應用微量蛋白質定量分析評估臨床樣本炎性反應狀態

葉雨昕，李慧嫻，閻 濤，張 赟，孫玉琳*

國家癌癥中心/國家腫瘤臨床醫學研究中心/中國醫學科學院 北京協和醫學院 腫瘤醫院 1.分子腫瘤學國家重點實驗室；2.麻醉科，北京 100021

不可控的炎性反應與腫瘤的發生、發展及治療反應密切相關,是腫瘤的十四大特征之一[1]。此外,各種感染性和損傷性應激也會刺激機體產生炎性反應[2],參與各種疾病。在此過程中,外周血單核細胞的數量和活性是了解機體全身性炎性反應狀態的重要窗口。大量研究表明,人類和小鼠腫瘤中外周血單核細胞數量明顯升高并與不良預后相關,而其可進一步被活化,激活細胞內的炎性小體等相關信號通路,產生大量的細胞和趨化因子,影響腫瘤和疾病的轉歸和進程[3]。

炎性小體是機體天然免疫的重要組成部分,是由模式識別受體NLRP3、接頭蛋白ASC即凋亡相關斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein)和效應蛋白pro-caspase-1組成的多聚蛋白復合物[4],其激活后產生活性caspase-1,可將下游的細胞因子前體pro-IL-1β和pro-IL-18分別轉化為成熟型IL-1β和IL-18并引發一系列炎性反應[5]。通常檢測全身性炎性水平的方法需要先從大量外周血中提取單核細胞,再經實時熒光定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction, qPCR)或蛋白質免疫印跡(Western blot)等方法,評價炎性小體和下游相關分子的表達水平[6-10]。QPCR靈敏,所需樣本量較少,但只能檢測mRNA水平的變化;而傳統的Western blot檢測操作繁瑣,對樣本量要求較高,需要從比較大量的外周血中分離單核細胞并提取蛋白質,不便于臨床使用。微量蛋白質定量分析系統(quantita-tive analysis of trace-level proteins)是一種用于高效、自動和準確測量生物樣品中蛋白質含量的設備[11]。基于傳統的Western blot,該系統將所需步驟的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)、電轉移、抗體雜交和酶聯免疫顯影等步驟集中,從而實現全自動化。本研究基于10例乳腺癌患者的術前、術后外周血樣本,探索了微量蛋白質定量分析在炎性小體相關通路分子檢測中的應用價值,并與qPCR做了對比分析,為臨床樣本的微量、快速、精準檢測提供了標準方法和參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

本研究對象來自于2022年05月03日至2023年12月01日中國醫學科學院腫瘤醫院乳腺外科行乳腺癌單側乳房切除術(包括前哨淋巴結活檢或腋窩淋巴結清掃)或保乳術(包括前哨淋巴結活檢或腋窩淋巴結清掃)的患者,共10例,年齡為18～70歲,ASA Ⅰ-Ⅲ級;手術均由同一組乳腺外科醫生承擔。排除了合并炎性疾病和近30 d內接收過手術治療的患者。本研究方案經中國醫學科學院腫瘤醫院倫理委員會批準(批號:20/332-2528)。所有患者均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 外周血單個核細胞的獲取:使用含檸檬酸鈉抗凝的BD Vacutainer? CPTTM單個核細胞制備管(BectonDickinson公司,貨號362761)采集所有入組患者的手術前和術后2 h血液樣本,單次采血量約6 mL。收集后的采血管在22 ℃,1 700 ×g離心30 min,吸取中間白色細胞層(圖1)進行實驗,加入3～4倍體積的1×PBS,吹打混勻;300×g離心10 min,離心后棄上清,得到外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells, PBMCs)沉淀(操作用時約1 h)。

PBMCs.peripheral blood mononuclear cells, created with BioRender.com.

1.2.2 單核細胞的分離培養和活化處理:使用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養液(大連美侖生物技術有限公司)重懸上述分離后的單個核細胞,吹吸混勻移入T25培養瓶中(操作用時約5 min),并在含5% CO2的孵箱中37 ℃培養過夜。在此過程中,未貼壁的淋巴細胞被換液去除,從而獲得了純化的具有貼壁特性的單核細胞樣本。隨后使用100 ng/mL脂多糖(lipopolysaccharide, LPS, Sigma-Aldrich公司)對貼壁的單核細胞進行活化處理4 h(操作用時約5 min)。將獲取的細胞分成兩部分,三分之二的細胞使用適量含有1×蛋白質酶抑制劑(Roche公司)、1×磷酸酶抑制劑(Bimake公司)的RIPA強裂解液(北京康為世紀生物科技有限公司)進行蛋白質裂解,三分之一的細胞用TRIzol? Reagent(Invitrogen公司)裂解提取RNA,分別于-80 ℃冰箱中保存。

1.2.3 實時定量PCR:使用RNAprep Pure微量樣品總RNA提取試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]提取純化總RNA,將提取的總RNA使用HiFiScript cDNA合成試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)進行反轉錄。將反轉錄得到的cDNA以1∶2比例稀釋后使用AceQ Universal SYBR qPCR Master Mix試劑盒(南京諾唯贊醫療科技有限公司)進行qPCR檢測(操作用時約5.5 h)。內參基因使用β-actin,相對基因表達水平采用了2-ΔΔCt法,引物序列(表1)。

表1 基因引物序列和抗體信息Table 1 Gene primer sequences and antibody information

1.2.4 微量蛋白質定量分析:采用JESS全自動蛋白質定量分析系統(protein simple, USA)進行。首先使用BCA法定量蛋白質樣品,其次按12～230 ku 中分子量蛋白分析試劑(貨號SM-W004)操作要求取相應體積5×master mix(即 loading buffer)和0.1×sample buffer,混合制成樣品檢測液,95 ℃變性5 min,加入到檢測板的樣品孔道中。然后將一抗稀釋液、一抗(表1)、二抗、發光液、洗滌液分別加入到檢測板的相應孔道中,室溫2 500 r/min離心檢測板5 min。將檢測板和預制毛細管板放入儀器,運行Compass for SW軟件程序,開展微量蛋白質定量分析(操作用時約4 h),采用細胞裂解液作為質控,運行結束后采集圖像檢測目的蛋白及內參蛋白的灰度值并計算比值,內參基因使用β-actin。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 外周血單核細胞的分離

全部10例患者術前、術后外周血中貼壁單核細胞計數結果(表2),可見不同個體相同體積外周血中單核細胞數量差異較大,可達兩個數量級,而絕大部分患者經過手術應激后外周血單核細胞數量明顯增加。

表2 10例患者手術前后外周血貼壁單核細胞數量

2.2 利用qPCR檢測caspase-1和IL-1β的mRNA在乳腺癌患者手術前后單核細胞中的表達變化

首先選擇炎性小體的效應分子caspase-1和下游分子IL-1β,利用qPCR技術對10例乳腺癌患者手術前后外周血單核細胞中2個分子mRNA的表達水平進行了檢測。結果顯示,與術前相比,caspase-1的表達水平在5例患者中術后顯著升高,在4例患者中顯著降低,而在1例患者中則未呈現出顯著差異(圖2A)。另外,針對IL-1β的檢測結果顯示,4例患者的表達水平術后顯著升高,5例患者的表達水平顯著降低,而有1例患者的表達水平未呈現明顯差異(圖2B)。綜合,6例患者在caspase-1和IL-1β的表達水平上呈現出一致的趨勢,其中3例患者的術后表達水平均上升(BC1、BC7、BC8),另外3例患者的表達水平則呈現下降的趨勢(BC3、BC6、BC10),而剩余4例患者的2個基因呈現不一致的結果。

A.qPCR detected the expression levels of caspase-1 mRNA in peripheral blood monocytes samples from breast cancer patients before and after surgery; B.qPCR detected the expression levels of IL-1β mRNA in peripheral blood monocytes samples from breast cancer patients before and after surgery;pre.preoperative monocytes; post.postoperative monocytes; The ratio of gene expression level in postoperative monocytes to that in preoperative monocytes was represented on the Y-axis, while different patients are represented on the X-axis;*P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared to the control group.

2.3 乳腺癌患者單核細胞中caspase-1和IL-1β蛋白的微量快速檢測

利用微量蛋白質定量分析系統檢測了10例乳腺癌患者手術前后配對單核細胞樣本中caspase-1和IL-1β的蛋白水平,結果顯示,有6例患者的術后caspase-1表達水平顯著升高3例患者的顯著降低,而有1例患者的表達水平未呈現出顯著差異(圖3A,B)。另外,6例患者的術后IL-1β表達水平顯著升高,2例患者的顯著降低,而有2例患者的表達水平未呈現出明顯差異(圖3A,C)。綜合,有8例患者在caspase-1和IL-1β的術后表達水平上呈現出一致的趨勢,其中5例患者的術后表達水平上升(BC1、BC2、BC3、BC4、BC7),2例患者的則呈現下降趨勢(BC6、BC9),而有1例患者的表達水平未呈現明顯差異(BC10)。

A.quantitative analysis of trace-level proteins detecting the expression levels of caspase-1 and IL-1β proteins in breast cancer patients before and after surgery, pre.preoperative monocytes; post.postoperative monocytes; The ratio of protein expression level in postoperative monocytes to that in preoperative monocytes was represented on the Y-axis, while different patients were represented on the X-axis; B.quantitative analysis of caspase-1 protein levels in breast cancer patients before and after surgery; C.quantitative analysis of IL-1β protein levels in breast cancer patients before and after surgery; D.quantitative analysis of cleaved caspase-1 protein levels in breast cancer patients before and after surgery; E.quantitative analysis of cleaved IL-1β protein levels in breast cancer patients before and after surgery; *P<0.05, **P<0.01, ***P<0.001 compared with the control group.

值得注意的是,caspase-1和IL-1β在體內均以無活性的酶原形式存在,在炎性反應狀態下,兩者先后被蛋白質水解激活,而蛋白質水平的檢測能顯示前體蛋白質的酶切活化。8例患者表現出明顯的caspase-1和IL-1β活性切割條帶(BC1、BC2、BC3、BC4、BC6、BC7、BC9、BC10),其中4例術前、術后均有活性切割條帶(BC1、BC2、BC9、BC10),4例術后出現活性切割條帶(BC3、BC4、BC7、BC8)且均出現明顯增加的趨勢,1例術前出現活性切割條帶(BC6)(圖3D,E)。這些結果提示微量蛋白質定量分析系統具有直觀地檢測caspase-1和IL-1β蛋白水解活化的能力,進一步深入理解患者體內的炎性反應狀態。

2.4 信使RNA(mRNA)和蛋白質檢測結果的比較

對比mRNA和蛋白質水平的檢測結果發現,有4例患者的術后caspase-1 mRNA和蛋白質表達水平均顯著升高(BC1、BC4、BC7、BC8),3例患者均顯著降低(BC6、BC9、BC10),而有3例患者(BC2、BC3、BC5)的mRNA和蛋白質表達水平呈現不一致改變(圖4A)。此外,有4例患者的術后IL-1β mRNA和蛋白質表達水平顯著升高(BC1、BC2、BC7、BC8),2例患者均顯著降低(BC6、BC10),而有4例患者(BC3、BC4、BC5、BC9)的mRNA和蛋白質表達水平呈現不一致(圖4B)。綜上所述,共3例患者mRNA和蛋白質水平caspase-1和IL-1β表達水平均顯著升高(BC1、BC7、BC8),2例患者的表達水平均顯著降低(BC6、BC10)。由此可見,僅僅依賴于mRNA水平的檢測不能完全反映機體內蛋白質的真實表達情況,結合蛋白質的表達和活化情況能夠更全面地評估患者的炎性反應狀況。

A.comparison of caspase-1 expression levels in breast cancer patients before and after surgery using quantitative analysis of trace-level proteins and qPCR; B.comparison of IL-1β expression levels in breast cancer patients before and after surgery using quantitative analysis of trace-level proteins and qPCR; The ratio of gene or protein expression level in postoperative monocytes to that in preoperative monocytes was represented on the Y-axis, while different patients were represented on the X-axis.

2.5 比較單核細胞炎性反應水平檢測方法之間的優缺點

對傳統檢測單核細胞內炎性反應水平的qPCR和Western blot,以及本研究中使用的微量蛋白質定量分析進行了方法學上的比較和總結(表3)。QPCR檢測雖然比較靈敏,所需樣本量也比較少,但mRNA水平不能真實地反映體內蛋白質的表達變化和功能活性狀態。通過對比研究發現,近一半患者的術后caspase-1和IL-1β改變呈現出mRNA水平和蛋白質水平相反的變化,因此并不推薦將qPCR檢測用于單核細胞炎性小體活化狀態和全身性炎性反應狀態的評估。傳統的Western blot檢測雖能在蛋白質水平上反映炎性相關因子的變化,但所需外周血用量過大,操作時間長,對患者和操作者負擔過重,并不適于臨床樣本檢測。而本研究使用的微量蛋白質定量分析具有樣本量需求較少、流程標準化、高可重復性、高靈敏度等優勢,能夠在短時間內快速反映出患者體內的真實蛋白質水平改變和活性狀態,為臨床樣本的快速、微量檢測提供了更加適用的方法。總的來說, 微量蛋白質定量分析對于評估臨床樣本中的炎性因子表達水平和炎性反應狀態具有重要意義,其可靠性和高效性使其成為未來臨床樣本檢測的有力工具。

表3 單核細胞炎性反應水平檢測方法之間的比較Table 3 Comparison of inflammatory levels in monocytes detection methods

3 討論

單核細胞是體內各種炎性相關細胞因子的主要來源,也是評估全身性炎性反應狀態的主要對象。本研究以乳腺癌患者手術前后分別經LPS處理4 h的外周血單核細胞為樣本,對比分析了qPCR和微量蛋白質定量分析方法對caspase-1和IL-1β表達量的檢測結果,為評估各種應激因素和腫瘤狀態對于體內炎性微環境影響的臨床研究,以及腫瘤患者的臨床管理提供了方法學參考。

文獻報道[6],單核細胞對LPS的響應非常迅速,炎性小體相關分子的mRNA和蛋白水平迅速增加,到3 h IL-1β的mRNA已進入平緩增長期,而到6 h部分樣本的mRNA表達量已明顯下降。因此本文選擇了LPS處理4 h進行檢測。研究結果表明大部分個體的炎性相關因子在術后2 h即明顯升高,但剩余個體反而表現出降低或沒有明顯變化。這種差異可能對于患者的全身性炎性反應狀態具有重要影響,但需要更為系統的隨訪觀察。重要的是,近半患者手術前后caspase-1和IL-1β的mRNA水平的變化與蛋白質表達水平變化不一致。這提示研究疾病發展中關鍵蛋白的表達情況,僅依賴基因水平的檢測可能存在局限性,而蛋白質水平的檢測能反映體內更多層面的表達調控,比如翻譯、翻譯后修飾等,相比于蛋白質總量,酶切活性對于炎性反應狀態的評估更加重要。

近年來,微量蛋白質定量分析系統已經廣泛應用于基礎研究和產品研發中。在磷酸化和蛋白異構體分析、疫苗研發和治療性蛋白質等不同領域中,其均展現出多方面的優勢[12-15]。本研究也證明其在測量蛋白質水平上具有樣本需求量小、流程標準化、可重復性高、靈敏度高等特點,更適用于臨床樣本的檢測。本研究也存在一些局限性,比如樣本量相對較小,僅檢測了少數因子的表達等,限制了結果的全面性和泛化性。

綜上,本研究通過對比分析發現,傳統的qPCR檢測不適于炎性反應狀態的評估,而微量蛋白質分析具有樣本用量少、靈敏度高、重復性好、操作相對簡單等優點,特別適合基于臨床樣本的分析,可為深入了解腫瘤炎性反應微環境的分子機制、臨床診斷和治療等提供依據。