2例中國原發性纖毛運動障礙患者致病變異的鑒定

鄭海霞，周王繼，田欣倫*，劉雅萍

1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 麥庫西克-張孝騫協和遺傳醫學中心疑難重癥及罕見病國家重點實驗室，北京 100005；中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院2.呼吸與危重癥醫學科 疑難重癥及罕見病國家重點實驗室；3.臨床醫學研究所，北京 100730

原發性纖毛運動障礙(primary ciliary dyskinesia,PCD)是一種罕見的遺傳病,主要呈常染色隱性遺傳,少數呈X連鎖隱性遺傳,其發病率因地域、人種及數據來源不同差異較大,全球范圍內約為1/1萬～1/4萬[1-2],然而在中國尚缺乏準確的統計和報道。由于漏診率較高,實際發病率可能高于文獻報道。PCD是由動纖毛結構或功能異常引起的疾病,涉及多個器官和系統,導致包括慢性呼吸道感染、生育問題等一系列臨床癥狀[3]。此外,約50%的PCD 患者可能伴有內臟反位,被稱為Kartagener 綜合征。PCD的診斷標準目前尚不統一,臨床上常采用鼻呼出一氧化氮(nasal nitric oxide, nNO)水平檢測、高速視頻顯微鏡分析(high-speed video microscopy analysis, HSVA)、透射電鏡(transmission electron microscope, TEM)觀察和基因檢測進行綜合診斷[4]。PCD具有遺傳異質性,目前已發現50多個致病基因,但仍有約25%的患者未找到其致病基因[5]。

本研究采用臨床表型分析、全外顯子組測序技術(whole exome sequencing, WES)、Sanger測序以及生物信息學分析等多種方法,對2例PCD患者的病因學展開研究,目的在于為該病的基因診斷、遺傳咨詢和精準治療提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象

患者1,女,37歲,曾有新生兒呼吸窘迫,自幼反復呼吸道感染。

患者2,男,32歲,10余年來反復咳嗽。

2例患者于2022年至2023年在北京協和醫院呼吸內科門診就診。在告知患者及其家屬知情同意書內容后,所有成員均簽署知情同意書。咨詢并記錄患者病史及家族史,進行相關臨床資料收集。該研究獲得中國醫學科學院北京協和醫院倫理審查委員會的審查批準(I-24PJ0444)。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本DNA的提取:使用EDTA抗凝管采集患者外周靜脈血2 mL,用QIAamp全血細胞DNA提取試劑盒(Qiagen公司)按照說明書中描述的標準方法提取基因組DNA(gDNA)。

1.2.2 全外顯子組測序檢測與致病變異篩選:取2 μg患者gDNA委托給諾禾致源生物科技有限公司,進行全外顯子組測序和注釋工作。使用ANNOVAR進行變異注釋,包括千人基因組計劃、ExAC數據庫、gnomAD數據庫、 dbSNP數據庫等注釋信息,注釋包括變異位置、等位基因頻率、變異保守性預測和致病性預測等。致病變異篩選參照以下策略:1)符合常染色體隱性或X染色體隱性遺傳的遺傳模式;2)最小等位基因頻率≤0.01;3)位于基因編碼區或可能影響剪接的位點;4)生物信息學軟件預測致病性。

1.2.3 Sanger測序驗證:應用Sanger測序對候選變異進行進一步驗證。從University of California Santa Cruz(UCSC)基因組瀏覽器(https://genome.ucsc.edu/)獲取基因序列,使用Primer3在變異位點附近設計引物,由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。對患者DNA樣本和正常對照樣本進行PCR擴增,擴增產物由北京諾賽基因組研究中心有限公司進行Sanger測序。

1.2.4 變異致病性的分析:參考人類基因突變數據庫(The Human Gene Mutation Database,HGMD)數據庫和相關文獻的研究結果,根據美國醫學遺傳學與基因組學學會(The American College of Medical Genetics and Genomics,ACMG)指南對候選變異位點進行致病性評估。利用Varcards網站(http://www.genemed.tech/varcards/)得到多個軟件對候選變異的致病性預測(REVEL、CADD和MutationTaster等)、變異在千人基因組、ExAC及gnomAD等多個人群數據庫中的頻率。綜合人群頻率、預測致病性結果、家系共分離等證據,利用Intervar網站(https://wintervar.wglab.org/),將這些分析結果結合起來確定變異的致病性。

利用Ensembl網站(https://asia.ensembl.org/index.htmll),得到基因結構圖。利用UCSC基因組瀏覽器對基因變異位點的保守性進行預測。

2 結果

2.1 臨床表型

患者1,女,37歲,曾有新生兒呼吸窘迫,自幼反復呼吸道感染,有內臟轉位,右中葉、左舌段和雙下葉支氣管擴張伴感染(圖1左),nNO濃度均值為5 ppb(parts per billion),低于125 ppb的臨界值,被診斷為Kartagener 綜合征?；颊卟辉?試管嬰兒孕育子女,子女體健。家族史:父母近親結婚,姐姐弟弟體健。

圖1 2例患者的支氣管擴張表型Fig1 Phenotype diagrams of the two probands with bronchiectasis

患者2,男,32歲,10余年來反復咳嗽、咯黃痰,雙肺彌漫支氣管擴張合并感染(圖1右),nNO均值為10 ppb,低于125 ppb的臨界值。不育2年。家族史:否認父母近親結婚史,姐姐體健。

2.2 全外顯子組測序分析與Sanger測序驗證

分析全外顯子組測序結果,并進行變異篩選,發現2例患者分別攜帶外動蛋白臂對接復合物亞基1(outer dynein arm docking complex subunit 1, ODAD1)(NM_144577)基因純合變異和動力蛋白軸絲組裝因子6(dynein axonemal assembly factor 6,DNAAF6)(NM_173494)半合子變異?；颊?攜帶ODAD1:c.702_705dupGCAG (p.P236Afs*11),患者2攜帶DNAAF6: c.532_533delCT (p.L178Sfs*2),這2個變異均未在千人基因組、ExAC及gnomAD等公共數據庫中收錄,且在HGMD未見報道。Sanger測序結果表明全外顯子組測序結果無誤(圖2)。

圖2 2例患者與正常對照的ODAD1和DNAAF6變異位點測序圖

2.3 變異致病性預測分析結果

在兩例PCD患者中檢出2個未被報道過的致病變異,均為移碼變異。ODAD1:c.702_705dupGCAG(p.P236Afs*11)在第7號外顯子插入了4個堿基后發生移碼,在繼續編碼11個變異的氨基酸后產生提前終止密碼子,導致蛋白產物缺失下游約2/3的序列(圖3A)。DNAAF6: c.532_533delCT(p.L178Sfs*2)在第7號外顯子上缺失了2個堿基后發生移碼,提前產生終止密碼子,影響了下游保守序列(圖3B)。根據ACMG指南并結合文獻提供的致病性判定依據進一步確認了2個新變異的致病性(表1),合并上述分級證據判定這2個新變異均為致病變異。

表1 2例患者變異致病性判定Table 1 Pathogenicity determination of the variants in 2 patients with PCD

Red arrows indicated the location of the pathogenic variant identified in two patients, respectively, amino acid coding diagram from health control and two patients and conservation of the variant sites of ODAD1 gene and DNAAF6 gene (red rectangles indicated the first codon affected by the frameshift variant).

3 討論

PCD是一種罕見的常染色體隱性或X染色體連鎖隱性遺傳病,其致病機制主要涉及動纖毛的結構和功能缺陷。從1999年發現DNAI1基因突變開始[6],已經有超過50個PCD致病基因相繼被發現,這凸顯了PCD的遺傳異質性[5]。絕大部分PCD致病基因是動纖毛“9+2”微管結構的組成成分或與其運輸、組裝、調節相關的基因。動纖毛分布在呼吸道上皮、大腦室管膜和輸卵管壁等部位。此外精子鞭毛也與動纖毛類似,它們都具有“9+2”微管結構:外側的9組二聯體微管環繞2個中央微管(central pair,CP)。中央微管與外周微管之間通過徑向輻條(radial spokes,RS)連接,相鄰的二聯體微管通過微管連接蛋白(nexin dynein regulatory complexes,N-DRC)連接。此外,外周微管上還對接內動力臂(inner dynein arms,IDA)、外動力臂(outer dynein arms,ODA) 控制纖毛擺動頻率和彎曲幅度[3-7]。

本研究涉及的2個基因均與ODA的組裝相關。ODA通過動力蛋白錨定復合體(outer dynein arm docking complexes,ODA-DCs)錨定在外周微管上。ODA到達錨定位置前,需要動力蛋白軸絲組裝因子(dynein axonemal assembly factors,DNAAF)招募熱休克蛋白90(HSP90),輔助ODA與ODA-DCs的預組裝。DNAAF1、DNAAF2和DNAAF3預組裝ODA重鏈,DNAAF5和DNAAF6預組裝ODA中鏈,LRRC6預組裝遠端纖毛ODA。

ODAD1(outer dynein arm docking complex subunit 1)基因編碼外動力臂對接復合體亞基,其缺乏會導致外動力蛋白臂(ODA)無法正確組裝到微管雙聯體。ODAD1基因全長23.62 kb,包含14個外顯子,編碼670個氨基酸[8]。ODAD1基因突變通常導致ODA缺失,纖毛幾乎完全不動,并導致典型的PCD臨床表型,包括新生兒呼吸窘迫、nNO水平低、鼻竇炎、中耳炎、支氣管擴張和內臟轉位等[9]?；颊?的ODAD1:c.702_705dupGCAG (p.P236Afs*11)移碼突變引起閱讀框改變從而導致提前終止密碼子產生,可能引起無義介導的mRNA降解,或產生截短蛋白質,導致蛋白質產物無法行使正常的功能,引起患者的PCD表型。

DNAAF6(dynein axonemal assembly factor 6)基因編碼動力蛋白軸絲組裝因子,在ODA和IDA的胞質預組裝中起關鍵作用,這些蛋白隨后通過鞭毛內運輸(IFT)運輸到纖毛或鞭毛軸絲。DNAAF6基因全長37.64 kb,包含7個外顯子,編碼214個氨基酸。DNAAF6基因突變導致ODA和IDA的缺失,影響呼吸道纖毛和精子鞭毛的運動能力[10]。DNAAF6基因突變通常導致患者出現典型的PCD表型,如慢性鼻竇炎、慢性中耳炎、慢性下呼吸道感染、支氣管擴張以及nNO水平低和內臟轉位等。此外,男性患者常常表現出不育的表型,精子活動能力差[11]。患者2的DNAAF6: c.532_533delCT (p.L178Sfs*2)移碼突變導致提前終止密碼子,可能引起無義介導的mRNA降解,導致蛋白產物無法行使正常的功能,引起患者的PCD表型。卵胞漿內單精子顯微注射技術(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)是目前PCD男性患者不育時夫妻受孕的唯一途徑。有研究表明,中國目前已有攜帶DNAAF6變異患者通過ICSI成功生育[12],表明 ICSI 對于有生育意向的DNAAF6突變患者來說可能是一個不錯的選擇。

本研究在2例散發的PCD患者中分別檢出已知致病基因ODAD1和DNAAF6的移碼突變。2個變異均未被HGMD收錄,且根據ACMG指南被判定為致病變異,支持其PCD診斷。以上結果豐富了ODAD1基因和DNAAF6基因的突變譜,有助于提高PCD的診斷率,并為PCD患者的精準治療提供新靶點。