BM-MSCs延緩CD8+初始T細胞衰老

高競溪，趙曉妍，朱星雨，孫 昭，韓 欽*，趙春華*

1.中國醫學科學院基礎醫學研究所 北京協和醫學院基礎學院 中國醫學科學院組織工程研究中心，北京 100005；2.中國醫學科學院 北京協和醫學院 北京協和醫院 腫瘤內科，北京 100730

隨著年齡的增長,外部與內部壓力的累積導致人體的生理完整性(physiological integrity)逐漸受損,同時組織從壓力中恢復的能力日漸衰弱,致使機體功能受損和死亡風險的增加。臨床數據表明,老年人自身免疫疾病、感染、腫瘤等發病率的上升與免疫系統老化具有密切聯系[1-2]。免疫系統功能減弱導致衰老細胞無法即時被清除,便會利用衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)幫助衰老細胞對抗免疫系統的清除,導致衰老細胞積累,加速機體衰老[3-4]。免疫早衰模型小鼠的各器官呈現衰老相關損傷并伴隨機體早衰及壽命縮短,而補充年輕的免疫細胞可以減緩衰老進程[5-6],證明免疫細胞的衰老及功能減退在機體衰老過程中扮演重要的角色。

T細胞老化可能是“免疫衰老”的主要表現之一,即免疫系統活力的時間依賴性喪失,損害了有害元素(如微生物或惡性細胞)的清除[7],同時增加了導致炎癥和自身免疫疾病等不必要的過度反應。探究免疫細胞,特別是T細胞的衰老過程及其機制,是緩解與衰老相關的免疫失衡和應激信號反應能力喪失的重要途徑。T 淋巴細胞的年齡依賴性變化,主要包括初始細胞的免疫多樣性下降和衰老T細胞數量的增加等[8]。

前期研究表明,移植年輕來源的骨髓間充質干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)可以下調衰老小鼠的衰老標志物表達和SASP的分泌,緩解胸腺、脾臟、卵巢等組織的衰老,延長小鼠[9]和大鼠[10]的健康壽命。但是,關于MSCs延緩細胞、組織衰老的探索較為宏觀,其中關鍵細胞類型變化的研究尚存在較多空缺。因此,本文擬驗證BM-MSCs緩解免疫衰老的作用,并探究其主要改善的免疫細胞群體。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑:抗CD28抗體、抗CD3抗體和IL-2(北京科昕生物科技有限公司);RPMI-1640(北京協和細胞資源中心);胎牛血清(Gibco公司);LIVE/DEADTM可固定近紅外死細胞染色劑試劑盒、eBioscienceTM流式胞內固定破膜緩沖液(Thermo Fisher Scientific公司);CD3-PerCP/Cyanine5.5、CD45-PE、CD62L-PE/Cyanine7、CD44-Brilliant Violet 510(BioLegend公司);CD8α-APC、CD4-APC(Cell Signaling Technology公司); p16INK4a抗體、p21Cip1抗體(Abcam公司);山羊抗兔熒光二抗(金普來生物科技有限公司);40 μm細胞過濾器(BD Falcon公司)。

1.1.2 小鼠:6周齡,SPF級,野生型C57BL/6(H-2b)小鼠(北京維通利華實驗動物科技有限公司)。所有動物均飼養在特定無病原體設施的隔離籠中。所有程序和方案均經動物研究所實驗動物使用與管理委員會批準。

1.2 方法

1.2.1 細胞分離與培養:從6周齡C57小鼠的后腿分離BM-MSCs,具體提取與培養方法參見文獻[11]。

1.2.2 構建體外復制性衰老模型:從6周齡C57小鼠的脾臟分離脾淋巴細胞,以2×106個細胞每孔接種于24孔板中,以anti-CD28(2.5 μg/mL)、anti-CD3(1 μg/mL)、IL-2(100 U/mL)刺激增殖7 d。

1.2.3 小鼠脾臟細胞與BM-MSCs共培養:絲裂霉素(10 mg/mL)2小時預處理BM-MSCs抑制其增殖,以2×105個細胞每孔接種于24孔板中,過夜貼壁,脾淋巴細胞以2×106個每孔接種于BM-MSCs預鋪孔中。

1.2.4 流式細胞測量術檢測細胞衰老表型:以1 mL PBS重懸細胞,PBS洗滌2次;用LIVE/DEAD-APC-Cy7染色,4 ℃孵育30 min,洗滌2次;用CD45-PE、CD3-PC5.5、CD8-APC、CD44-Bv510、CD62L-PE-Cy7抗體混合染色,4 ℃孵育30 min,洗滌2次;分別用固定緩沖液和滲透緩沖液4 ℃孵育10 min,加入p16/p21抗體,4 ℃孵育40 min,洗滌3次;加入熒光二抗,4 ℃孵育40 min,洗滌3次。樣品通過40 μm細胞過濾器,使用Cytoflex流式細胞儀分析,FlowJo軟件分析數據。

A.senescence marker expression in young splenic lymphocytes and replicative senescence model constructed after 7 days of stimulated proliferation in vitro; B.gating strategy for mouse splenic T cells; C.flow cytometry analysis of splenic T cells (CD45+CD3+) in young-Ctrl and aging-Ctrl;*P<0.05, **P<0.001 compared with young-Ctrl.

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 體外復制性衰老細胞模型的構建

分離原代小鼠脾臟細胞,體外用CD3抗體刺激T細胞增殖,持續刺激7d,構建復制性衰老細胞模型。持續刺激7 d進行qPCR定量分析,結果顯示相比于年輕對照,衰老模型的典型衰老標記(p16、p21)、衰老相關分泌表型(senescence-associated secretory phenotype, SASP)(IL6、IL8)和炎性衰老標記(Granzyme K,GZMK)上調,T細胞功能相關的CD28下調,指示T細胞呈現衰老表型且功能受損。進一步流式細胞測量術揭示, CD45+CD3+T淋巴細胞(圖1A)p16、p21高表達的衰老細胞分別占33.22%±3.9%和41.78%±2.3%,顯著高于年輕對照組的8.37%±1.7%和3.04%±0.4%(圖1B,C)。因此后續實驗以刺激1d的細胞為年輕對照(young-Ctrl),持續刺激7 d的細胞為衰老對照(aging-Ctrl)。

2.2 CD8+T細胞衰老更顯著

進一步探究T細胞不同群體的復制性衰老表型,在T細胞的基礎上采用流式細胞測量術劃分CD4+T細胞(CD3+CD4+)和CD8+T細胞(CD3+CD8+)(圖2A),分別檢測p16、p21的表達情況。結果顯示,對于體外復制性衰老模型來說,CD8+T細胞p16、p21高表達的衰老群體比例分別為64.14%±10.3%和71.85%±3.0%,顯著高于 CD4+T細胞的17.65%±0.8%和36.23%±1.6%(圖2B)。

2.3 BM-MSCs共培養對CD8+T細胞抗衰效果更為明顯

為探究BM-MSCs對脾臟T淋巴細胞的作用,將BM-MSCs與復制性T細胞衰老模型共培養(aging-Msc),觀察其對衰老T細胞的影響。發現與BM-MSCs共培養后,脾來源T淋巴細胞的p16陽性比例從34.22%±4.4%下調至24.15%±1.4%(圖3A)、p21陽性比例從41.14%±2.2%下調至27.05%±4.3%(圖3B),均具有顯著差異,其中CD8+T細胞的p16、p21陽性細胞比例下調的均值分別為19.75%和27.91%高于CD4+T細胞的4.55%和7.92%(圖3A, 3B)。這部分結果提示復制性衰老模型中,CD8+T細胞是衰老最顯著的,也是BM-MSCs延緩衰老表型最顯著的細胞群體。

A,B.flow cytometry analysis of splentic T cells, CD8+T cells and CD4+T cells, stained with p16(A) or p21(B); The corresponding statistics were shown on the right;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with young-Ctrl.

2.4 BM-MSCs通過維持CD8+初始T細胞的比例和狀態延緩衰老

深入分析發現CD8+T細胞的衰老并不同步,而是存在較易衰老的細胞群體(圖4A)。為探究CD8+T細胞主要衰老和共培養后延緩衰老的亞群,本文劃分了初始(CD62L+CD44-)、效應(CD62L-CD44+)和記憶細胞(CD62L+CD44+)(圖4B)。分析各細胞亞群占比發現,年輕對照組初始細胞占86.53%、效應細胞占13.44%和記憶細胞占0.03%,衰老對照組分別占62.55%、37.34%和0.11%,BM-MSCs共培養后分別占88.62%、10.74%和0.64%。體外持續刺激的復制性衰老導致效應 T細胞比例上調,對應的初始T細胞比例下調,共培養后初始T細胞亞群的比例得到恢復(圖4C)。由于記憶細胞絕對細胞數量太少,后續衰老標志比例分析只對效應細胞和初始細胞進行比較分析。

A.representative flow plots of CD8+ T cells from primary splenocytes (young-Ctrl), replicative senescence model (aging-Ctrl) and senescence model cells cocultured with BM-MSCs (aging-Msc),arrowheads indicate p16/p21-positive cells; B.gating strategy for naive(CD62L+CD44-), effector(CD62L-CD44+)and memory(CD62L+CD44+)CD8+T cells; C.histogram of naive, effector and memory cells proportion in CD8+T cells from young-Ctrl, aging-Ctrl and aging-Msc; D.representative flow cytometry analysis of naive and effector CD8+T cells;E.statistical histogram of the proportion of p21 positive cells in aging-Ctrl and aging-Msc; *P<0.05, **P<0.001 compared with aging-Ctrl.

CD8+T細胞各亞群的p21表達都隨增殖時間的延長而上調,效應細胞p21陽性細胞比例從年輕組的3.36%±2.5%上調至83.65%±11.4%,初始細胞從0.01%±0.02%上調至2.63%±0.4%(圖4D)。BM-MSCs共培養后效應細胞p21陽性比例無明顯變化,而初始細胞的p21陽性細胞比例在共培養后從2.63%±0.4%下調至1.59%±0.2%,(圖4E)。結合前述細胞亞群比例的變化(圖4C),得出效應細胞衰老占比升高是CD8+T細胞p21上調的主要原因;共培養后初始細胞p21表達的下調及其比例的保持是CD8+T細胞p21表達回落的主要原因。

3 討論

如何防治衰老相關疾病從而實現健康長壽是衰老研究中長期存在的問題。作為驅動機體衰老的重要因素,免疫系統的功能減退導致了機體感染率增加、癌癥易感性增加以及疫苗效力的降低[7]。有充分的證據表明,T 淋巴細胞經歷了主要的年齡依賴性變化,其質與量的變化是導致衰老時體液免疫和細胞免疫應答異常的主要原因[6]。此前,本課題組發現MSCs對T細胞的免疫功能起支持作用[12]。那么MSCs是否可以起到延緩T細胞衰老的作用?如果可以,其主要作用于哪些靶細胞群體? 基于此,本文構建了體外復制性衰老模型,借助流式細胞術劃分不同細胞群體,并以p16和p21的高表達指示細胞衰老。

與刺激增殖1 d的對照組相比,持續增殖7 d的T細胞出現了p16、p21高表達的衰老細胞群體。進行亞群間比較發現,CD8+T細胞的衰老表型更為顯著。已經有研究表明,與CD4+T細胞相比,CD8+T細胞在衰老過程中可能對表型和功能的變化更敏感,更快地表現出衰老狀態[13],這與本實驗結果一致,也反應了復制性衰老模型可一定程度上模擬T細胞自然衰老的在體狀態。BM-MSCs共培養可以延緩衰老T細胞p16、p21的上調,對CD8+T細胞效果最佳,這可能與CD8+T細胞本身比CD4+T細胞衰老更為顯著有關。繼續對CD8+T細胞進行亞群細分,三個亞群中,效應細胞的衰老最為顯著。但BM-MSCs共培養對衰老的效應細胞沒有明顯的影響,反而顯著抑制初始細胞的衰老。結合已經報道的T淋巴細胞的衰老主要表現為初始細胞的免疫多樣性下降[14],提示BM-MSCs移植可能通過抑制初始T細胞衰老,達到緩解免疫衰老的目的。

本研究目前還存在很多問題有待進一步研究。比如目前的數據僅以體外復制性衰老模型模擬小鼠的免疫衰老,缺少體內證據,需要進一步完成體內驗證,才能對BM-MSCs的抗免疫衰老得出可靠的結論。此外本研究僅探究了MSCs發揮抗衰作用的主要靶細胞,具體分子機制還有待闡述。免疫衰老是多種細胞和微環境共同作用的結果,為還原在體狀態,本研究與BM-MSCs共培養時并未分選出CD8+T細胞,因此可能存在中間細胞參與BM-MSCs對CD8+T細胞的抗衰作用。

綜上所述,本實驗構建了T細胞體外復制性衰老細胞模型,證明了其中CD8+T細胞衰老表現最顯著。BM-MSCs共培養可以緩解T細胞衰老,對于CD8+T細胞的抗衰作用更顯著,主要作用于抑制了CD8+初始T細胞的衰老。本文為T細胞衰老的機制研究提供了體外模型,為理解T細胞的衰老過程和MSCs對其的延緩作用提供更細化的視角。