高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法測定化妝品中二硬脂基二甲基氯化銨

湯 娟，丁友超，費曉慶，吳 斌，錢志娟，陳山丹，李 柏

（1.南京海關工業(yè)產品檢測中心，江蘇 南京 210019；2.南京海關動植物與食品檢測中心，江蘇 南京 210019；3.南京海關輕工產品與兒童用品檢測中心，江蘇 揚州 225009；4.南京金檢檢驗有限公司，江蘇 南京 210019）

二硬脂基二甲基氯化銨（DSDMAC）是一類季銨鹽類陽離子表面活性劑，在化妝品中主要用作洗滌劑、乳化劑、柔順劑和防靜電劑。該類化合物通常由碳鏈長度為十八和十六的烷基二甲基氯化銨混合物組成，主要包括雙十八烷基二甲基氯化銨（DHDMAC）、十六烷基十八烷基二甲基氯化銨（HODMAC）和雙十六烷基二甲基氯化銨（DODMAC）3種化合物。

DSDMAC 易通過食物鏈在生物體和人體內富集蓄積，該類物質具有一定的生物毒性，對水產品中魚類的半數(shù)致死濃度為0.6～2.6 mg/L（作用48～96 h）［1］。國外已頒布法規(guī)對該類物質進行限制，如歐盟化學品注冊、評估、授權和限制法規(guī)（REACH）規(guī)定產品中DSDMAC 的含量不得超過0.1%（質量分數(shù)），挪威消費性產品中禁用特定有害物質法令（PoHS）也進行了相同含量水平的限制［2］。美國環(huán)境工作組（EWG）將DSDMAC 的安全性等級列為3 級（安全性最高為1 級）。研究表明，DSDMAC 也是誘發(fā)過敏的過敏原之一，該類物質對皮膚尤其是眼周等敏感部位的皮膚具有刺激性［3-4］。目前我國尚未對此類化合物進行監(jiān)管，尤其是新版的化妝品技術規(guī)范未對該類化合物進行限制，這可能對化妝品進出口貿易尤其是出口貿易產生影響，也會給人民大眾的身體健康帶來威脅。因此，迫切需要建立一種測定化妝品中DSDMAC的有效簡便的方法。

目前，DSDMAC 檢測的樣品基質主要集中于紡織品［5-7］和染整助劑［8］，針對化妝品基質的報道較少［9］；采用的檢測方法一般為液相色譜-質譜法。與DSDMAC 類似結構物質的檢測方法主要有液相色譜-質譜法［10-13］、高效液相色譜法［14-15］、氣相色譜-質譜法［16］、毛細管電泳法［17］、分光光度法［18］等。其中質譜檢測器的成本較高，毛細管電泳儀的普及率低于高效液相色譜儀，分光光度計的檢測干擾較多，DSDMAC無紫外吸收，采用常規(guī)的紫外檢測器無法檢測，而蒸發(fā)光散射檢測器（ELSD）是一種通用型檢測器，不要求樣品有紫外或熒光吸收，因此本文采用高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測法測定化妝品中的DSDMAC，目前國內外均未見報道。本方法對市售化妝品的應用結果可為國內相關法規(guī)制訂提供數(shù)據(jù)支撐，為海關行政部門應對國外技術貿易壁壘提供技術支持，為化妝品生產企業(yè)提供技術指導，具有較高的應用價值。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

1260 型高效液相色譜儀，配備ELSD 檢測器（美國Agilent 公司）；KQ-250DB 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HY-DA 型機械振蕩器（常州潤華電器有限公司）；LDZ5-2型離心機（美國Sigma 公司）；Milli-Q 去離子水儀（美國Sigma 公司）；PL602-L 型、ML54 型電子天平（感量0.01 g 和0.000 1 g，梅特勒-托利多上海有限公司）。

乙腈（色譜純，德國Merck公司）；乙酸銨（色譜純，美國Sigma-Aldrich公司）；氯化鈉（分析純，南京化學試劑股份有限公司）；DSDMAC標準物質（純度≥99.0%，德國Dr. Ehrenstorfer公司）。

1.2 標準溶液的配制

準確稱取DSDMAC標準物質10 mg，用乙腈充分溶解后定容至10 mL，配制成質量濃度為1 000 mg/L的標準儲備液。根據(jù)檢測需求，將標準儲備液用乙腈逐級稀釋成所需質量濃度的系列標準工作液。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g（精確至0.01 g）樣品于50 mL 離心管中，加入15 mL 乙腈水溶液（體積比2∶1），通過超聲處理分散樣品，加入3 g 氯化鈉后以160 r/min 振蕩提取30 min，8 000 r/min 離心5 min。取5 mL 上層清液濃縮至干后，用1 mL乙腈溶解殘渣，經(jīng)有機相濾膜過濾到進樣瓶中，供測定。

1.4 分析條件

色譜柱：AcclaimTMSurfactant柱（150 mm×4.6 mm，5 μm，美國Thermo Fisher Scientific 公司）；流動相：A 為100 mmol/L 乙酸銨水溶液（pH 5.5），B 為乙腈；梯度洗脫程序：0.0～10 min，70%～95% B，10～15 min，95% B，15～16 min，95%～70% B，16～18 min，70% B；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μL；流動相流速：1.0 mL/min；分析時間：18 min；ELSD蒸發(fā)溫度為40 ℃，霧化器溫度為45 ℃，霧化氣體為氮氣，載氣流速為1.5 L/min。

2 結果與討論

2.1 檢測器的選擇

采用二極管陣列檢測器，在0～30 min 和190～700 nm 范圍內，對質量濃度為50 mg/L 的DSDMAC標準溶液進行全波長掃描。結果表明，待測分析物幾乎無紫外吸收，二極管陣列檢測器不能獲得有效響應。蒸發(fā)光散射檢測器、示差檢測器和質譜均是通用型檢測器，但示差檢測器的靈敏度相對較低，且不適用于梯度洗脫，質譜的價格昂貴、不易推廣。因此，本研究選擇蒸發(fā)光散射檢測器。

2.2 色譜柱的選擇

已有文獻［6-10］主要采用氨基柱作為DSDMAC的分離色譜柱，C18柱是液相色譜分離最常用的色譜柱，AcclaimTMSurfactant 柱是專用于分離陰離子、陽離子、非離子和兩性表面活性劑的色譜柱。本研究以100 mmol/L 乙酸銨水溶液（pH 5.5）和乙腈作為流動相，比較了C18柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）、氨基柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）和AcclaimTMSurfactant 柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）對DSDMAC 的分離效果。結果表明，DSDMAC 在AcclaimTMSurfactant 柱上的分離效果最佳，在C18柱上無保留，在氨基柱上DSDMAC 中的3 種化合物（DHDMAC、HODMAC、DODMAC）無法基線分離。因此，本研究采用AcclaimTMSurfactant柱為分離色譜柱。

2.3 流動相的優(yōu)化

高效液相色譜分析常用的有機流動相為甲醇和乙腈，但實驗發(fā)現(xiàn)甲醇會導致AcclaimTMSurfactant柱的背景壓力過高，而使用任何比例的乙腈，色譜柱背景壓力均適中。因此，選擇乙腈作為有機流動相。

流動相的離子濃度是影響分離效果的重要因素之一。分別比較了不同濃度的乙酸銨水溶液（0～200 mmol/L）作為水相對DSDMAC 色譜分離的影響。結果顯示，待測分析物的保留時間隨著離子濃度的增加而增加，當乙酸銨的濃度為100 mmol/L 時，DSDMAC 可獲得較理想的保留時間和分離效果。因此，選擇100 mmol/L乙酸銨水溶液為水相。

流動相的pH 值對色譜分離也有較大影響。AcclaimTMSurfactant 柱的最佳使用pH 值為3.0～6.5；乙酸銨作為緩沖鹽時，ELSD的推薦使用pH值為3.8～5.8 和8.2～10.2。結合上述要求，分別比較了pH值為4.0、4.5、5.0 和5.5 的100 mmol/L 乙酸銨水溶液對DSDMAC 色譜分離效果的影響。結果表明，隨著pH 值的增大，各分析物的保留時間均有所增加，當pH 值為5.5 時，DSDMAC 獲得最佳的分離效果和響應。因此，選擇流動相pH 值為5.5。在優(yōu)化色譜條件下，50 mg/L DSDMAC的色譜圖見圖1。

圖1 DSDMAC的色譜圖Fig.1 Chromatogram of DSDMAC

2.4 前處理條件的優(yōu)化

2.4.1 提取溶劑的優(yōu)化DSDMAC 易溶于極性有機溶劑，微溶于水。以不同基質種類的化妝品為研究對象，分別比較了甲醇、乙醇和乙腈作為提取溶劑時對樣品的提取情況。結果顯示，直接采用上述3 種溶劑提取時，由于部分化妝品中含有大量水溶性增稠劑，不僅影響提取液的過濾，長期使用還會堵塞色譜柱。另外，多數(shù)化妝品中含有大量親水性表面活性劑，長期使用會嚴重污染儀器。最終采用乙腈水溶液（2∶1）超聲分散樣品，再加入氯化鈉至兩相分層，該前處理方法可去除大量的水溶性增稠劑和親水性表面活性劑。

2.4.2 提取條件的優(yōu)化以空白卸妝油、護發(fā)精油、眼影、粉餅、牙膏、口紅、乳液、洗發(fā)露、精華水、漱口水為研究基質，采用加標回收實驗，比較了不同振搖時間和振蕩頻率對DSDMAC 回收率的影響。結果顯示，隨著振搖時間的延長和振蕩頻率的增大，DSDMAC 的回收率也隨之提高，但過高的振蕩頻率會使一些樣品出現(xiàn)乳化現(xiàn)象而導致回收率下降。實驗選擇振搖時間為30 min，振蕩頻率為160 r/min，該條件下DSDMAC的回收率均不低于92%。

2.5 方法學評價

2.5.1 線性范圍、檢出限及定量下限根據(jù)檢測需求，將標準儲備液逐級稀釋成所需濃度的系列標準工作液，按照“1.4”條件進行檢測。將DSDMAC 中3 種化合物對應的峰面積之和（Y）與對應的質量濃度（X，mg/L）進行線性回歸，得到線性方程。在空白基質樣品中分別添加不同濃度水平的待測組分，根據(jù)3 倍（S/N=3）和10 倍信噪比（S/N=10）分別確定檢出限（LOD）和定量下限（LOQ）。結果表明，DSDMAC 的線性范圍為10～200 mg/L，相關系數(shù)（r2）為0.999 4，檢出限和定量下限分別為3.27、9.96 mg/kg，能夠滿足REACH法規(guī)和PoHS法令的檢測要求。

2.5.2 準確度與精密度分別以代表性空白樣品（卸妝油、護發(fā)精油、眼影、粉餅、牙膏、口紅、乳液、洗發(fā)露、精華水、漱口水）為基質，采用三水平六平行的方式進行加標回收實驗（見表1）。結果表明，在3個不同加標水平下，上述樣品中DSDMAC 的平均回收率為82.5%～101%，相對標準偏差（RSD，n=6）均不大于6.3%。本方法的準確度和精密度均符合殘留物分析技術指標要求。

表1 空白樣品中DSDMAC的回收率與相對標準偏差（n=6）Table 1 Recoveries and relative standard deviations of DSDMAC in blank samples（n=6）

2.6 實際樣品檢測

采用本方法對市售的133 個不同品種化妝品進行測定，樣品來源于國內企業(yè)產品和進口產品。結果表明，大部分樣品中DSDMAC 的含量滿足國外相關法規(guī)要求，但有1 個乳液樣品中DSDMAC的測定值（1 909 mg/kg）超出法規(guī)限量要求。陽性樣品的色譜圖見圖2。

圖2 陽性樣品的色譜圖Fig.2 Chromatogram of a positive sample

3 結 論

本研究建立了高效液相色譜-蒸發(fā)光散射檢測器測定化妝品中無紫外吸收的DSDMAC 的分析方法。通過對色譜柱、流動相和樣品前處理條件的優(yōu)化，使DSDMAC 中3 種主要結構化合物得到有效分離。該方法準確、快速、有效，可滿足國外REACH 法規(guī)和PoHS 法令的監(jiān)管要求，也可為國內相關法規(guī)的限量制訂提供數(shù)據(jù)支撐，為海關行政部門的進出口化妝品監(jiān)管工作提供技術支持。