24重熒光real-time PCR技術在食物中毒快速檢測中的應用

盧媛 鐘穎濤

摘 要：目的：應用24重熒光real-time PCR檢測技術快速篩檢食物中毒病原菌，結合國家標準中的培養(yǎng)法探討24重熒光real-time PCR檢測技術符合性和應用價值。方法：采用高靈敏度、高特異性的24重熒光real-time PCR檢測技術作為中毒病原菌的初篩方法，國標方法進行細菌分離培養(yǎng)，并對分離出的病原菌進行生化鑒定。結果：5份食物中毒患者肛拭子在增菌前檢出4份霍亂弧菌核酸（非O1/非O139群，24重熒光real-time PCR），9份患者肛拭子在增菌后檢出5株霍亂弧菌（非O1/非O139群，國標培養(yǎng)法），其中包含4份PCR技術初篩陽性樣品，兩個方法的符合率為80%。所有樣本均未檢出沙門氏菌、志賀菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸埃希菌以及金黃色葡萄球菌。結論：應用24重熒光real-time PCR檢測技術同時檢測24種常見致病病原菌，能高效鎖定中毒病原菌。將其與國標培養(yǎng)法相結合，對臨床治療和食物中毒快速處置能起到積極作用，值得應用和推廣。

關鍵詞：24重熒光real-time PCR技術；培養(yǎng)法；食物中毒

Abstract： Objective： To use 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology to rapidly screen food poisoning pathogens， and to explore the compliance and application value of 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology combined with national standard culture method. Method： The 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology with high sensitivity and specificity was used as the primary screening method for toxic pathogens， and the bacteria were isolated and cultured by national standard method， and the isolated pathogenic bacteria were biochemically identified. Result： Four samples of Vibrio cholerae nucleic acid （non O1/non O139 group， 24-plex fluorescence real-time PCR） were detected from the anal swabs of 5 food poisoning patients before bacterial enrichment. Nine samples of patients detected five strains of Vibrio cholerae （non O1/non O139 group， national standard culture method） from their anal swabs after bacterial enrichment， including four samples that were initially screened positive by PCR technology. The compliance rate of the two methods was 80%. All samples did not detect Salmonella， Shigella， Vibrio parahaemolyticus， Escherichia coli， or Staphylococcus aureus. Conclusion： The 24-plex fluorescence real-time PCR detection technology was used to detect 24 common pathogenic bacteria at the same time， which could effectively lock the poisoning pathogens. Combining it with national standard culture method can play a positive role in clinical treatment and rapid treatment of food poisoning， which is worthy of application and promotion.

Keywords： 24-plex fluorescence real-time PCR; culture method; food poisoning

食物中毒事件大多數是突發(fā)的，涉及人員較多，中毒機制復雜，致病因子較多，單靠現場流行病學調查較難推斷中毒病原體，甚至現場沒有線索無法判斷中毒病原體，這種情況下只能把常見的多種致病菌都按照國標培養(yǎng)法流程進行增菌分離，該過程工作量大、操作煩瑣、耗時長，無法及時為事件處置提供實驗室依據，降低了事件處置效率，不利于臨床救治。采用24重熒光real-time PCR檢測技術快速篩檢食物中毒病原菌，高效鎖定病原菌，并與國標培養(yǎng)法相結合，可為及時進行事件處置和臨床救治提供依據。

2022年清遠市發(fā)生一起食物中毒事件，主要癥狀為腹瀉、嘔吐，接報后，應急小組趕赴現場開展流行病學調查和采樣工作，采集樣品送實驗室進行檢測。由于致病因子不明，而24重熒光real-time PCR技術同時可以檢測沙門菌、志賀菌、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、金黃色葡萄球菌以及變形桿菌等24種病原體，故實驗室直接采用24重熒光real-time PCR技術對5份癥狀比較嚴重的患者肛拭子進行初篩，以期能高效鎖定中毒病原菌，提高事件處置效率，為臨床救治贏得時間。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

采集9份患者肛拭子樣品，10份廚房環(huán)境樣品，2份水樣品，送實驗室檢測。

1.2 儀器與試劑

48位核酸提取儀（中國上海伯杰醫(yī)療科技有限公司）；ABI7500型real-time PCR 儀（美國ABI公司）；堿性蛋白胨水、3%堿性蛋白胨水、緩沖蛋白胨水、7.5%氯化鈉肉湯、志賀氏菌增菌液、營養(yǎng)肉湯、弧菌顯色平板、TCBS平板、4號平板、沙門菌顯色平板、金黃色葡萄球菌顯色平板、大腸菌顯色平板，北京陸橋技術股份有限公司；生化鑒定試劑盒（批號：5110416），廣東環(huán)凱生物技術有限公司；霍亂弧菌診斷血清O1群、O139（批號：20220101），寧波天潤生物藥業(yè)有限公司；核酸提取試劑（BG001B提取程序），上海伯杰醫(yī)療科技有限公司；24種腹瀉病原體多重病原體核酸快速檢測試劑盒（熒光PCR法，批號22051806/7），生凌醫(yī)療。

1.3 實驗方法

1.3.1 24重熒光real-time PCR法

吸取200 μL樣品按提取試劑要求進行提取，吸取5 μL提取好的樣品核酸到擴增試劑，混勻離心后上PCR儀進行擴增（擴增升溫程序：50 ℃保溫?15 min，95 ℃保溫 5 min，95 ℃保溫3 s，55 ℃保溫45 s，并在該階段收集熒光信號，循環(huán)45次）。共檢測沙門氏菌、志賀氏菌、變形桿菌、結腸彎曲菌、產氣莢膜桿菌、單核細胞增生李斯特菌、大腸桿菌O157、霍亂弧菌、副溶血性弧菌、蠟樣芽孢桿菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、空腸彎曲菌、小腸耶爾森菌、肉毒桿菌、EPEC（bfp、escV）、輪狀病毒A型、諾如病毒（GI型、GⅡ型）、腸道腺病毒、札如病毒、星狀病毒以及腺病毒24種腹瀉病原體。

1.3.2 培養(yǎng)法

按國家標準法檢驗程序[1-5]要求對食源性致病菌進行增菌培養(yǎng)、分離鑒定，采用24重熒光real-time PCR技術初篩病原菌并進行重點增菌培養(yǎng)[6-7]，同時將培養(yǎng)鑒定結果與24重熒real-time PCR檢測結果進行比較。

2 結果與分析

采用24重熒光real-time PCR技術對5份患者樣品進行初篩，其中有4份檢出霍亂弧菌核酸，經霍亂弧菌核酸試劑盒（O1、O139型，PCR法）確定為非O1/非O139群霍亂弧菌；采用國標法對9份患者樣品進行增菌培養(yǎng)，檢出5株霍亂弧菌（非O1/非O139群）（經PCR技術初篩為陽性的樣品4份以及陰性樣品1份），兩種方法檢測結果相符率為80%。2份環(huán)境樣品經國標培養(yǎng)法檢出霍亂弧菌（非O1/非O139群），其余樣品霍亂弧菌檢測結果均為陰性。兩法均未檢出沙門氏菌、志賀氏菌、副溶血性弧菌、致瀉性大腸埃希菌以及金黃色葡萄球菌。

2.1 24重熒光real-time PCR技術檢出情況

樣品中霍亂弧菌核酸擴增曲線見圖1。有明顯指數增長期即可判定為陽性，從圖中可以看出，5份患者樣品在增菌前直接用24重熒real-time PCR法檢測，其中4份檢出霍亂弧菌核酸，循環(huán)數≤36。

2.2 國標培養(yǎng)法檢出情況

采用國標法對9份患者肛拭子樣品、10份廚房環(huán)境樣品、2份水樣品進行病原菌檢測，結果只有弧菌顯色平板上可見藍綠色菌落，TCBS平板上可見黃色菌落，4號平板可見中心灰色半透明可疑菌落。挑出可疑菌落進一步分離純化，經革蘭染色鏡檢、血清診斷、生化鑒定后確定為霍亂弧菌（非O1/非O139群）。

3 討論與結論

本次食物中毒事件患者只出現了腸胃不適，沒有其他明顯癥狀，現場流調結果為致病因子暫不明確，因此實驗室直接用24重熒光real-time PCR技術進行初篩，一次直接篩查24種病原體，整個過程僅用3 h就鎖定中毒致病菌，對查明事件原因、減輕國標培養(yǎng)法工作量、確定臨床救治方案發(fā)揮了重要作用。經國標培養(yǎng)法驗證，兩法符合率達80%，表明24重熒光real-time PCR檢測結果具有較高的可信度，這與其他學者的研究結果一致[8]。該事件中有1份樣品經24重熒光real-time PCR技術初篩為陰性，但經國標法增菌培養(yǎng)后檢出霍亂弧菌（非O1/非O139群），這可能是因為增菌前該樣品含有霍亂弧菌（非O1/非O139群）核酸量低于PCR技術檢出限，建議后續(xù)檢測時可先進行短期增菌后再應用多重real-time PCR技術初篩，避免假陰性結果。

聚合酶鏈式反應（Polymerase Chain Reaction，PCR）是一種用于放大擴增特定的核酸片段的分子生物學技術，是生物體外的特殊核酸復制，只要能提取出核酸，就能用PCR技術加以放大，進行比對。PCR的最大特點是能將微量的核酸大幅增加。食物中毒事件涉及人員較多，且極為復雜，現場遺留的中毒病原體可能極其微量，食物中毒事件處置過程中快速明確中毒病原體是事件定性的關鍵。僅按照國標方法進行分離培養(yǎng)、生化鑒定等，耗時費力，難以滿足高效處置事件的要求，因此建立一種準確、高效、靈敏、便捷的食物中毒病原體快篩方法意義重大[9]。近幾年有關學者針對食物中毒快速檢測方法進行了大量研究[10-12]，提出多重PCR技術是快速檢測食物中毒病原體的有效方法[13-15]。

24重熒光real-time PCR技術設計了24種病原體的核酸引物，只要提取到微量核酸就可以同時排查24種病原體，具有篩查病原體多、靈敏度高、特異性強、速度快以及操作簡單的優(yōu)勢[16-18]，其能在3～5 h鎖定主要目標病原體，對常見的諾如病毒、輪狀病毒等腹瀉病原體也可以進行初篩，可以檢測食物樣品、環(huán)境樣品、排泄物以及嘔吐物等多種樣品，適用于快速初篩食物中毒病原體。24重熒光real-time PCR技術應用前景廣闊：①區(qū)、縣級疾病預防控制中心基本都配備了P2實驗室、PCR儀、提取儀等設備；②檢驗人員接受過PCR檢測技術培訓，可以熟練操作PCR儀，如果發(fā)生食物中毒事件，區(qū)、縣實驗室可以依靠自己的力量進行病原體初篩檢測，有利于有效控制事件發(fā)展；③24種腹瀉病原體核酸試劑盒商品化日益成熟，試劑耗材供應穩(wěn)定，強大的物流運輸完全可以保障試劑盒全程冷鏈監(jiān)測方式送達客戶手中，確保試劑盒質量。但該技術也存在以下不足：①基于PCR檢測技術原理為體外基因片段的擴增，如果樣本被污染，則可能造成假陽性結果；②對于細菌性感染事件，PCR檢測技術還未被國家標準利用，使用PCR檢測技術快速鎖定一種或者幾種目標菌，依然要結合國家標準方法進行驗證；③24種腹瀉病原體PCR檢測試劑盒價格昂貴，一些實驗室經費預算不足，暫時無法普及開展。

綜上所述，將24重熒光real-time PCR檢測技術應用在食物中毒事件中有助于高效鎖定病原體，可以與國家標準方法結合使用，應用前景較好，值得推廣應用。

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作者簡介：盧媛（1989—），女，廣東河源人，本科，主管技師。研究方向：衛(wèi)生檢驗。