馬來酸-堿聯合預處理稻稈制備木糖和葡萄糖

方鍇莉

摘 要：以稻稈為原料，通過馬來酸-堿聯合預處理方法制備木糖和葡萄糖。在不同溫度下比較了馬來酸和硫酸對木糖回收率的影響，并對稻稈酸解后的殘渣用堿脫木質素，最后進行纖維素酶水解，以釋放葡萄糖。結果表明，當溫度為150 ℃時，木糖的回收率最高，達72.12%。對稻稈的馬來酸預處理殘渣進行酶解，其葡萄糖得率僅為39.12%；在80 ℃下用2% NaOH對殘渣脫木素處理12 h，酶解葡萄糖得率可提高到83.17%。

關鍵詞：馬來酸；水解；稻稈；木糖；酶解

Pretreatment of Rice Straw Using Maleic Acid Combined with Alkali for Recovery of Xylose and Glucose

FANG Kaili

（School of Basic Medical Sciences and Forensic Medicine， Hangzhou Medical College， Hangzhou 311399， China）

Abstract： The aim is to recover xylose and glucose from rice straw by maleic acid combined with alkali pretreatment. The xylose recovery through maleic acid and sulfuric acid pretreatment of rice straw was compared under different temperatures. Then， the residue obtained after maleic acid pretreatment was delignified by alkali. Finally， the enzymatic hydrolysis of the residue was conducted to release glucose. The maximum xylose recovery reached 72.12% when the temperature was 150 ℃. Additionally， the enzymatic glucose yield was only 39.12% after enzymatic hydrolysis of the rice straw residue. However， the glucose yield increased to 83.17% after the residue was delignified by 2% NaOH at 80 ℃ for 12 h.

Keywords： maleic acid; hydrolysis; rice straw; xylose; enzymatic hydrolysis

在我國南方地區，稻稈是一種資源豐富的農業廢棄物。稻稈中碳水化合物的總含量在60%（w/w）左右，其中纖維素占33%～40%，半纖維素占20%～25%，木質素占15%～20%，另外稻稈灰分含量較多，約占干重的8%～10%。因此，稻稈在發酵糖的制備方面具有很大的應用潛能。在利用稻稈等木質纖維素原料制備生物乙醇過程中，首先需要對原料進行預處理來提高其與纖維素酶的可及度[1-3]。稀硫酸等無機強酸是常用的化學預處理試劑，但在強酸的熱水解過程中，過于劇烈的水解反應條件會促使生成的戊糖降解為糠醛[4]，從而抑制后續乙醇發酵中酵母細胞的生長，導致乙醇生產的速率和得率下降[5-6]。馬來酸又稱順丁烯二酸，被認為是可替代硫酸的預處理試劑，其雙羧酸的結構特點與生物酶的活性催化位點結構類似，有利于維持戊糖的穩定性，在劇烈的酸預處理反應過程中降低戊糖的降解和糠醛的產生[7]。本研究比較了不同溫度下馬來酸和硫酸預處理稻稈對木糖回收率的影響以及堿處理脫木素對稻稈酸解殘渣纖維素酶水解的影響。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

稻稈產自浙江紹興，經自然風干，粉碎后用30目過篩，儲藏于密封塑料袋中。參考美國能源部發布的生物質化合物成分含量測定方法[8]，對稻稈進行組分分析。原料中纖維素和木聚糖分別占原料干重的35.23%和20.76%。

馬來酸、硫酸和氫氧化鈉，購自國藥集團化學試劑有限公司；纖維素酶（C2730）和β-葡萄糖苷酶（Novozyme 188），購自Sigma公司；纖維素酶中濾紙酶活性為117 FPU·g-1，β-葡萄糖苷酶的活性為269 CBU·g-1。

CJK-0.5型快開反應釜，威海新元化工機械廠；高效液相色譜Agilent1100，美國安捷倫公司；LDZX-40SAI型立式自動電熱壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；DKZ-2型電熱恒溫振蕩水槽，上海福瑪實驗設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 稻稈的酸水解

將300 mL馬來酸或硫酸水溶液加到稻稈中，攪拌均勻后轉入500 mL不銹鋼反應罐中，待實驗裝置安裝完畢后用電爐進行加熱。反應結束后立即卸下電爐套并且用冰水混合物冷卻，待溫度降至60 ℃左右，將反應罐內的物料取出，用沙星漏斗過濾，沙星漏斗內的固相用熱水淋洗后再進行過濾，反復淋洗過濾5遍后將液相定容至1 500 mL，過濾淋洗后剩余的固相殘渣置于105 ℃烘箱干燥24 h，稱重后存于封口袋待成分分析。木糖回收率的計算公式為

式中：R為木糖回收率，%；m1為馬來酸水解液中的木糖含量，g；m2為原料中的木聚糖含量，g。

用HPLC分析木糖濃度，液相色譜運行條件如下。Bio-Rad Aminex HPX-87糖柱（7.8×300 mm），以5 mmol·L-1的H2SO4為流動相，流速為0.6 mL·min-1，柱溫為55 ℃，進樣量為10 μL，示差折光檢測器檢測，外標法測定。

1.2.2 殘渣的堿處理

取5 g馬來酸處理所得的稻稈殘渣，置于三角瓶中，加入100 mL的2% NaOH水溶液，80 ℃水浴振蕩加熱一定時間（4～12 h）。反應結束后將物料過濾并不斷用去離子水淋洗直到洗出液pH接近中性為止，最后將處理后的物料置于50 ℃烘箱干燥備用。

1.2.3 物料的酶水解

取0.5 g堿處理后的固相殘渣，加入15 FPU·g-1底物的纖維素酶和30 CBU·g-1底物的β-葡萄糖苷酶，再加入10 mL的檸檬酸緩沖液（pH=4.8）和一定量疊氮化鈉（終濃度為10 mmol·L-1，防止微生物污染）。酶解溫度為50 ℃，酶解時間為72 h，搖床速度為150 r·min-1。反應結束后立即將樣品置于沸水中10 min，待冷卻后離心，取上清液經HPLC測定葡萄糖含量。葡萄糖檢測的色譜運行條件同木糖。酶解葡萄糖得率的計算公式為

式中：Y為葡萄糖酶解得率，%；n1為酶解液中的葡萄糖含量，g；n2為物料中纖維素含量，g。

2 結果與分析

2.1 不同溫度下馬來酸和硫酸預處理稻稈對木糖回收率的影響

鑒于溫度對木質纖維原料的木糖回收率的影響最顯著[9]，本文在固液比68 g·L-1，預處理時間45 min，馬來酸和硫酸濃度0.17 mol·L-1的條件下，考察不同反應溫度（130 ℃、150 ℃和170 ℃）對木糖回收率的影響。如圖1所示，當溫度為130 ℃時，硫酸水解稻稈的木糖回收率為70.67%，而馬來酸水解稻稈的木糖回收率僅為36.24%，這是因為硫酸溶液中含有大量的氫離子，而馬來酸羧基上的氫不能完全解離成氫離子，因此硫酸水解半纖維素產生木糖的速率比馬來酸快得多。在150 ℃下，馬來酸水解稻稈的木糖回收率增加到72.12%，而硫酸水解稻稈的木糖回收率降至61.78%，這是因為木糖在硫酸中的降解速率超過了木糖產生的速率。當反應溫度為170 ℃時，馬來酸水解稻稈的木糖回收率仍然高達71.38%，而硫酸水解稻稈的木糖回收率相比于150 ℃時大幅度下降，僅為12.43%，由此可知大量木糖在170 ℃的硫酸溶液中發生了降解。以上結果表明，在170 ℃的較高溫度下，木糖在馬來酸中的降解水平比在硫酸中低得多。這與LU等[7，10]的研究結果相符，即硫酸水解玉米秸稈過程中的木糖降解率是馬來酸的3～10倍，馬來酸水解玉米秸稈的反應活化能明顯低于硫酸。由于在150 ℃和170 ℃的反應溫度下，馬來酸水解稻稈的木糖回收率較為接近，出于節省能耗的角度考慮，試驗選取150 ℃對馬來酸殘渣進行預處理，然后進行后續酶解實驗。

2.2 堿處理對馬來酸預處理殘渣酶解效果的影響

由表1可知，馬來酸水解稻稈所得殘渣（固液比為68 g·L-1，馬來酸預處理溫度為150 ℃，時間為45 min，馬來酸濃度為0.17 mol·L-1）的酶解葡萄糖得率僅為39.12%；在80 ℃的堿處理溫度下，用2% NaOH分別對殘渣處理4 h、8 h和12 h，各堿處理物料的酶解葡萄糖得率分別為54.72%、76.86%和83.17%。這是因為堿處理有利于殘渣中木質素的脫除，破解了木質素對纖維素酶水解的物理屏障，增加了底物的孔隙率或纖維素酶的可及性[11-12]；堿處理時間越長，物料中的木質素含量越少，從而越有利于纖維素的酶水解[13]。如圖2所示，不同堿處理時間下所得稻稈的木質素含量和酶解葡萄糖得率之間具有較強的線性相關性（R2=0.974 5），表明木質素脫除促進了纖維素的酶解，這與前人的研究結果一致[14-15]。

3 結論

本試驗結果表明，當馬來酸的預處理溫度為150 ℃時，木糖的回收率最大，達72.12%。在170 ℃的較高溫度下，木糖在馬來酸中的降解水平比在硫酸中低得多；對稻稈酸解殘渣進行NaOH脫木素處理，可以大幅度提高物料的酶解葡萄糖得率，且底物中木質素含量和葡萄糖得率呈現較強的線性關系。

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