UPLC-Q-TOF-MS/MS 法分析鑒定雞血藤中藥復方提取物的化學成分

謝燦輝，賈德政，胥愛麗，鄔旻珊，肖觀林，畢曉黎，張素中，曹穎男*

（1.廣州中醫藥大學 第五臨床醫學院，廣東 廣州 510405；2.廣東省中醫藥工程技術研究院 廣東省中醫藥研究開發重點實驗室，廣東 廣州 510095；3.廣州新華學院 藥學院，廣東 廣州 510520）

近年來癌癥的發病率逐年上升，腫瘤的發生發展與機體的免疫功能低下密切相關。一方面機體免疫系統可通過多種免疫效應機制殺傷和清除腫瘤細胞；另一方面，腫瘤細胞也能通過多種機制抵抗免疫系統對其的殺傷與清除［1-2］。中藥在治療腫瘤方面具有副作用小、多靶點的特點，在提高機體免疫力方面有很大優勢，因此，以中醫藥調護機體、增強免疫力來治療癌癥的方法越來越受關注。

雞血藤中藥復方選取臨床的抗腫瘤中藥驗方，在結合腫瘤病因確立的治則治法上優化篩選出以雞血藤、重樓、莪術、柴胡組成的中藥復方（發明專利授權號CN106237265B），該中藥復方的抗腫瘤作用機制與免疫調節有高度相關性。盡管上述四味中藥均進行過系統的化學成分分析，但中藥復方發揮治療作用具有多成分、多靶點、多途徑整體調節的特點，各藥味組成中藥復方后，其化學成分可能會發生變化，多味藥之間可能會產生相互作用從而生成新的化學成分［3］。因此，對中藥復方的化學成分進行快速鑒定分析，獲取盡可能多的化學成分信息，對于研究化學成分與藥效之間的關系有十分重要的作用。

超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）技術廣泛用于中藥復方的多成分分析，具有靈敏度高、分辨率高、分離效率高和掃描速度快的特點，可為中藥藥效物質基礎研究提供重要參考［4-5］。本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術，通過離子碎片推測化學成分可能的裂解途徑，實現對雞血藤中藥復方提取物中化學成分的快速分離鑒定，為進一步研究雞血藤中藥復方藥效物質基礎提供了依據。

1 實驗部分

1.1 材料、試劑與儀器

阿魏酸（批號110773-201313，純度99.6%）、兒茶素（批號110877-201203，純度96.6%）、表兒茶素（批號110878-200102，純度99.7%）、原兒茶酸（批號110809-201906，純度97.7%）、原兒茶醛（批號813-9201）、咖啡酸（批號110885-200102）、柴胡皂苷a（批號110777-201510，純度93.2%）、柴胡皂苷d（批號110778-201208，純度94.6%）、大豆苷（批號111738-201302，純度91.3%）、大豆苷元（批號1502-200101）、綠原酸（批號110753-202119，純度96.2%）、重樓皂苷I（批號111590-202105，純度94.5%）、重樓皂苷Ⅱ（批號111591-201604，純度91.4%）、重樓皂苷Ⅵ（批號111592-201203，純度95.1%）、重樓皂苷Ⅶ（批號111593-202105，純度98.4%）、芒柄花素（批號111703-200603）、染料木苷（批號111709-201702，純度99.9%）、吉馬酮（批號111655-201204）、莪術醇（批號100185-200405）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院；異綠原酸B（批號RDD-Y06911812012，純度98%）、隱綠原酸（批號AF9080321，純度98%）、新綠原酸（批號RDD-X01402112013，純度98%）對照品均購自成都瑞芬思生物科技有限公司；異綠原酸A（批號RDD-Y06911812012，純度98%）對照品購自成都瑞芬思德丹生物科技有限公司；柴胡皂苷b2（批號MUST-19032104，純度99%）對照品購自成都曼思特生物科技有限公司。以上未標明純度的對照品的純度均大于98%。

實驗用水為屈臣氏蒸餾水，甲醇、乙腈、甲酸均為質譜純（美國Fisher Chemical 公司），其余試劑均為分析純。雞血藤（批號210501，產地廣東）、北柴胡（批號220502，產地陜西）、莪術（批號220601，產地廣西）、重樓（批號220501，產地云南）購自廣州至信中藥飲片有限公司，以上藥材均經廣東省第二中醫院（廣東省中醫藥工程技術研究院）劉法錦研究員鑒定。

Sorvall Legend Micro 17R 型微量離心機（美國Thermo Scientific 公司）；XS205 型電子分析天平（十萬分之一，瑞士Metter-Toledo 公司）；ExionLC AC 型液相色譜儀（日本島津公司）；X500R 質譜儀（美國AB Sciex公司）。

1.2 復方樣品制備

取莪術45 g，置于圓底燒瓶中，加入14倍量水，水蒸氣蒸餾法提取揮發油5 h，冷卻后移取揮發油并冷藏。藥渣與60 g 雞血藤、45 g 柴胡、45 g 重樓置于圓底燒瓶中，加入6 倍量水，加熱回流2 h，提取3 次，合并水煎液，70 ℃減壓干燥至干。刮取干膏，將其研磨成細粉，噴入揮發油，即得雞血藤中藥復方樣品。

1.3 溶液配制

1.3.1 供試品溶液精密稱取雞血藤中藥復方樣品粉末0.25 g 置于錐形瓶中，加入70%甲醇10 mL，超聲處理30 min。將提取液以12 000 r/min 離心10 min，取上清液用0.22 μm 微孔濾膜過濾，即得雞血藤中藥復方供試品溶液。

1.3.2 對照品溶液精密稱取各對照品適量，置于10 mL 棕色瓶中，甲醇超聲溶解，室溫放置澄清，以12 000 r/min離心10 min，取上清液用0.22 μm微孔濾膜過濾，即得混合對照品溶液。

1.4 實驗方法及數據處理

1.4.1 色譜條件色譜柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B）；流速：0.3 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣量：1 μL。梯度洗脫：0～3 min，95%～85% A；3～7 min，85%～75% A；7～13 min，75%～67% A；13～24 min，67%～55% A；24～34 min，55%～35% A；34～36 min，35%～20% A；36～40 min，20%～2% A；40～44 min，2% A；44～45 min，2%～95% A；45～50 min，95% A。

1.4.2 質譜條件電噴霧離子源（ESI）；正、負離子模式噴霧氣壓：5.5、-4.5 kV，裂解電壓：100、-80 V，毛細管電壓：5.5、-4.5 kV，碰撞能量：35、-35 eV，質量掃描范圍：m/z100～1 000，離子源溫度：500 ℃，氣簾氣壓力：35 psi（1 psi≈6.895 kPa），霧化氣與輔助氣壓力：55 psi。

1.4.3 數據處理通過查閱CNKI、SciFinder、ChemicalBook、PubChem、TCM systematic Pharmacology Database and Analysis Platform 等平臺或數據庫，對雞血藤中藥復方中化學成分的相關數據進行收集整理，構建雞血藤中藥復方本地化學成分數據庫。采用SCIEX OS 3.1.0軟件進行峰提取、峰匹配分析處理，在滿足質量偏差≤5，同位素豐度比≤5，數據庫匹配得分≥90 的基礎上，與數據庫中化合物的準分子離子峰、碎片裂解規律進行對比分析，最終鑒定化合物的結構。

2 結果與討論

雞血藤中藥復方提取物的UPLC-Q-TOF-MS/MS 總離子流圖見圖1。共鑒別出82種成分，包括黃酮類22種，苯丙素類24種，萜類25種，酚酸類4種，甾體類6種，氨基酸類1種。上述成分中，24種歸屬于雞血藤，16 種歸屬于莪術，27 種歸屬于柴胡，11 種歸屬于重樓，來源于多種藥味的成分有6 種。從雞血藤中藥復方中新發現的在處方藥材中未見報道的成分有10種（見表1）。

表1 雞血藤中藥復方提取物化學成分的UPLC-Q-TOF-MS/MS 鑒定與分析Table 1 UPLC-Q-TOF-MS/MS identification and analysis of chemical components in Jixueteng formula extract

圖1 雞血藤中藥復方提取物在負（A）、正（B）離子模式下的基峰色譜圖Fig.1 Base peak chromatograms of Jixueteng formula extract in negative（A） and positive（B） ion modes

2.1 主要化合物的鑒定和歸屬

2.1.1 黃酮類黃酮類化合物是一種次生代謝產物，存在于各種植物中。其是以3個碳原子和2個苯環連接而成的化合物，并以C6-C3-C6結構為基本母核。在雞血藤中藥復方中，黃酮類化合物的主要來源是雞血藤藥材。該類化合物是雞血藤抗腫瘤和抗貧血的主要活性成分。在電噴霧質譜中，黃酮類化合物易脫去糖基，并丟失中性碎片離子-O、-CO、-H2O、-CO2。此外，也容易發生逆狄爾斯-阿爾德反應（RDA）裂解［6］。化合物9 和13 在負離子模式下的分子離子峰均為m/z289.071 1［M-H］-，推斷其分子式均為C15H14O6，在裂解過程中脫落一分子CO2和一分子C6H6O2，形成m/z245.0818［M-H-CO2］-、m/z179.035 0［M-H-C6H6O2］-，兩個化合物互為同分異構體。經文獻［6］與對照品對比，確認化合物9為兒茶素，化合物13為表兒茶素，兒茶素可能的質譜裂解途徑見圖2A。化合物4在負離子模式下的分子離子峰為m/z153.019 3［M-H］-，推斷分子式為C7H6O4，在二級質譜中產生m/z109.028 9［M-H-CO2］-碎片離子，與文獻［7］及對照品比對，鑒定為原兒茶酸，可能的質譜裂解途徑見圖2B。異黃酮為黃酮類的異構體，其母核為3-苯基色原酮，當其結構存在甲氧基取代時，在負離子模式下易產生CH3碎片。化合物32 在負離子模式下的分子離子峰為m/z475.1234［M-H］-，在二級質譜圖中產生m/z267.065 9［M-HC6H10O5］-和m/z252.043 2［M-H-C6H10O5-CH3］-碎片離子，通過質譜信息與文獻［5］對比，推斷該化合物為芒柄花苷，可能的質譜裂解途徑見圖2C。

圖2 兒茶素（A）、原兒茶酸（B）、芒柄花苷（C）的質譜裂解途徑Fig.2 Fragment pathways of catechin（A），protocatechuic acid（B） and ononin（C）

（續表1）

2.1.2 萜 類萜類化合物是自然界中重要的有機化合物之一，半萜類、單萜類、二萜類和三萜類等天然萜類化合物被發現具有強大的抗腫瘤、抗炎和抑菌活性。萜類化合物有多種母核類型，均由同一生源途徑衍生而來。大多數萜類化合物具有雙鍵、共軛雙鍵和活潑氫，許多萜類化合物還含有內酯結構。在雞血藤中藥復方中，萜類化合物的主要來源是莪術藥材，部分來源于重樓和柴胡。化合物82在正離子模式下產生的分子離子峰為m/z219.1743［M+H］+，脫去1分子H2O生成碎片離子m/z201.1647［M+H-H2O］+，再脫去1 分子C6H8，生成碎片離子m/z105.0700［M+H-H2O-C6H8］+。經與文獻［7］和對照品比對，確認化合物82 為吉馬酮，可能的質譜裂解途徑見圖3A。化合物79 在正離子模式下的分子離子峰為m/z231.1369［M+H］+，二級質譜中檢測到碎片離子m/z213.1273［M+H-H2O］+和m/z203.1439［M+H-C2H4］+，結合文獻［8］，推測為莪術酮，可能的質譜裂解途徑見圖3B。柴胡皂苷在負離子模式下常與羧酸形成加合離子，化合物57在一級質譜中檢測到加合離子m/z825.4642［M+HCOO］-，在二級質譜中出現未加合的分子離子峰m/z779.4558［M-H］-，脫去1 分子糖后，生成碎片離子m/z617.4051［M-H-Glu］-。經與文獻［9］和對照品比對，確認化合物57為柴胡皂苷a，可能的質譜裂解途徑見圖3C。

圖3 吉馬酮（A）、莪術酮（B）、柴胡皂苷a（C）的質譜裂解途徑Fig.3 Fragment pathways of germacrone（A），curzerenone（B） and saikosaponin a（C）

2.1.3 苯丙素類苯丙素類化合物是一類由苯環和3個碳鏈連接而成的天然化合物，在植物中廣泛分布。在雞血藤中藥復方中，苯丙素類化合物主要來自柴胡藥材。大多數苯丙素類化合物是苯丙酸類化合物，在ESI 電離條件下與奎寧酸脫水成酯，并且易發生脫氧奎寧酸的中性丟失，從而生成相應的苯丙酸碎片離子。以化合物8為例，在負離子模式下分子離子峰為m/z353.0878［M-H］-，通過酯鍵裂解，中性丟失咖啡酰基，產生奎寧酸分子離子m/z191.0563［M-H-C9H6O3］-，通過與文獻［10］和對照品比對，確認為綠原酸，可能的質譜裂解途徑見圖4A。化合物23在負離子模式下的分子離子峰為m/z193.0506［M-H］-，其二級質譜碎片離子為m/z178.0274［M-H-CH3］-、m/z134.0369［M-H-CH3-CO2］-。結合裂解規律，并與文獻［11］和對照品比對，確認化合物23 為阿魏酸，可能的質譜裂解途徑見圖4B。化合物27 在負離子模式下的分子離子峰為m/z515.1195［M-H］-，失去1 分子C9H6O3得到m/z353.0882［M-HC9H6O3］-碎片離子，繼而發生脫氧奎寧酸的中性丟失，再失去1 分子C7H10O5，得到離子碎片m/z179.3040［M-H-C9H6O3-C7H10O5］-。通過與文獻［12］及對照品比對，確認化合物27為異綠原酸A，可能的質譜裂解途徑見圖5。

圖4 綠原酸（A）和阿魏酸（B）的質譜裂解途徑Fig.4 Fragment pathways of chlorogenic acid（A） and ferulic acid（B）

圖5 異綠原酸A的質譜裂解途徑Fig.5 Fragment pathways of isochlorogenic acid A

2.1.4 甾體類甾體類化合物具有環戊烷并氫化菲的環系結構，常與糖結合以皂苷的形式存在。雞血藤中藥復方中的甾體類化合物較少，主要來源于重樓藥材，其中重樓皂苷為主要的活性成分。重樓皂苷在質譜條件下易發生脫糖基、H2O、CO2以及苷元等基團，但較少出現分子離子加合峰及苷元的碎片峰信號。化合物73 在正離子模式下產生分子離子峰m/z723.4314［M+H］+，在二級質譜中得到m/z579.3153［M+H-Rha］+、m/z433.2575［M+H-Rha-Glu］+的碎片離子，經與文獻［13］對比，推測該化合物為重樓皂苷V，可能的質譜裂解途徑見圖6A。化合物41 在正離子模式下檢測到的分子離子峰為m/z885.4842［M+H］+，在二級質譜中可檢測到失去一分子葡萄糖的碎片離子m/z723.4321［M+H-Glu］+，該碎片離子失去一分子鼠李糖基得到碎片離子m/z579.3148［M+H-Glu-Rha］+，繼續丟失1個葡萄糖基得到碎片離子m/z415.3217［M+H-Glu-Rha-Glu］+。對比文獻［14］中的裂解規律，推測化合物41 為纖細薯蕷皂苷，可能的質譜裂解途徑見圖6B。

圖6 重樓皂苷V（A）和纖細薯蕷皂苷（B）的質譜裂解途徑Fig.6 Fragment pathways of paris saponin V（A） and gracillin（B）

圖7 雞血藤中藥復方的10種新成分Fig.7 10 New components of Jixueteng formula extract

2.2 討 論

雞血藤中藥復方的化學成分復雜，以黃酮類、苯丙素類、萜類化合物為主，且大多數與腫瘤發病機制有關。黃酮類化合物有著廣泛的抗腫瘤機制，可通過抑制細胞增殖、對化療增效減毒、誘導細胞自噬等多個機制起到抗腫瘤作用［15］。文獻表明，雞血藤中的芒柄花素、甘草素、表兒茶素等黃酮類成分可顯著抑制裸鼠移植模型中乳腺癌細胞（MCF-7）的生長，同時還可抑制癌細胞轉移［16］。苯丙素類化合物也具有廣泛的抗腫瘤作用。該類化合物主要來源于莪術和柴胡，以莪術醇為例，莪術醇具有非常好的抗腫瘤作用，可通過調控相關腫瘤的基因表達、抑制腫瘤組織血管的生成、影響細胞分化、抑制腫瘤細胞增殖并阻止腫瘤發生侵襲和轉移等多種作用途徑來發揮抗腫瘤功效［17］。萜類化合物來源于柴胡與重樓，主要以皂苷類化合物為主，其中柴胡皂苷a、d 可通過誘導細胞凋亡、抑制細胞增殖和生長、提高機體免疫功能等方式發揮抗腫瘤作用，且在宮頸癌、肝癌、肺癌等研究中均表現出顯著的治療效果［18］；重樓皂苷可通過抑制腫瘤細胞增殖、誘導腫瘤細胞程序性死亡、增加腫瘤細胞對化療藥物的敏感性、抑制腫瘤細胞遷移與侵襲、與其他藥物協同作用來發揮抗腫瘤作用［19］。

此外，在雞血藤中藥復方中還發現了藥材中未見報道的10種新成分，推測為中藥復方制備過程中多味藥的成分相互作用產生。化合物21 和69，根據其結構式推斷為四環三萜類和五環三萜類化合物，這兩類化合物在抗腫瘤、調節血脂、保肝和免疫調節方面顯現出較高的藥理活性［20］。芹菜素-7-O-β-D-葡萄糖醛酸苷是由芹菜素的7位羥基結合1分子的β-D-葡萄糖醛酸而成，具有很強的抗癌、抗氧化等藥物活性［21］。木脂素類化合物為苯丙素類的一種，具有廣泛的生物活性，可誘導癌細胞凋亡、逆轉腫瘤細胞耐藥性、抑制細胞增殖、抗血管生成等抗腫瘤作用［22-23］。化合物38、44、46、48、54、55、56 從結構式可推斷為木脂素類化合物，由此推測可能與上述抗腫瘤藥效相關，其中，化合物44和54互為同分異構體。雞血藤中藥復方中的抗腫瘤成分眾多，不同類型、不同來源的活性成分可通過協同或互補作用，實現多成分、多通路、多靶點綜合治療的效果。在本實驗中未能檢測到某些已知成分，可能與ESI的離子化效率有關。此外，部分難以區分的同分異構體結構只依靠四極桿-飛行時間串聯質譜進行確認存在一定的局限性。因此，需要進一步結合其他波譜分析技術確認這些成分的存在。

3 結 論

本實驗采用UPLC-Q-TOF-MS/MS 技術分析雞血藤中藥復方提取物中的化學成分，通過本地數據庫與色譜峰信息對比分析，共鑒別出82種化合物，以黃酮類、苯丙素類、萜類化合物為主。并發現該復方藥材中未見報道的新成分10種，其藥理作用可能與雞血藤中藥復方的抗腫瘤功效相關。研究結果豐富和完善了雞血藤中藥復方的化學成分庫，為雞血藤中藥復方藥效物質基礎研究及質量控制方法建立提供了重要依據。