利用不同方法將小分子NADPH 轉染進入細胞的比較

李皓玥，杜文靜，李 薇

中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 細胞生物學系 重大疾病共性機制研究全國重點實驗室，北京 100005

煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, NADPH) 是還原性輔酶Ⅱ,分子量為0.745 ku,非生物大分子,是一個由兩個位于中心位置的磷酸基團組成的小分子物質[1]。NADPH是細胞抗氧化系統中的關鍵輔助因子,也是許多酶促反應和生物合成反應(例如核苷酸合成、脂質合成和脂肪酸鏈延長)中重要的電子供體[2]。癌細胞中高水平的活性氧(reactive oxygen species,ROS)會對DNA等大分子造成損傷,導致細胞凋亡和線粒體通透性增加,而NADPH可以中和ROS,因此NADPH對癌細胞的生長和存活至關重要[3-4]。此外,最近研究還發現 NADPH作為內源組蛋白去乙酰化酶3(histone deacetylase 3,HDAC3)的抑制劑,在調控表觀遺傳和基因表達方面的非代謝作用[5]。越來越多的證據表明,研究細胞內NADPH的功能可能為腫瘤的治療提供一些新思路。同時,研究細胞內NADPH的功能需要改變細胞內NADPH水平,然而,NADPH本身不能穿過細胞膜[6]。雖然可以通過過表達相關代謝酶來增加其細胞內水平,但這也可能會導致除NADPH之外的諸多變化。因此,迫切需要開發一種可以直接提高細胞內NADPH水平的方法。

基因和蛋白質可以通過核酸轉染試劑轉染進入細胞,轉染試劑在核酸轉染系統中具有很高的使用率[7]。但卻很少用于轉染小分子物質,本文試圖找到一種通過轉染試劑將NADPH轉染進入細胞的方法,在這里評估了3種轉染試劑,包括:LipofectamineTM2000(Lipo2000),LipofectamineTMRNAiMAX(RNAiMAX)和X-tremeGENETMHP DNA transfection reagent (X-tremeGENE)。Lipo2000和RNAiMAX均是通過陽離子脂質體將目的基因轉染進入細胞,是最具有代表性、應用最廣泛、被引用最多的轉染試劑[8-10]。X-tremeGENE是一種多組分轉染試劑,雖然其成分尚不清楚,但是最近的科學研究中已經成功的轉染了各種昆蟲細胞和難以轉染的細胞系[7,11]。本文基于研究結果開發了一種使用X-tremeGENE將外源NADPH轉染到U2OS和3T3L1細胞的方法。該方法簡單、方便、高效,對今后NADPH在細胞內的研究具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞:人骨肉瘤細胞系U2OS和小鼠胚胎成纖維細胞系3T3L1(ATCC細胞庫)。

1.1.2 主要試劑:NADPH粉末、油紅O(Oil Red O)、地塞米松(dexamethasone)、異丁基甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylanxthine,IBMX)、羅格列酮(rosiglitazone)、胰島素(Sigma-Aldrich公司);DMEM培養基和胎牛血清(Gibco公司);胰蛋白酶(北京細工生物科技有限公司);LipofectamineTM2000、LipofectamineTMRNAiMAX、Opti-MEM(Invitrogen公司);X-treme GENE(Roche公司);BCA蛋白質定量試劑盒(上海翌圣生物科技有限公司);4% 多聚甲醛(武漢賽維爾生物科技有限公司);PicoProbeTM NADPH 定量試劑盒(BioVision公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞的培養:3T3L1前脂肪細胞系在含10% 小牛血清的DMEM培養基中培養。U2OS細胞系在含10% 胎牛血清的DMEM培養基中培養。將細胞放入37 ℃ 5% CO2的培養箱中。所有細胞均在無抗生素的條件下培養。將2×105個處于對數期的U2OS細胞或5×104個處于對數期的3T3L1細胞接種到無菌的六孔板中,加入2 mL生長培養基,轉染時U2OS細胞匯合度約為70%～90%,3T3L1細胞融合度約為30%～40%。

1.2.2 NADPH溶液配制:稱取114.2 mg NADPH粉末于1.5 mL 離心管中,加入100 μL ddH2O溶解混勻,即得到1 mol/L NADPH母液。

1.2.3 NADPH轉染:制備NADPH/Opti-MEM混合物,將10 μmol/L NADPH與200 μL Opti-MEM加入1.5 mL離心管中,上下輕輕吹打數次。隨后分別將10 μL X-tremeGENE、Lipo2000和RNAiMAX加入到不同的NADPH/Opti-MEM混合物管中,并立即混合,得到轉染復合物。然后將轉染復合物在室溫(～25 ℃)下孵育15～30 min,再添加到每個孔中并輕輕晃動2～3次。

1.2.4 檢測NADPH含量

1.2.4.1 細胞體積的測量與計算:將1×103個細胞加入1 mL培養基重懸,取20 μL細胞懸液置于細胞計數板的小室內,利用Countstar高通量細胞計數儀得到細胞的直徑,根據細胞體積的計算公式計算出細胞的體積。

1.2.4.2 NADPH檢測試劑盒:使用NADPH定量檢測試劑盒分析細胞內NADPH水平。將細胞用200 μL NADPH提取緩沖液勻漿,并在冰上孵育10 min。將裂解液10 000×g4 ℃離心5 min,收集上清液。為了檢測NADPH,需要在反應前分解NADP+。將上清液在60 ℃水浴中加熱30 min,使 NADP+完全分解。在冰上冷卻上清液,短暫離心后取50 μL上清液轉移至96孔板中。每孔添加100 μL反應混合物,其中包含:NADPH循環緩沖液97 μL、NADPH循環酶混合物2 μL、PicoProbeTM1 μL。室溫60 min后,測量熒光(Ex/Em=535/587 nm)。同時,使用BCA試劑盒分析蛋白質濃度,繪制NADPH標準曲線,并通過細胞體積計算細胞中的NADPH濃度。

1.2.4.3 LC-MS測定細胞中NADPH含量:為了提取細胞內代謝物,用預冷PBS洗滌細胞3次,將1 mL預冷的80% HPLC級甲醇添加到含有細胞的1.5 mL離心管中,并置于干冰上30 min。隨后15 000×g4 ℃離心15 min。將含有細胞代謝物的上清液轉移至干凈的1.5 mL離心管中。使用400 mL預冷的 80% HPLC 級甲醇重復提取代謝物。使用氮氣流蒸發器在37 ℃下干燥水相。將蛋白質沉淀重懸于100 mL 1% SDS 緩沖液中進行 BCA 測定。使用三重四極桿LC/MS系統分析提取物。

1.2.5 誘導脂肪細胞分化:轉染NADPH 24 h后,根據標準方案將3T3L1前脂肪細胞誘導為脂肪細胞。去除轉染培養基,加入含有500 μmol/L IBMX、1 μmol/L 地塞米松、1 μmol/L 羅格列酮、1 μg/mL 胰島素和10% FBS 的DMEM 誘導培養基,誘導脂肪細胞分化。誘導培養基每2 d更換一次。4 d后,將誘導培養基更換為含有1 μg/mL胰島素的DMEM(含10% FBS)維持培養基,再培養1 d。然后將細胞在含有10% FBS的正常DMEM培養基中再培養1 d,然后進行實驗分析。

1.2.6 油紅O染色:用PBS洗滌3T3L1細胞,并用4% 多聚甲醛在室溫下固定30 min。然后用ddH2O短暫洗滌細胞3次,用70% 異丙醇洗滌1次。將細胞在油紅O工作溶液中于室溫下孵育10～30 min。棄去油紅O工作液,用ddH2O短暫沖洗細胞4次,直至拍照。然后通過添加異丙醇溶解油紅O,并在450 nm處測量脂質含量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 X-tremeGENE可以將NADPH轉染進入細胞

實驗使用這3種不同的轉染試劑(X-tremeGENE、RNAiMAX和Lipo2000)配制NADPH轉染試劑復合物,并在細胞轉染24 h后檢測細胞內NADPH水平。 結果發現使用X-tremeGENE轉染NADPH可有效提高U2OS和3T3L1細胞內NADPH水平,而用RNAiMAX或Lipo2000 轉染試劑轉染則不會(圖1A,B)。此外,根據細胞體積測量了細胞內NADPH的濃度,用X-tremeGENE轉染NADPH增加了U2OS和3T3L1細胞中 NADPH的濃度(圖1C)。為了進一步驗證該方法的有效性,采用液相色譜-質譜法(liquid chromatography-mass spectrometry,LC-MS)測量了細胞內NADPH的含量。與之前的結果一致,用X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑轉染NADPH確實有效增加了細胞內NADPH含量(圖1D)。

A, B.U2OS (A) and 3T3L1 (B) preadipocytes were transfected with NADPH (10 μmol/L) using X-tremeGENE, RNAiMAX or Lipo2000; Cellular NADPH was determined by NADPH Quantitation Fluorometric Assay Kit; C.U2OS and 3T3L1 preadipocytes were transfected with NADPH (10 μmol/L) using X-tremeGENE.NADPH was determined by NADPH Quantitation Fluorometric Assay Kit, and NADPH concentration in cell was calculated by cell volume; D.3T3L1preadipocytes were transfected with NADPH (10 μmol/L) using X-tremeGENE.NADPH was determined by LC-MS; *P<0.001 compared with 0 μmol/L NADPH.

2.2 細胞中NADPH水平隨NADPH轉染量增加呈劑量依賴性增加

使用X-tremeGENE將不同濃度的NADPH轉染到U2OS和3T3L1細胞中。轉染后24 h后發現,隨著轉染NADPH劑量的增加,細胞中的NADPH水平呈劑量依賴性增加(圖2A)。在3T3-L1細胞中觀察到相同的結果(圖2B),證明使用X-tremeGENE將NADPH轉染到細胞中是可靠且有效的。

A, B.U2OS and 3T3L1 preadipocytes were transfected using X-tremeGENE with increasing amounts of NADPH as indicated for 24 h; cellular NADPH levels were determined.

2.3 轉染后24 h內細胞中NADPH水平隨時間逐漸升高

細胞中的NADPH水平是動態的,在轉染后的不同時間點(0、3、6、12、24、48和72 h)測量細胞內NADPH水平。結果發現,用X-tremeGENE轉染NADPH后,細胞內NADPH水平隨著時間逐漸升高,并在12～24 h達到峰值,然后下降(圖3A,B)。

A, B.U2OS and 3T3L1 preadipocytes were transfected with 10 μmol/L NADPH using X-tremeGENE.Cellular NADPH levels were determined at different time points after transfection.

2.4 轉染的NADPH可增加脂肪細胞分化和脂質合成

使用3種轉染試劑分別將NADPH轉染到3T3L1前脂肪細胞中24 h后,誘導3T3L1前脂肪細胞分化為脂肪細胞。油紅O染色顯示,使用 X-tremeGENE轉染NADPH的細胞比對照細胞含有更多的脂質(圖4A)。與對照相比,使用 RNAiMAX/Lipo2000試劑轉染NADPH的細胞中脂質含量沒有增加(圖4A),這與它們不增加細胞內NADPH含量的結果一致(圖1B)。然后添加異丙醇以溶解油紅O,并在510 nm處測量吸光度A(值)以量化脂質含量。同樣,用X-tremeGENE轉染 NADPH可有效增加分化的3T3-L1細胞中的脂質積累(圖4B)。而因為 RNAiMAX和Lipo2000都無法將NADPH 轉染進入細胞,因此細胞內脂質積累沒有變化(圖4B)。

A.3T3L1 preadipocytes were transfected with 10 μmol/L NADPH using different transfection reagents as indicated for 24 h, then stimulated to differentiate into adipocytes, after induction for 7 d, cells were fixed and stained with Oil Red O; B.images were shown,Oil Red O staining was quantified; *P<0.001 compared with 0 μmol/L NADPH.

3 討論

為了探究NADPH的功能,可改變細胞中NADPH的水平來研究相應的表型,一般采用降低或者過表達產生NAPDH的代謝酶來改變細胞中NADPH水平。然而,代謝酶除產生NADPH之外還有其他功能,因此直接調控細胞內NADPH水平是研究NADPH功能的關鍵。由于NADPH不能穿過細胞膜[6],為此需找到一種將外源NADPH直接轉染到細胞中的有效方法。本實驗,通過使用3種轉染試劑(X-tremeGENE、RNAiMAX和Lipo2000)發現只有X-tremeGENE可以有效地將NADPH轉染到細胞中。同時,實驗室之前的研究發現,使用X-tremeGENE轉染NADPH,并不影響NADPH生成酶(MEs、G6PD)的表達[5]。但由于利益沖突,試劑公司僅告知轉染試劑(X-tremeGENE)是脂質混合物,其他具體信息無法提供。一般來說,這些陽離子脂質體傳遞底物的潛在機制可能取決于它們的生物學性質,例如,頭基的組成和方向、烷基鏈的長度及其飽和度、連接疏水錨點和陽離子頭基的連接基團的性質,以及“輔助”脂質的組成,這些脂質是中性帶電的脂質,均有助于轉染過程[12]。已知上述所有參數都可能會影響轉染活性,并可解釋NADPH能夠有效轉染的機制。關于Lipo2000和RNAiMAX,目前只知道它們是基于脂質的轉染試劑。由于這3種試劑都是以脂質為基礎的,而只有X-tremeGENE能夠將NADPH轉移到細胞中,可能是由于轉染試劑中的其他特定成分所致,而脂質化學結構的多樣化和復雜性也可能是另一個促成因素[13-14]。雖然還不知道其確切原因,但實驗結果表明,X-tremeGENE HP DNA 轉染試劑確實可以成功地將外源NADPH轉染進入細胞內,并且通過該方法增加的細胞內NADPH具有功能性,能夠促進3T3L1脂肪細胞的分化和脂質積累,進一步說明了該方法的有效性。該方法簡單方便,為進一步研究NADPH在細胞中的功能提供了理論依據。