小鼠卵母細胞減數分裂中心粒蛋白SAS-6的表達和亞細胞分布

宋 可，宋 柯，李靜宇，馬 偉*，楊曉葵*

1.首都醫科大學附屬北京婦產醫院/北京婦幼保健院 生殖醫學科，北京 100026；2.首都醫科大學 基礎醫學院 組織學與胚胎學教研室，北京 100069

卵母細胞減數分裂(oocyte meiosis)是哺乳動物產生單倍體配子的重要生理過程。減數分裂異常導致的配子發生障礙或質量低下是引發不孕不育的重要原因。在卵母細胞減數分裂成熟過程中,紡錘體牽引染色體運動和分離。因此,紡錘體的正確組裝對于染色體的精確分離具有重要意義。在哺乳動物卵子發生早期中心粒就退化了,卵母細胞內缺乏中心體結構,減數分裂紡錘體的形成有賴于與中心體發揮相似功能的無中心粒微管組織中心 (microtubule organizing centers, MTOCs)[1]。MTOCs是由結構蛋白質、微管釋放蛋白質和調節蛋白質構成的。其中結構蛋白質包括Pericentrin和Cep192等,它們發揮腳手架功能,形成其他蛋白質錨定的平臺。微管成核蛋白質主要是γ-tubulin,能夠催化α,β-tubulin二聚體聚合成微管。調節蛋白質主要包括某些蛋白激酶,如aurora-A等,在減數分裂恢復時加入MTOCs,調節其功能成熟[2]。卵母細胞內紡錘體在形成后立即向皮質區遷移,由此實現胞質分裂的非對稱性,保證形成體積極大的卵子和極小的極體,以使卵子盡可能地保留母源的信息和營養物質。紡錘體的遷移依賴于胞質中動態的F-actin網絡,其機動性取決于囊泡外向型輸送及其與細胞膜之間的融合[3]。

紡錘體異常組裝蛋白6(spindle assembly abnor-mal protein 6, SAS-6)是體細胞內中心粒的核心構建蛋白,它是由N端球形結構域,一段卷曲的結構域和C端構成的。SAS-6通過螺旋卷曲的方式形成二聚體結構[4],并進一步寡聚化,有助于中心粒的組裝[5-6]。有研究發現人類SAS-6(human SAS-6, HsSAS-6)通過與γ-微管蛋白環復合物(γ-tubulin ring complex, γ-TuRC)相互作用,在微管的形成中起著至關重要的作用[7]。研究[8]發現骨肉瘤細胞系U2OS中siRNA介導的HsSAS-6的失活消除了使用阿非迪霉素(aphidicolin)處理后中心體的過度復制,并干擾了正常的中心體復制周期,表明SAS-6對于中心體的形成發揮了關鍵作用,但其潛在的影響機制尚未完全闡明。

本文研究了SAS-6在體細胞和小鼠卵母細胞中的亞細胞定位及其與中心體、MTOCs和囊泡之間的關系,為進一步探究其功能和潛在作用機制奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

本實驗使用21日齡SPF級雄性C57BL/6與雌性BALB/C雜交所生產的F1代小鼠,記為CB6F1[北京維通利華實驗動物技術有限公司,許可證編號為SCXK(京)2012-0001];中國倉鼠卵巢細胞系 (Chinese hamster ovary cell, CHO);MEM Alpha(1×)(Gibco公司);MEM(1×)+ GlutaMAX TM-Ⅰ(Gibco公司);兔抗SAS-6抗體(Genetex公司);鼠抗中心粒周圍蛋白Pericentrin(BD公司);鼠抗高爾基體基質蛋白GM130(BD公司);注射用血促性腺激素(pregnant mare serum gonadotropin, PMSG)(寧波第二激素廠);米力農milrinone(Selleck公司);牛血清白蛋白(bovine serum albumin, BSA)(中國北京索萊寶科技有限公司);正常山羊血清(normal goat serum, NGS)(Sigma-Aldrich公司);含4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole, DAPI)封片劑(Vector Lab公司);PVP粉末(Sigma-Aldrich公司);細胞裂解液(Laemmli buffer)(Bio-Rad公司);蛋白酶抑制劑(protease inhibitor cocktail)(Bio-Rad公司);PAGE凝膠快速制備試劑盒(中國雅酶公司);PVDF膜(Millipore公司);Super ECL plus蛋白質印跡超敏發光液(中國南京諾唯贊生物科技有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 小鼠卵母細胞收集和體外培養:首先向出生3周的雌性CB6F1小鼠給予腹腔注射10 UI的PMSG進行超促排卵,在44～48 h后處死小鼠,使用低速二氧化碳窒息法以減輕小鼠的痛苦。隨后戳破卵泡,釋放卵丘-卵母細胞復合體(cumulus-oocyte complex, COC),將釋放出的COC收集到另一個37 ℃提前預熱的HEPES緩沖液中,后轉移至MEM(minimum essential medium)培養基中。于體外培養0、2、8和16小時,分別對應減數分裂過程中的幾個關鍵時期進行收樣。

1.2.2蛋白質免疫印跡(Western blot):每組樣本收集50個卵母細胞,在預熱的PVP溶液中瞬洗3次后,將其加入含有蛋白酶抑制劑的細胞裂解液中,在水浴鍋中100 ℃煮10 min,之后用聚丙烯酰胺凝膠SDS-PAGE電泳進行分離,得到的蛋白凝膠轉移至甲醇激活的PVDF膜上。隨后室溫下使用脫脂牛奶封閉膜1 h,將PVDF膜浸泡在一抗稀釋液中,4 ℃旋轉孵育過夜,使用1×TBST漂洗后再浸泡于相應的二抗中,室溫下孵育1 h,用1×TBST漂洗干凈,最后按照1∶1的比例配制發光液進行曝光。抗體主要包括:兔抗SAS-6(1∶1 000);兔抗GAPDH(1∶5 000);辣根酶標記山羊抗兔IgG(1∶5 000)。

1.2.3免疫熒光染色(immunofluorecent staining, IF):將培養至相應時期的卵母細胞放入提前配制的1% paraformaldehyde + 0.5% Triton X-100中固定滲透45 min,使用0.2% PBST漂洗3次,每次5 min,隨后室溫下在含10%山羊血清中封閉1 h,于96孔板中用封閉液稀釋一抗,細胞在稀釋的一抗液中4 ℃孵育過夜。0.2% PBST漂洗細胞3次,每次15 min,之后使用相應標記的二抗室溫下避光孵育1 h,再用0.2% PBST漂洗細胞3次,每次15 min,漂洗干凈后轉移至蓋玻片上,最后按照1∶1的比例用含DAPI的封片劑封片。得到的樣品用熒光顯微鏡觀察并分析有絲分裂和減數分裂各階段中SAS-6和Pericentrin的時空分布相關性,以及MⅠ期SAS-6與囊泡標志物GM130的定位關系。抗體主要包括: 兔抗SAS-6(1∶100),小鼠抗Pericentrin(1∶3 000)和小鼠抗GM130(1∶100)。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 SAS-6在小鼠卵母細胞減數分裂過程中的蛋白表達水平

Western blot結果顯示SAS-6在小鼠卵母細胞減數分裂生發泡期(germinal vesicle, GV)、生發泡破裂期(germinal vesicle breakdown, GVBD)、第1次減數分裂中期(metaphase Ⅰ, MⅠ)和第2次減數分裂中期(metaphase Ⅱ, MⅡ)均穩定高表達,且表達量差異無統計學意義(圖1),這表明SAS-6在減數分裂中可能發揮相關作用。

Western blot showed that SAS-6 was stably expressed at all stages of oocyte meiosis; Each sample contained 50 oocytes.

2.2 SAS-6在體細胞有絲分裂中的亞細胞定位(圖2)及其與Pericentrin的相關性分析

免疫熒光分析顯示在體細胞有絲分裂間期,團狀的染色質周圍出現了SAS-6的紅色信號,并且空間上與中心粒周圍蛋白Pericentrin共定位(圖2d);在分裂前期染色質逐漸縮短變粗,形成棒狀染色體,兩個中心體也逐漸分開移向相對的兩極,此時SAS-6依然分布于Pericentrin標記的中心體上(圖2h);隨著有絲分裂進展至中期,每條染色體的著絲點都排列在細胞中央的一個平面上,即赤道板(圖2i),SAS-6和 Pericentrin同時高度聚集,呈點狀分布于染色體排列區域的兩側,即紡錘體的兩極(圖2l);直至有絲分裂后期,姐妹染色單體發生分離,SAS-6和 Pericentrin的信號仍舊保持高度重疊(圖2p)。SAS-6和 Pericentrin在體細胞中心體的這種共定位模式提示SAS-6極有可能參與中心體的組裝過程。

Blue showed DNA, green showed pericentrin, red showed SAS-6 and yellow showed the superposition of SAS-6 and pericentrin signals; Arrows showed pericentrin, SAS-6 and their co-location signals; IF showed that SAS-6(g,k,o, arrow) and pericentrin(f,j,n, arrow) always showed co-localization characteristics(d,h,i,p, arrow) during somatic cell (CHO) mitosis; GV.germinal vesicle; GVBD.germinal vesicle breakdown; MⅠ.metaphase Ⅰ; TⅠ.telophase Ⅰ; MⅡ.metaphase Ⅱ.

2.3 SAS-6在卵母細胞減數分裂中的亞細胞定位(圖3)及其與GM130陽性囊泡的相關性分析

結果顯示在減數分裂GV期,MTOC外周蛋白質形成點狀結構,此時SAS-6并不與Pericentrin存在空間關聯性(圖3Ad),而是呈現不規則的點片狀分布于一個廣泛的區域(圖3Ac);在減數分裂GVBD期,染色質凝集,Pericentrin離開生發泡,并在染色體周圍由單一點狀裂解為擴大的片狀聚集(圖3Af),而SAS-6呈現散在的點狀囊泡樣結構分布于胞質內(圖3Ag),此時SAS-6與Pericentrin不存在相似的空間定位;隨著進展至MⅠ期所有染色體整齊排列在赤道板上,Pericentrin聚集形成MTOCs兩極,然而SAS-6還是呈點狀散在彌漫分布于整個胞質,并不與Pericentrin的信號重合(圖3Al);同樣的,在第1次減數分裂末期(telophase Ⅰ, TⅠ),Pericentrin逐漸向兩極分離,SAS-6與Pericentrin依然沒有共定位(圖3Ap);直至MⅡ期,第一極體排出(圖3Aq),SAS-6與Pericentrin的分布也并無關聯,提示在減數分裂過程中,SAS-6與MTOCs沒有相關性。

A.immunofluorescence staining(IF) of SAS-6 and pericentrin during GV, GVBD, MⅠ, TⅠ and MⅡ phases in mouse oocyte meiosis; B.immunofluorescence staining of SAS-6 and GM130-positive vesicles in MⅠ phase of mouse oocyte meiosis; a, b showed DNA was labeled in blue, GM130 or pericentrin in green, SAS-6 in red, and the superposition of SAS-6 and GM130 signals in yellow; IF showed that SAS-6 appeared different scales of dotted aggregation-vesicles (Ac,g,k,o,s; Bc, arrow), and the Golgi matrix protein GM130 showed tight colocalization characteristics (Bb-d, arrow), SAS-6 and microtubule organizing centers(MTOCs) protein pericentrin (Ab,f,j,n,r, arrow) did not coincide; Aq.the arrow was shown as the first polar body (1st PBD); GV.germinal vesicle; GVBD.germinal vesicle breakdown; MⅠ.metaphase Ⅰ; TⅠ.telophase Ⅰ; MⅡ.metaphase Ⅱ.

由于SAS-6呈現出不同規模的點片狀聚集,因此針對MⅠ期卵母細胞進行了SAS-6與囊泡標志物GM130的免疫熒光染色實驗,結果如圖3B顯示,SAS-6的熒光信號與GM130陽性囊泡完全重合,表明與體細胞不同,SAS-6沒有聚集于Pericentrin陽性的MTOCs上,而是聚集在GM130陽性的囊泡中,提示該分子可能通過調節囊泡而參與紡錘體的趨皮質區遷移。

3 討論

SAS-6作為一種中心粒生物發生早期支架的車輪組裝的中心蛋白,新生中心粒是車輪結構,由堆疊的9層對稱SAS-6環狀聚合物組成[9],SAS-6參與調節體細胞有絲分裂進程中中心粒的生物發生、中心體的復制和組裝等多個事件[10-11],其活性異常或表達缺失會直接損害中心體的結構形成和復制周期。研究證實在大多數細胞中,缺乏SAS-6蛋白會導致中心粒形成失敗。在衣單胞菌和果蠅中,失活突變SAS-6蛋白表現出有缺陷的中心粒和異常數量的三重微管[12]。在哺乳動物卵子發生的早期中心粒退化,卵母細胞內沒有中心粒也不組裝成典型的中心體結構,而中心粒的結構成分在卵母細胞中的存在形式和功能一直是未解之謎。本研究發現在小鼠卵母細胞中SAS-6均衡表達于減數分裂的各個階段,說明SAS-6仍舊存在于卵母細胞中。SAS-6在體細胞有絲分裂過程中聚集在中心體,即與Pericentrin共定位,而該蛋白在卵母細胞減數分裂過程中并沒有定位于MTOCs,而是聚集在胞質中的囊泡上。據報道,Rab蛋白在囊泡運輸中發揮關鍵的調節作用,Rab11a陽性囊泡可以驅動小鼠卵母細胞中肌動蛋白網絡動力學,促進不對稱的紡錘體定位,以保證卵母細胞完成不對稱分裂[13]。也有研究證實了Rab8a調控肌動蛋白絲組裝的ROCK/LIMK通路,進而影響了卵母細胞減數分裂過程中高爾基體分布相關的GM130的募集、紡錘體的遷移和極體擠壓[14]。這些研究均表明紡錘體的趨皮質區遷移與囊泡的功能和作用密切相關。

本研究中SAS-6的這種分布定位提示其在卵母細胞內的主要功能并不是參與MTOCs調節的紡錘體組裝,而是可能通過調節囊泡的形態或機動性而參與F-actin所驅動的紡錘體趨皮質區遷移過程。本研究初步涉及SAS-6在小鼠卵母細胞中的亞細胞定位模式及其與GM130陽性囊泡的相關性,SAS-6影響紡錘體遷移的具體機制尚需深入研究,從而為認識卵母細胞減數分裂成熟質量的確保機制,以及提高卵母細胞質量提供新的證據。