液相色譜-串聯質譜法分析花生油中的黃曲霉毒素

黃小小 莫秋云

摘 要：目的：建立一種樣品前處理簡易、快速、成本低的液相色譜-串聯質譜法，對花生油樣品中黃曲霉毒素進行定量分析。方法：花生油樣品經甲醇-水（7∶3）提取，以10 mmol·L-1乙酸銨溶液-甲醇作為流動相進行梯度淋洗，采用電噴霧正離子模式多反應監測掃描，外標法定量。利用所建立的分析方法對樣品進行高、中、低3水平的加標實驗，并對實際樣品中黃曲霉毒素含量進行測定。結果：黃曲霉毒素B1、B2、G1、G2在0.2～10.0 ng·mL-1呈現良好的線性相關性，相關系數分別為0.999 6、0999 5、0.998 8、0.999 7；加標回收率在72.5%～102.4%；檢出限分別為0.02 μg·kg-1、0.02 μg·kg-1、0.01 μg·kg-1、0.03 μg·kg-1；相對標準偏差均＜9.2%，符合國標要求。利用該方法對實際樣品中黃曲霉毒素含量進行測定，所得結果與GB 5009.22—2016中的第一法 同位素稀釋液相色譜-串聯質譜法相近。結論：該方法在確保準確度的前提下，具有較好的選擇性和高靈敏度，準確高效，可用于花生油中黃曲霉毒素的檢測。

關鍵詞：花生油；黃曲霉毒素；液相色譜-串聯質譜法

Abstract： Objective： To establish a simple， rapid and low-cost liquid chromatography-tandem mass spectrometry method for quantitative analysis of aflatoxins in peanut oil samples. Method： Peanut oil samples were extracted by methanol-water （7∶3）， and gradient elution was carried out with 10 mmol·L-1 ammonium acetate solution-methanol as mobile phase. Electrospray positive ion mode multiple reaction monitoring scanning was used， and external standard method was used for quantitative analysis. The established analytical method was used to carry out high， medium and low three levels of standard addition experiments on samples， and the content of aflatoxin in actual samples was determined. Result： Aflatoxin B1， B2， G1， G2 showed good linear correlation in the range of 0.2～10.0 ng·mL-1， the correlation coefficients were 0.999 6， 0.999 5， 0.998 8， 0.999 7 respectively. The recovery was 72.5%～102.4%. The detection limits were 0.02 μg·kg-1， 0.02 μg·kg-1， 0.01 μg·kg-1， 0.03 μg·kg-1， respectively. The relative standard deviation was less than 9.2%， which met the requirements of national standard. The method was used to determine the content of aflatoxin in actual samples， and the results were similar to those of the first method of GB 5009.22—2016 isotope dilution liquid chromatography-tandem mass spectrometry. Conclusion： This method has good selectivity， high sensitivity， accuracy and high efficiency under the premise of ensuring accuracy， and can be used for the detection of aflatoxin in peanut oil.

Keywords： peanut oil; aflatoxins; liquid chromatography-tandem mass spectrometry

黃曲霉毒素是由黃曲霉及寄生曲霉等真菌毒素代謝產生的有毒性物質[1-2]。黃曲霉毒素及其代謝產生的衍生物有20多種，其主要由一個呋喃環和一個香豆素組成。自然界中存在最多的黃曲霉毒素是G1、G2、B1、B2、M1與M2，其中黃曲霉毒素B1毒性最強，是劇毒物質氰化鉀的10倍，砒霜的68倍，被世界衛生組織癌癥研究機構劃定為Ⅰ類致癌物[3]。日常生活中，花生及其制品極易被黃曲霉毒素侵染，含量可達到23～500 μg·kg-1[4]，《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）要求花生及其制品中黃曲霉毒素含量不得超過20 μg·kg-1。小作坊榨取的花生油中黃曲霉毒素污染程度普遍偏高，不符合國標要求。因此，需要探究更多有效、快速、便捷、準確的檢測方法，保證花生及其制品的食用安全性，保障消費者的身體健康。目前，黃曲霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法、高效液相色譜-柱后衍生法、高效液相色譜-柱前衍生法、酶聯免疫吸附篩查法和液相色譜-串聯質譜法等。其中，前4種檢測方法試劑消耗量大，成本高，操作復雜，對實驗人員的身體健康危害大，靈敏度低，耗時長，對環境污染嚴重，不適宜大批量檢測。液相色譜-串聯質譜法具有操作簡便、成本低、對環境和試驗人員友好、效率高等優點，通過加標回收試驗和實際樣品檢測驗證發現，該方法能實現對黃曲霉毒素的定性定量檢測，滿足相關國家標準的要求。

1 材料與方法

1.1 材料試劑

黃曲霉毒素G1、G2、B1、B2混合標準品，濃度為1 ?g·mL-1，壇墨質檢科技股份有限公司；甲醇（HPLC），美國Fisher公司；乙酸銨（GR）；尼龍66針式微孔濾膜，直徑0.22 ?m。

1.2 儀器設備

LCMS-8030高效液相三重四級桿質譜儀，島津公司；Multi Reax型渦旋振蕩器，海道夫（中國上海）；AE-200型1/10 000電子天平，上海合資；Milli-Q Direct16型超純水裝置，電阻率：18.2 MΩ·cm，Millipore。

1.3 方法

1.3.1 液相色譜條件

色譜柱：Shim-pack VP-ODS（150 mm×2.0 mm，ID）；流動相：A相為10 mmol乙酸銨溶液，B相為甲醇；梯度洗脫：2%→90%B（0.5～5 min），90%B（5～8 min），90%→2%B（8～10 min）；流速：0.30 mL·min-1；柱溫：35 ℃；進樣量：20 μL。

1.3.2 質譜條件

電噴霧正離子源模式；儀器檢測電壓：4.50 kV；DL溫度：250 ℃；加熱模塊溫度：400 ℃；干燥氣流速：15.00 L·min-1；檢測方式：多離子反應監測（Multiple Reaction Monitoring，MRM）。4種黃曲霉毒素待測物的定性和定量MRM掃描參數見表1。

1.3.3 樣品處理

稱取5 g（精確至0.000 1 g）花生油于50 mL離心管中，加入20 mL甲醇水溶液（體積比為7∶3），渦旋混勻后于渦旋振蕩器中振蕩20 min，在4 ℃條件下10 000 r·min-1離心10 min，準確吸取澄清液1 mL于2 mL離心管中，使用超純水定容至刻度，混勻，以10 000 r·min-1離心5 min，過0.22 μm濾膜，待上機測試。

1.3.4 標準曲線繪制

黃曲霉毒素混合標準使用液（100 ng·mL-1）：準確移取一定量黃曲霉毒素混合標準儲備液（1.0 μg·mL-1）于10 mL容量瓶中，乙腈定容至刻度，混勻，密封后-20 ℃下避光，有效期3個月。黃曲霉毒素混合標準工作液：準確移取一定量黃曲霉毒素混合標準使用液（100 ng·mL-1）于10 mL容量瓶中，使用空白基質溶液逐級稀釋至刻度，混勻，得到濃度分別為0.2 ng·mL-1、0.5 ng·mL-1、1.0 ng·mL-1、2.0 ng·mL-1、5.0 ng·mL-1和10.0 ng·mL-1的黃曲霉毒素混合標準工作液，過0.22 μm濾膜后，待上機。

2 結果與分析

2.1 標準曲線和線性范圍

以峰面積為縱坐標，黃曲霉毒素濃度為橫坐標，繪制線性回歸曲線，并計算回歸曲線方程及相關系數，根據儀器測出的信噪比，計算檢出限和定量限。回歸曲線方程、線性范圍、相關系數、檢出限和定量限見表2。由表2可知，4種黃曲霉毒素的線性關系良好，檢出限和定量限均滿足相關國家標準的要求。圖1為4種黃曲霉毒素對照品（16.0 μg·kg-1）的總離子流色譜圖。

2.2 加標回收試驗

在花生油陰性樣品中分別添加3種濃度（1.6 μg·kg-1、16.0 μg·kg-1、64.0 μg·kg-1）的黃曲霉毒素混合標準溶液，參照1.3所建立的儀器方法條件進行測定，每份樣品重復測定6次，計算加標回收率和精密度（表3）。由表3可知，4種黃曲霉毒素的加標回收率在72.5%～102.4%，相對標準偏差在5.6%～9.2%，說明該方法準確度和精密度均滿足要求。

2.3 市售樣品測定

采用本文建立的分析檢測方法對市售30種散裝花生油進行測定，所得結果見表4。同時運用《食品安全國家標準 食品中黃曲霉毒素B族和G族的測定》（GB 5009.22—2016）第一法“同位素稀釋液相色譜質譜法”，通過免疫親和柱凈化，采用內標法對30種散裝花生油樣品進行了測定。實驗結果表明，兩種方法所得檢測結果相近，同時驗證了本法的可靠性[4-7]。《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）中規定花生油中黃曲霉毒素不得超過20 μg·kg-1。由表4可知，30種散裝花生油中黃曲霉毒素檢出率為96.7%，超標率為23.3%，合格率僅為76.7%。由此看出，目前市售散裝花生油受黃曲霉毒素污染情況比較嚴峻，其中黃曲霉毒素B1污染最為突出。這可能是因為散裝花生油在收購、儲存、加工以及銷售等環節衛生情況不達標，導致散裝花生油中黃曲霉毒素污染嚴重。

3 結論

本研究運用液相色譜-串聯質譜法，建立了同時檢測花生油中4種黃曲霉毒素的方法。實驗結果表明，本方法能夠實現對花生油中4種黃曲霉毒素進行準確快速的定性定量分析，具有快速、簡便、成本低等優勢，滿足相關國家標準方法檢出限和定量限的要求。

參考文獻

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作者簡介：黃小小（1987—），女，瑤族，廣西賀州人，碩士，主管技師。研究方向：理化檢驗。

通信作者：莫秋云（1989—），女，廣西賀州人，碩士，工程師。研究方向：食品安全檢驗檢測。E-mail：27411896767@qq.com。