藥物可以長期存留的特點,特殊制作的栓劑或者凝膠系統可以顯著提高部分藥物的溶解度和生物利用度[5]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物健康KM小鼠,雌雄各半,清潔級,18～22 g;健康SD大鼠,雌雄各半,清潔級,180～220 g。均購自廣西醫科大學實驗動物中心,生產許可證號為SCXK(桂)2020-0003,使用許可證號為SCXK(桂)2020-0004,倫理審查編號為202112062。動物實驗遵循動物倫理原則。

1.2 材料眼鏡蛇蛇毒凍干粉(廣西醫科大學蛇毒研究所,粗毒LD100為 0.7 mg·kg-1,干毒含水量<5%,非水溶物含量<0.8%);CM Sephadex Fast Flow色譜柱(美國Pharmacia Biotech公司,17-0719-01);Sephadex G-50色譜柱(美國Pharmacia Biotech公司,17-0043-01);磷酸二氫鈉(天津市大茂化學試劑廠,3494);磷酸氫二鈉(天津市大茂化學試劑廠,3497);氯化鈉(成都市科龍化工試劑廠,7647-14-5);Tris-Tricine-SDS-PAGE凝膠制備試劑盒(北京索萊寶科技有限公司,P1320);考馬斯亮藍R-250(北京索萊寶科技有限公司,6104-59-2);馬抗眼鏡蛇毒血清(賽倫生物公司);HRP標記山羊抗馬IgG(武漢三鷹生物公司,5A00001-13)

1.3 主要儀器KTATMstart層析系統(美國GE公司);LGJ-18冷凍干燥機(北京松源華興科技發展公司);GS-800凝膠掃描儀器(美國BIO-RAD公司);Mini-PROTEAN Tetra電泳儀(美國 BIO-RAD公司);JB-P5包埋機(武漢俊杰電子有限公司);RM2016病理切片機(上海徠卡儀器有限公司)

1.4 方法

1.4.1眼鏡蛇神經毒素分離純化及純度鑒定 (1)稱取2.0 g眼鏡蛇蛇毒凍干粉,取10 mL濃度為0.05 mol·L-1(pH 6.8)的PB緩沖液溶解,4 ℃過夜;第二天,用低溫離心機10 000 r·min-1離心10 min后,取上清液經0.45 μm濾器過濾至新離心管。(2)收集到的上清液采用KTATMstart層析系統,首先進行CM Sepharose Fast Flow陽離子交換層析。用0.05 mol·L-1的PB緩沖液平衡后,再用0～0.5 mol·L-1的含NaCl的PB緩沖液進行階段性梯度洗脫,流速1 mL·min-1,平衡液不收集,收集洗脫液,10 mL每一管。收集最高致死峰進行透析脫鹽、凍干濃縮處理,用于下一步分離純化。(3)選擇最高致死峰進行Sephadex G-50 凝膠過濾色譜。凍干粉取5 mL濃度為0.05 mol·L-1(pH 6.8)的PB緩沖液溶解,預處理過程同上。采用KTATMstart色譜系統,全程使用0.05 mol·L-1的PB緩沖液進行平衡,流速2 mL·min-1,收集平衡液,10 mL每一管。收集最高致死峰進行透析脫鹽、凍干濃縮處理,用于下一步SDS-PAGE電泳純鑒定及后續實驗。(4)取Sephadex G-50 凝膠過濾色譜后的最高致死峰進行Tris-SDS-PAGE凝膠電泳。取15 μL濃度為5 g·L-1的樣品與15 μL的Tris-Tricine-SDS-PAGE上樣緩沖液(2×)混合。采用15.5%分離膠、10%夾層膠、4%濃縮膠進行電泳。取20 μL混合物上樣到樣品槽內,標準蛋白使用預染超低分子量蛋白質Marker。濃縮膠電壓30 V,夾層膠與分離膠電壓100 V。(5)電泳完成后,使用考馬斯亮藍R-250進行染色,脫色后,使用凝膠掃描儀器進行成像。

1.4.2眼鏡蛇神經毒素蛋白含量測定 使用BCA法測定蛋白峰濃度。根據樣品數量配置足量BCA 工作液后,配置0.5 g·L-1的標準蛋白。將標準品按要求稀釋成不同濃度,分別為0、0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g·L-1。將樣品和標準品加入到96孔板中,各孔再加入 200 μL配置好的 BCA 工作液,37 ℃ 放置20～30 min,用酶標儀測定562 nm的吸光度。根據標準曲線計算出樣品的蛋白濃度。

1.4.3眼鏡蛇神經毒素小鼠腹腔注射全數致死量(LD100)測定[6]預實驗通過少量小鼠確定最小全死量(Dm) 和最大全不死量(Dn)。確定神經毒素的全數致死量(LD100)在 100 μg·kg-1～500μg·kg-1此范圍內,再按等差值設置各劑量組進行正式實驗。將60只KM小鼠隨機分為6組,每組10只,分別給小鼠腹腔注射眼鏡蛇神經毒素100、200、300、400、500 μg·kg-1及生理鹽水,注射體積為0.2 mL,注射完成后觀察小鼠生命體征和死亡情況,確定小鼠腹腔注射LD100。觀察24 h內小鼠所產生的行為反應及死亡情況,并將死亡的小鼠進行解剖觀察內部臟器變化。

1.4.4眼鏡蛇神經毒素大鼠直腸灌注給藥急性毒性測定[7]由于并未有文獻報道神經毒素直腸給藥的安全劑量,參照部分參考文獻的口服安全劑量進行相應實驗。此劑量約為腹腔注射劑量的 100 倍。確定后續實驗大鼠直腸給藥的安全劑量。將60只SD大鼠隨機分為6組,每組10只,分別給直腸灌注10、20、30、40 和50 mg·kg-1眼鏡蛇神經毒素及生理鹽水,灌注體積為2 mL。直腸灌注后觀察大鼠的生命體征和死亡情況,檢測大鼠直腸灌注眼鏡蛇神經毒素急性毒性。

1.4.5眼鏡蛇神經毒素大鼠直腸灌注實驗分組和給藥 探究眼鏡蛇神經毒素能否通過直腸給藥途徑進入大鼠血液,使用SD大鼠進行直腸給藥實驗。將大鼠分為對照組和3 h實驗組兩組,每組2只大鼠。3 h實驗組在0 h時給藥眼鏡蛇神經毒素,對照組在0 h給藥相同體積的生理鹽水。給藥方式為直腸灌注給藥。直腸灌注前禁食不禁水24 h,且在正式實驗前用少量生理鹽水潤洗腸道,將大鼠腸道內的糞便排清。將大鼠頭部固定,尾部抬高約與桌面形成60度角的高度,保持尾高頭低的姿勢,用灌胃針深入大鼠直腸約5 cm進行直腸灌注。灌注完成以后用小型橡膠塞堵住直腸口,并且保持頭低尾高約15 min。根據上述直腸灌注給藥急性毒性測定的最大安全劑量給藥。以50 mg·kg-1大鼠體質量的劑量直腸給藥上述提取的眼鏡蛇神經毒素,給藥體積為2 mL。

1.4.6大鼠直腸組織取材及石蠟組織切片的制作 給藥完成3 h后將兩組大鼠進行麻醉。分別解剖取材對照組和3 h實驗組大鼠直腸,用生理鹽水沖洗3～4次實驗組腸道內外,去除腸道內容物及可能殘留的眼鏡蛇神經毒素。用眼科剪取3 cm長的直腸組織,用濾紙吸干組織表面液體,放入多聚甲醛中浸泡。直腸組織在多聚甲醛中浸泡48 h后,進行組織包埋。先將直腸組織采用梯度乙醇浸泡脫水,乙醇濃度依次為:50%、70%、80%、95% Ⅰ、95% Ⅱ、無水乙醇Ⅰ、無水乙醇Ⅱ。每種濃度浸泡時間:30 min,其中在95%乙醇中浸泡12 h以上。然后直腸組織依次浸泡于二甲苯Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中透明,每種溶劑中浸泡10 min。直腸組織浸蠟后,用石蠟包埋成組織蠟塊。用切片機將組織蠟塊切成厚度為5 μm的組織橫向切片。

1.4.7利用免疫組化技術觀察神經毒素在大鼠直腸組織中的分布 組織切片采用免疫組織化學技術,通過化學標記法對腸道組織中的眼鏡蛇神經毒素分布進行橫向定位。對照組和3 h實驗組采用同等實驗條件,一抗選擇馬抗眼鏡蛇毒血清、二抗選擇HRP標記羊抗馬IgG進行顯色。實驗完成后每組各選擇一張切片進行鏡下觀察,觀察各組直腸切片中眼鏡蛇神經毒素在直腸黏膜中的分布。對于每個直腸樣本,選擇10個代表性視野,并計算每個視野相關評分。整個直腸樣本的評分是這10個單個視野評分的算術平均值。將鏡下200×視野使用Aipathwell軟件進行自動分析,將陽性部分用黃色像素點表示。根據AI計算出各項評分,從陽性面積比率、平均光密度值、H-SCORE值三項指標進行評價,使用統計軟件分析比對對照組與3 h實驗組免疫組織化學鏡下結果的差異性。

1.4.8Shotgun質譜技術檢測大鼠血漿中神經毒素 將神經毒素直腸給藥3 h后的實驗組大鼠進行腹主動脈取血,離心分離血漿。SDT法裂解蛋白質后,BCA法對蛋白質進行定量。使用胰蛋白酶將蛋白質酶解成為肽段,采用C18Cartridge對肽段進行脫鹽,脫鹽后將樣本凍干,再使用40 μL 0.1%甲酸溶液復溶。復溶后,樣品進行LC-MS/MS分析,采用HPLC液相系統進行分離。緩沖液A液為0.1%甲酸水溶液,B液為0.1%甲酸乙腈水溶液(乙腈為84%)。先用95%的A液平衡色譜柱,再經過分析柱分離樣品。經過分離柱后的樣品,通過高分辨率質譜儀進行質譜分析,檢測方式為正離子。質譜分析原始數據為RAW文件,采用軟件(Maxquant)進行查庫鑒定及定量分析。搜索蛋白質數據庫相關參數設置見Tab1。

Tab1 (Maxquant) Parameter settings for checking library identification

1.4.9HE染色觀察神經毒素對大鼠直腸的組織結構影響 同上述條件,完成直腸取材后,制作直腸石蠟組織切片。切片使用HE染液進行染色。在顯微鏡下瀏覽組織切片情況,對切片中基本病理改變如充血、淤血、出血、水腫、變性、壞死、增生、纖維化、機化、肉芽組織、炎性變化等情況進行觀察,觀察神經毒素對大鼠直腸的組織結構變化。

1.4.10醋酸扭體法測定眼鏡蛇神經毒素經直腸給藥鎮痛活性 將50只小鼠隨機分為5組,每組10只,分別為NS對照組(生理鹽水)、直腸低劑量組(10 mg·kg-1神經毒素)、直腸中劑量組(30 mg·kg-1神經毒素)、直腸高劑量組(50 mg·kg-1神經毒素)、腹腔注射組(0.1 mg·kg-1神經毒素)。給藥體積為0.2 mL。環境溫度為25 ℃。給藥后3 h測量疼痛閾值。醋酸扭體法測定鎮痛活性,小鼠腹腔注射0.01 mL·g-10.6%的醋酸溶液,記錄醋酸注射后15 min內的扭體次數,并計算各組對扭體反應的抑制率。抑制率=(陰性對照組扭體次數-實驗組扭體次數)/陰性對照組扭體次數×100%。

2 結果

2.1 眼鏡蛇毒分離純化色譜結果及蛋白濃度測定結果如Fig1,眼鏡蛇粗毒經CM Sepharose Fast Flow陽離子交換色譜后得到6個洗脫峰。取Ⅲ峰進行第二步分離純化。經過Sephadex G-50 凝膠過濾色譜后獲得單一主峰Ⅲa峰,如Fig2所示。此峰收集的蛇毒蛋白致死能力最強,濃度為5 g·L-1。

Fig1 CM Sepharose Fast Flow cation exchange chromatograms

Fig2 Sephadex G-50 gel filtration chromatograms

2.2 Tris-SDS-PAGE凝膠電泳神經毒素純度鑒定取Sephadex G-50 凝膠過濾色譜后的Ⅲa峰進行Tris-SDS-PAGE凝膠電泳,顯示如Fig3所示為單一條帶,神經毒素達到電泳純,分子量在7 ku左右。

Fig3 Tris-SDS-PAGE gel electrophoresis results of neurotoxin electrophoresis(Ⅲa-1, 75 μg of protein; Ⅲa-2, Ⅲa-3, sequential doubling dilution of 1/2 concentration)

2.3 眼鏡蛇神經毒素小鼠腹腔注射LD100檢測結果腹腔注射神經毒素中毒癥狀表現為行動安靜遲緩,逐漸發展至全身肌張力降低,俯臥于籠中、腹部貼地,呼吸急促并伴隨有深度腹式呼吸,驚跳翻正反射消失等,最終表現為中毒死亡。部分動物死亡時眼球明顯外凸,經組織解剖,心、肝、脾、肺、腎、腦等臟器未出現明顯異常改變。不同劑量的死亡情況見Tab2,當腹腔注射劑量達到400 μg·kg-1時,24 h內小鼠達到全數致死。

Tab2 Deaths of cobra neurotoxin mice injected intraperitoneally

2.4 眼鏡蛇神經毒素大鼠直腸灌注給藥急性毒性測定結果給大鼠直腸灌注不同劑量的眼鏡蛇神經毒素后,大鼠呼吸頻率正常、飲食正常、無異常呼吸音、生命體征良好,未出現明顯中毒癥狀。由Tab3可知,直腸給藥大劑量的眼鏡蛇神經毒素毒性較低,均未出現大鼠死亡。50 mg·kg-1直腸給藥仍然是安全劑量。

Tab3 Death by rectal instillation in cobra neurotoxin rats

2.5 眼鏡蛇神經毒素在大鼠直腸組織中的分布對照組和3 h實驗組同步實驗,取對照組和3 h實驗組每一組中的一張石蠟切片,在顯微鏡下觀察。相比于對照組,3 h實驗組的大鼠直腸顯示眼鏡蛇神經毒素在直腸組織黏膜層大量分布,并且深入黏膜下層。此部分組織內含有大量杯狀細胞、血管、淋巴管。提示眼鏡蛇神經毒素通過直腸進入到了體內,結果如Fig4所示。

Fig4 Distribution of cobra neurotoxin in rectal tissue (yellow markers are positive markers measured by computer) ×200

2.6 眼鏡蛇神經毒素在兩組大鼠直腸鏡下視野差異性分析采用陽性面積比率、平均光密度值、H-SCORE評分指標,半定量分析標本。通過隨取獲取標本200×的放大倍數下10個視野均值作為此標本的評分指數。累計不同視野下不同等級陽性像素面積、累計光密度值、組織像素面積,從而計算出陽性面積比率、平均光密度值、H-SCORE,對照組和3 h實驗組的抗原位點分布有著明顯的統計學差異,詳見Tab4。

Tab4 Analysis of variance of results of 10 randomized visual field scores in control group and 3 h experimental

2.7 Shotgun質譜技術檢測大鼠血漿神經毒素剔除大鼠血漿原有蛋白質,質譜的Besepeak圖譜如Fig5所示,為不同時間點不同肽段產生不同的信號強度,與眼鏡蛇蛋白數據庫進行匹配,鑒定到的蛋白質和多肽匯總見Tab5,6。質譜結果顯示,3 h實驗組血液中共篩選到7種眼鏡蛇毒有關蛋白,15種眼鏡蛇毒有關多肽片段。其中包括Cobra venom factor和Zinc finger protein的片段,此片段與神經毒素片段有高度相關性。提示神經毒素能夠以直腸給藥的方式進入大鼠血液中。

Fig5 Rat plasma Basepeak plot

Tab5 Cobra proteins detected by mass spectrometry in rat plasma

Tab6 Cobra peptide fragments detected by mass spectrometry in rat plasma

Tab7 Calculation of number of acetic acid torsion and inhibition rate in different groups of )

2.8 神經毒素對大鼠直腸組織結構的影響HE染色結果顯示,相比于對照組,大鼠直腸給藥神經毒素后,直腸組織各層結構清晰,黏膜上皮完整,固有層腸腺數量豐富,排列緊密,間質偶見少量炎性細胞,肌層肌纖維排列規則,未見其它明顯異常。對照組和3 h實驗組沒有明顯差異,結果如Fig6。說明眼鏡蛇神經毒素對大鼠直腸組織不會產生損傷,組織結構無明顯病理變化。

Fig6 Pathological and histological characteristics of rat rectum ×20.0

2.9 眼鏡蛇神經毒素經直腸給藥后鎮痛活性測定在醋酸扭體實驗當中,直腸給藥眼鏡蛇神經毒素3 h后能夠起到降低醋酸引起的化學疼痛作用,與對照組相比,高劑量組和中劑量組鎮痛作用明顯,差異有統計學意義。低劑量組沒有明顯的鎮痛效果(P>0.05)。直腸給藥組的鎮痛效果稍差于腹腔注射組。直腸給藥組小鼠醋酸扭體抑制率達50%。說明眼鏡蛇神經毒素通過直腸途徑給藥發揮了鎮痛作用。

3 討論

本實驗通過陽離子交換和凝膠過濾兩步法提取了純度較高的眼鏡蛇神經毒素。通過直腸灌注方式給藥,對藥物吸收的直腸黏膜部位進行免疫組化,同時進行血漿質譜蛋白質檢測和小鼠鎮痛活性測定,是證明神經毒素從直腸黏膜吸收并且入血繼而發揮全身鎮痛作用的動態定性驗證過程。本研究提純的神經毒素具有阻斷神經肌肉傳導的作用,這是發揮鎮痛作用的基礎,且分子量與Liang等[8]的結果相符合。由于有研究證實眼鏡蛇毒成分中具有鎮痛物質,本文選擇眼鏡蛇毒中起鎮痛主要作用的神經毒素作為研究對象。提純后的單一成分相較于復雜的眼鏡蛇粗毒混合物具有更穩定更有效的鎮痛效果。

疼痛是一種應激反應,也是由身體損傷或疾病引起的癥狀。與細胞中的信號分子密切相關,這些分子包括激素、細胞因子、神經遞質、淋巴因子、生長因子和趨化因子,它們可以改變細胞中的離子,從而引起疼痛。非甾體抗炎藥(NSAIDs)或嗎啡類止痛藥被廣泛用作抗炎藥物。但非甾體抗炎藥可能會造成胃腸道損傷,嗎啡類藥物有成癮性、耐受性等不良并發癥和副作用[9]。鎮痛研究的重點是尋找無耐受性、無依賴性和無副作用的天然藥物[10]。本研究證實眼鏡蛇神經毒素直腸灌注方式能夠發揮鎮痛作用,且高劑量組和中劑量組鎮痛作用明顯,有別于其他已經報道的通過靜脈或者腹腔注射眼鏡蛇毒素的方式發揮鎮痛作用。如部分文獻報道的:靜脈注射LD50為1.987 5 mg·kg-1的眼鏡蛇毒液中的新型小分子肽,可提高小鼠的疼痛閾值;腹腔注射0.2 mg·kg-1的NTXI可以將小鼠在熱板上的痛閾值從100%提高到184.35%,鎮痛作用起效緩慢,在治療后2 h開始,4 h后達到最大效果,且無耐受性、無依賴性[11]。相較于以上給藥方式,直腸給藥方式起鎮痛作用起效時間沒有較大差別,發揮鎮痛作用的時間相差不大,3 h后便能起到鎮痛作用,能夠達到和注射相近的鎮痛效果。同時,對直腸給藥以后的腸道黏膜進行了病理分析,確定該藥物對直腸組織不會產生明顯損傷。

如今研究較多關于藥物發揮吸收作用的方式,其中最常見方式有口服給藥、靜脈注射給藥、腹腔注射給藥、皮下注射給藥等。直腸的環境相對穩定,酶活性較低,有利于解決一些藥物口服吸收差、首過代謝效應廣泛、對胃有刺激、在胃環境中穩定性不好等問題。直腸給藥有相較于其他給藥方式的優勢。國內外臨床批準了許多用于局部吸收和全身吸收的直腸制劑,其中包括布洛芬、水合氯醛、咖啡因、對乙酰氨基酚等一些常見的鎮痛劑[12]。同時,直腸給藥系統中,如何提高藥物的生物利用度也是一項需要解決的問題。某些藥物,需要通過加入適當的吸收促進劑來達到有效血藥濃度,現代制藥和新型直腸藥物輸送系統(RDDS) 的幫助下,讓藥物提高生物利用度和控制釋放成為可能[13]。神經毒素本身是一種分子量較小的多肽,為三指毒素能夠從直腸黏膜滲透到體內提供的可能。直腸給藥副作用小,起效快。對小孩、老年或昏迷患者這些特殊人群,選擇直腸給藥可以降低治療風險,降低操作難度[14]。具體直腸給藥方式的選擇也是一項值得討論的問題,常見的直腸給藥有灌腸和栓劑兩種方式,本文選擇的是灌腸的方式給藥。有關于其他鎮痛藥如布洛芬的藥代動力學比較研究,認為灌腸方式的藥物吸收量大,吸收速度快,相比于直腸栓劑能更快的發揮鎮痛和解熱作用[15]。

眼鏡蛇神經毒素為一種小分子量多肽,分子量小,進入血液循環以后分散成為多種片段,本文質譜檢測到的Cobra venom factor為神經毒素有關片段,也是眼鏡蛇毒液中的重要成分,具有神經毒性。具有鎮痛[16]、抗炎、抗腫瘤[17]等作用。本實驗進行大鼠血漿蛋白質組學分析用到的是Shotgun質譜檢測技術,它是一種高通量的蛋白質分析方法,也稱為蛋白質組學中的無序分析。該技術通過將蛋白質樣品消化成小片段,然后利用質譜儀進行分析,以確定它們的氨基酸序列和相對豐度[18]。這種方法得以在單次實驗中同時鑒定和定量數千個蛋白質。通過此方法,更加精確有效的尋找到了大鼠血漿中的蛇毒片段。但本研究存在的局限性是無法確定直腸給藥制劑發揮鎮痛效果的量效關系,只能確定目標蛋白質在血液當中的相對豐度,無法做到定量檢測具體進入體內藥物濃度的大小,此次檢測為定性檢測血液中是否存在蛇毒成分。后續進一步可通過質譜結合標記技術定量化檢測進入血液的蛇毒含量,探索發揮有效藥理作用的藥物濃度,并且比較不同時間點不同給藥方式的鎮痛效果,會更加擁有實際價值。

綜上所述,眼鏡蛇神經毒素作為一種生物毒素具有很大的臨床藥物開發價值,通過直腸方式灌注給藥眼鏡蛇神經毒素能夠通過此途徑入血并且發揮鎮痛作用。后續神經毒素若能夠與相應促進藥物吸收的促進劑結合,其吸收效果可能會更加明顯。此研究為后續研究神經毒素直腸給藥新制劑提供實驗依據,為臨床鎮痛藥物開發提供方向。