氮摻雜碳量子點的制備及在細胞溫度傳感中的應用

陳雨昕，胡月芳

（1.賀州學院 廣西碳酸鈣資源綜合利用重點實驗室 材料與化學工程學院，廣西 賀州 542899；2.廣西中醫藥大學 賽恩斯新醫藥學院，廣西 南寧 530000）

熒光碳點（CDs）主要包含碳量子點（CQDs）、石墨烯量子點（GQDs）以及聚合物點（PDs）等類型［1-2］。CQDs 具有良好的化學穩定性、優異的生物相容性、良好的水溶性及優異的光電性能［3-5］，已發展成為一類深受歡迎的新型碳納米材料，是納米技術領域中最為活躍的研究課題之一。近年來，CQDs已在環境監測［6］、光催化［7］、熒光檢測［8］及生物成像等領域得到了廣泛應用。隨著低碳環保理念的推廣，綠色化學也成為碳納米材料研究的一個趨勢，研究者們越來越熱衷于利用常見的生物質資源，基于一些簡便、綠色、高效的方法合成生物質碳量子點（BCQDs）。與其他碳源相比，綠色生態友好的生物質碳源不僅具有價格低廉、獲取方便及來源廣泛等優點，還因含有多種元素，使得制備時不需添加外部雜原子即可得到各種性能優異的氮自摻雜碳量子點（N-CQDs）［9］。此外，采用生物質制備碳量子點還可使低價值的生物質廢棄物轉化為有價值的材料，實現變廢為寶，符合資源再利用的綠色低碳環保主旨。近年來，各種生物質包括枇杷葉［10］、桂花籽皮［11］、綠蘿葉［12］、黃豆［13］、韭菜［14］等已被用作碳源來制備系列生物質CQDs。

溫度是生命體最基本的參數之一，對活細胞內的酶活性、物質運輸、細胞分裂和能量代謝等生化反應具有很大的影響［15］。在一些基于熱效應治療腫瘤的方法中，探究細胞內的溫度分布及胞內區域溫度變化，是評估腫瘤治療效果的重要生理參數指標［16］。因此，對腫瘤細胞內溫度的高分辨率、高靈敏度測量，是一項非常有意義的研究工作。傳統的溫度測量方法通常是通過物體某些隨溫度變化的特征進行間接測量，比較常見的檢測工具有水銀溫度計、耳溫儀及熱電偶等［17］。但這些檢測方法響應速度慢，不能靈敏反映溫度的變化，且不能實現細胞體內的溫度測量，故在生物領域的應用受到限制。據報道，碳量子點表面狀態（缺陷和陷阱）的非輻射通道會受到溫度的影響，溫度升高會激活更多的非輻射通道，使更多的激發態電子通過非輻射過程返回到基態，導致碳量子點的熒光強度減弱，故碳量子點具有作為溫度傳感器的極大潛能［18］。

本研究以西紅柿為碳源和氮源，采用微波合成法在最佳合成條件下制備得到N-CQDs，對其形貌、結構、光電性能和溫敏性能進行分析，考察了所合成N-CQDs 的毒性和生物相容性，并將其作為熒光納米探針應用于細胞溫度傳感的研究，探討了基于其開發細胞無損測量納米溫度計的可行性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Tecnai G2 F20 S-TWIN 型場發射透射電子顯微鏡（TEM，荷蘭Philips公司）；Tecnai G2 F20 S-TWIN型X 射線光電子能譜儀（XPS，荷蘭Philips 公司）；Perkin Elmer Spectrum Two 型傅里葉變換紅外光譜儀（FT-IR，珀金埃爾默企業管理（上海）有限公司）；LS45 型熒光分光光度計（美國Agilent Technologies 公司）；X-5 型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；CHI660e 型電化學工作站（上海辰華儀器有限公司，鉑絲電極為對電極，飽和銀-氯化銀電極為參比電極，玻碳電極（GCE）為工作電極）；RA8恒溫循環器（德國LAUDA公司）；Zeiss LSM710激光掃描共聚焦顯微鏡（德國Zeiss公司）。

小鼠乳腺癌細胞（4T1）（上海林克生物科技有限公司）；胎牛血清（FBS）、DMEM 高糖培養基、胰酶、青霉素-鏈霉素和MTT（美國Sigma 公司）；氯化鈉（NaCl）和殼聚糖（C6H11NO4）n（天津市福晨化學試劑廠）；氧化鋁（Al2O3）、葡萄糖（C6H12O6·H2O）（天津市科密歐化學試劑有限公司）；十二水合磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）、十二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·12H2O）和二水合磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）（西隴化工股份有限公司）。對照實驗所使用的CQDs為課題組自制。

1.2 N-CQDs的制備

通過對合成時間（3、6、8、10、12 min）、合成溫度（高火、中高火、中火）進行優化，得到最佳合成時間為8 min、最佳合成溫度為中高火。具體步驟如下：將新鮮的西紅柿用去離子水洗凈榨汁，取5 g 西紅柿汁（30 mL）置于微波爐中高火加熱8 min，直到紅色液體變為棕黑色物質，將該物質進行研磨，加適量去離子水溶解后離心30 min（4 000 r/min），收集上層棕色混合液。再將收集到的棕色混合物置于透析膜（截留分子量1 000）中在去離子水中透析72 h（每間隔3～4 h 換一次水），可得深黃色N-CQDs 透析液，于4 ℃冰箱中儲存備用。

1.3 N-CQDs的表征

N-CQDs的形態和功能基團及其分子結構由TEM、XPS、FT-IR 進行表征；光學性質用熒光分光光度計、紫外分光光度計和紫外燈進行研究。

1.4 熒光量子產率的測定

以含0.1 mol·L-1H2SO4溶液的硫酸奎寧作為標準參考物［19］，采用公式（1）計算N-CQDs 溶液的熒光量子產率（Q）。

式中，Q、QR分別為N-CQDs和標準參考物的熒光量子產率；A和AR為兩者在365 nm激發波長下的紫外吸光度；I和IR為該激發波長下N-CQDs和標準參考物的熒光峰面積；η和ηR為對應的折光系數。

1.5 N-CQDs穩定性研究

實驗考察了NaCl 濃度對N-CQDs 熒光強度的影響［20］。配制濃度為30、60、90、120、150、180、210 mmol/L 的NaCl 溶液，分別取1 mL NaCl 溶液與1 mL 質量濃度為10 μg/mL 的N-CQDs 等體積混合，將混合液置于5 mL比色皿中，在376 nm激發波長和440 nm發射波長下測量熒光強度。

同時考察了不同pH 值（5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0）的磷酸鹽緩沖溶液（PBS）對N-CQDs熒光強度的影響［21］。分別取1 mL 質量濃度為10 μg/mL 的N-CQDs 與2 mL PBS 緩沖溶液混合，將混合液置于5 mL比色皿中，于376 nm激發波長下測定其熒光強度。

1.6 N-CQDs電化學性能的研究

用砂紙打磨GCE，去除其表面的氧化膜，先后使用0.3 μm 和0.05 μm 的氧化鋁粉末反復打磨拋光，并使用乙醇和去離子水超聲清洗，烘干備用。將3 mg CQDs或N-CQDs倒入1 mL殼聚糖溶液（5 mg/L）中制備混合液，取一滴該混合液滴至GCE表面，低溫烘干，制備得到CQDs或N-CQDs修飾的GCE。

將修飾好的CQDs/GCE 和N-CQDs/GCE 置于1 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（摩爾比1∶1）和0.1 mol/L PBS（pH 7.5）的混合溶液中，進行循環伏安（CV）掃描；置于5 mmol/L K3Fe（CN）6/K4Fe（CN）6（摩爾比1∶1）和0.5 mol/L KNO3的混合溶液中，進行電化學阻抗（EIS）掃描。

1.7 N-CQDs溫敏性能分析

使用恒溫水循環器連接熒光分光光度計進行樣品溫度控制，通過外接恒溫系統對N-CQDs 納米顆粒水溶液進行加熱，分別測定其在不同溫度下的熒光光譜。

1.8 細胞毒性及細胞傳感性能研究

用MTT 法進行N-CQDs 生物毒性研究。在7 個培養皿中分別添加0、100、150、200、250、300、350 μg/mL 的N-CQDs溶液，隨后加入20 μL 20% MTT 溶液孵育16 h。向各培養皿中加入100 μL二甲亞砜，反應15 min。將培養皿置于570 nm 的酶聯免疫吸附測定儀中進行光學測量，考察N-CQDs 的生物毒性。

用胰酶消化4T1 細胞，然后將細胞懸浮液接種至4 個35 mm 的細胞培養皿中，并置于CO2含量為5%、溫度37 ℃的培養箱中培養24 h。隨后將4 個培養皿中的4T1 細胞與10 μg/mL N-CQDs 及高糖細胞培養基在37 ℃下孵育2 h。使用pH 7.4的磷酸鹽緩沖溶液沖洗3次，并通過外接恒溫系統緩慢加熱（注意控制細胞的原位溫度），使用激光掃描共聚焦顯微鏡觀察細胞形貌。檢測之前，將設置溫度點（20、30、40、50、60 ℃）平衡5 min。

2 結果與討論

2.1 N-CQDs結構及組成

利用TEM、FT-IR 等手段對N-CQDs 的粒徑分布、表面成分組成等進行研究。從圖1A 可以看出，合成的碳點為較均一的顆粒球形小圓點，分散性良好，平均粒徑約3.4 nm。由FT-IR 可知，1 638 cm-1處為C=C 鍵的伸縮振動，1 886 cm-1處為C=O 的彎曲振動，3 306 cm-1處為O—H 鍵的彎曲振動（圖1B）。該結果表明N-CQDs表面存在大量的羧基和羥基等親水基團，具有良好的水溶性［22］。

采用XPS 考察N-CQDs 的表面元素構成，結果顯示，N-CQDs 全譜圖（圖2A）中531.9、399.9、284.9 eV 處的峰分別對應O1s、N1s和C1s 3 個特征峰［23］，說明該西紅柿碳量子點的主要組成元素為C、N 和O。元素含量分析結果表明，該N 自摻雜CQDs 中C、N、O 的相對元素百分含量分別為65.24%、1.48%和30.28%。圖2B為C1s的XPS高分辨圖譜，其在286.4 eV和284.8 eV處出現的兩個發射峰分別歸屬為C—O 和C=C/C—C 鍵［24］；圖2C 為N1s 的XPS 高分辨圖譜，其在399.5 eV 和403.0 eV 處的兩個發射峰分別歸屬為C—N—C 和C—N 鍵；O1s 的XPS 高分辨圖譜（圖2D）在531.8 eV 和532.9 eV 處的兩個擬合峰分別歸屬為O=C 和C—O 鍵［25］。XPS 測定結果表明該碳量子點為氮摻雜碳量子點，產率為44.9%，經式（1）計算可得到N—CQDs的量子產率為18.9%。

圖2 N-CQDs的XPS全譜圖（A），C1s分譜（B），N1s分譜（C），O1s分譜（D）Fig.2 XPS full spectrum（A），C1s spectrum（B），N1s spectrum（C），O1s spectrum（D） of N-CQDs

圖3 為N-CQDs 的XRD 圖，其在22.3°處的寬衍射峰為無定形碳結構的（002）晶面［26］，說明所合成的量子點為無定形結構。

圖3 N-CQDs的XRD圖Fig.3 XRD pattern of N-CQDs

2.2 N-CQDs光學性能分析

N-CQDs 內部的π-π*電子躍遷［27］使得其在波長284 nm 處出現UV-Vis 吸收峰（圖4A）；由圖4B 可知，N-CQDs的最大激發和發射峰分別位于380 nm和453 nm。N-CQDs（10 μg/mL）在不同激發波長下的發射光譜如圖4C所示，結果表明，隨著激發波長由360 nm增加至460 nm，N-CQDs的熒光發射峰發生紅移，表現出明顯的激發波長依賴性。N-CQDs 的激發波長依賴現象，可能因其發射位置和顆粒大小差異所致［28］。圖4D 為N-CQDs 溶液在自然光和紫外燈光下的照射效果比對圖，在紫外燈下N-CQDs 溶液發射出明亮的藍光。

圖4 N-CQDs的UV-Vis圖（A），N-CQDs的最大激發和最大發射波長圖譜（B），N-CQDs在不同激發波長下的熒光發射光譜圖（C），N-CQDs在自然光（左）和紫外燈（右）下的發光圖（D）Fig.4 UV-Vis spectrum（A） and spectra of maximum excitation and maximum emission wavelength（B） of N-CQDs，emission fluorescence spectra of N-CQDs at different excitation wavelengths（C），diagrams of N-CQDs under natural light（left） and ultraviolet lamp（right） exposure（D）

2.3 N-CQDs熒光穩定性分析

考察了10 μg/mL 的N-CQDs 在不同NaCl 濃度和pH 值下的熒光強度穩定性。結果發現，NCQDs 溶液的熒光強度在不同濃度NaCl 溶液和不同pH值的酸堿性溶液中均保持較穩定的狀態，表明N-CQDs具有優異的耐鹽性和熒光穩定性。

2.4 N-CQDs電化學性能分析

碳量子點的電化學性能也會對其細胞溫度熒光傳感性能產生較大的影響，如當量子點的電荷狀態發生變化時，其熒光強度、熒光壽命及熒光波長均將發生變化，從而影響細胞溫度熒光傳感的準確性與精密性。因此，在制備細胞溫度熒光傳感器時，也需要對碳量子點的電化學性能進行優化。

采用循環伏安法和電化學阻抗法分析N-CQDs的電化學性能，并以CQDs作為對照。如圖5A所示，CQDs和N-CQDs修飾的GCE的CV曲線均出現閉合的氧化還原峰。CQDs修飾的GCE的氧化峰和還原峰對稱性稍差，是準可逆過程；而N-CQDs修飾的GCE的CV曲線中的還原峰和氧化峰比較對稱，表明在電極表面發生了反應速率較快的可逆過程。原因可能是，相比CQDs，N-CQDs 表面所含的基團較豐富，使得電極表面的電活性面積增大，電流的運輸能力提高。CV圖譜結果表明，N-CQDs具有比CQDs更為優異的光電性能。

圖5 CQDs、N-CQDs修飾玻碳電極的CV圖譜（A）及裸電極、CQDs、N-CQDs修飾電極的EIS圖譜（B）Fig.5 CV diagrams of CQDs and N-CQDs modified GCE（A） and EIS diagrams of bare GCE，CQDs and N-CQDs modified GCE（B）

電化學阻抗法也被用于考察N-CQDs修飾的GCE的電化學性能，如圖5B所示，裸GCE的電化學阻抗非常小，修飾CQDs后電化學阻抗得到明顯增強；而N-CQDs修飾的GCE的電化學阻抗增強更大，即N-CQDs修飾的GCE電極的電化學性能更為優異。

2.5 N-CQDs溫敏性能分析

考察了溫度（25～65 ℃）對N-CQDs 熒光強度的影響。如圖6A 所示，隨著溫度的升高，N-CQDs 的熒光強度明顯降低，65 ℃時N-CQDs 的相對熒光強度猝滅了51%；當溫度從65 ℃降回25 ℃時，NCQDs 的熒光強度逐漸得到恢復。在25～65 ℃范圍內，N-CQDs 的熒光強度（IF）與溫度（t）呈良好的線性關系（圖6B），線性方程為IF=1296.54-14.95t，相關系數（r2）為0.998 7。結果表明，在25～65 ℃范圍內，N-CQDs的熒光強度顯示出良好的可逆性，在該范圍內的溫度變化不會對N-CQDs表面的熒光結構造成永久性破壞。N-CQDs的熒光強度隨著溫度升高而減弱的現象可能是由于溫度升高使N-CQDs發生聚集引起了明顯的熒光猝滅［28］。N-CQDs 的熒光強度隨溫度的升高呈線性下降，表明N-CQDs 具有優異的溫敏性能，有望開發成溫度傳感器。

圖6 溫度對N-CQDs熒光強度的影響（A）及N-CQDs熒光強度與溫度的線性關系（B）Fig.6 Effect of temperature on fluorescence intensity of N-CQDs（A） and linear relationship between fluorescence intensity of N-CQDs and temperature（B）

2.6 N-CQDs細胞毒性分析

采用MTT 法測定了不同質量濃度的N-CQDs 對4T1 細胞的毒性。從圖7 可知，將不同質量濃度的NCQDs 與4T1 細胞共孵育后，后者仍呈現出良好的細胞活性，當N-CQDs為350 μg/mL時，細胞活性為原來的94.2%。結果表明該N-CQDs的細胞毒性幾乎可以忽略不計，具有良好的生物相容性，在活細胞成像領域具有很大的應用潛力。

圖7 不同質量濃度N-CQDs下細胞毒性測試Fig.7 Cytotoxicity test in the presence of N-CQDs at different mass concentrations

2.7 N-CQDs的細胞溫度傳感性能分析

從圖8A 可以看出，N-CQDs 孵育的4T1 細胞在紫外光激發下發出明亮的藍光，證明N-CQDs 具有良好的細胞膜穿透性，可用于細胞成像。圖8A～E 顯示，當從25 ℃緩慢加熱至65 ℃時，N-CQDs 的熒光強度逐漸減弱。從細胞明場圖片（圖8F）可以看出，細胞和N-CQDs 孵育后發育良好，未出現明顯損傷，說明該N-CQDs 對細胞的毒理性低，通過對比細胞的熒光強度，即可得到細胞的溫度變化信息，所制備的N-CQDs有望用于活細胞溫度的探測及成像。

圖8 N-CQDs孵育的4T1細胞在不同溫度下的共聚焦顯微鏡圖Fig.8 Confocal microscopy imagings of 4T1 cells incubated with N-CQDs at different temperatures

3 結 論

本研究以生物質西紅柿為原材料，通過微波法制備得到熒光強度強、水溶性穩定的氮自摻雜碳量子點N-CQDs。TEM、UV-Vis、FT-IR、XPS、熒光、電化學分析結果顯示，N-CQDs 表面富含羥基、羧基等親水基團，有較強的穩定性，光學性能優良，電化學性能優異，具有良好的溫度傳感性能及生物相容性，可應用于活細胞的溫度探測及成像，在溫度響應的熒光傳感生物醫學領域具有潛在的應用價值。