《人源肺癌類器官培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范》（T/SHSYCXH 12-2022）解析

文/許 俊 王萍萍 郭云峰 任 程

肺癌是全球最常見的癌癥，也是一種復(fù)雜的惡性疾病，在不同患者中表現(xiàn)出的表型和基因型呈多樣性，對精準醫(yī)療的使用提出了相當(dāng)大的挑戰(zhàn)。由于肺癌是肺上皮細胞的致癌性、遺傳學(xué)的變化造成的，并且有不同的分子和病理組織學(xué)分型，因此，肺癌的突變模式非常復(fù)雜。此外，即便是具有相同組織學(xué)表型的肺癌也表現(xiàn)出分子生物學(xué)上的異質(zhì)性，并且每種肺癌亞型都具有獨特潛在的突變。因此，建立一個模擬原始組織的形態(tài)學(xué)和基因組特征的臨床前模型來預(yù)測靶向治療的臨床結(jié)果是非常必要的，了解與肺癌的發(fā)生、進展和治療敏感性相關(guān)的遺傳改變，對于肺癌的治療意義非凡。

人源肺癌類器官（以下簡稱“肺癌類器官”）是通過肺癌腫瘤組織在體外進行三維（3D）培養(yǎng)產(chǎn)生的，構(gòu)建成功率高，且能全面地反映患者腫瘤的形態(tài)和遺傳/表觀遺傳特征，與原始臨床標(biāo)本表現(xiàn)出高度的基因型和表型一致性，對抗腫瘤藥物表現(xiàn)出模仿患者預(yù)期反應(yīng)的反應(yīng)，并在短時間內(nèi)可用。肺癌類器官的培養(yǎng)，可以為藥物篩選和研發(fā)提供新的高性價比平臺，有望縮短新藥研發(fā)時間，提高新藥研發(fā)效率。

一、肺類器官培養(yǎng)技術(shù)與標(biāo)準現(xiàn)狀

目前，肺類器官根據(jù)來源主要分為3種：成熟肺上皮干細胞來源的肺類器官、人類多能干細胞來源的肺類器官和肺癌類器官。肺癌類器官的探索經(jīng)過了原代腫瘤細胞培養(yǎng)、腫瘤細胞間質(zhì)細胞混合培養(yǎng)（2D—類器官）和肺癌類器官3個階段的探索。培養(yǎng)標(biāo)本來源也從手術(shù)和穿刺標(biāo)本，發(fā)展到可以通過循環(huán)腫瘤細胞、胸腔積液或支氣管肺泡灌洗液培養(yǎng)。肺癌類器官可由患者組織分離出來的腫瘤細胞生成。肺癌類器官培養(yǎng)的實現(xiàn)采用了多種培養(yǎng)方式，包括促人多能干細胞分化、調(diào)控原代細胞、肺癌細胞轉(zhuǎn)化和通過“條件重編程”方法增加對腫瘤活檢物培養(yǎng)的成功性等。有干性的細胞可以通過熒光激活細胞分選系統(tǒng)或磁珠抗體細胞分選系統(tǒng)進行分離，并在2D培養(yǎng)基或含有基質(zhì)膜（Matrigel）的3D培養(yǎng)基中進行進一步培養(yǎng)。

肺癌類器官生物樣本庫的建立，對指導(dǎo)符合人種特性的肺癌治療和藥物研發(fā)具有不可替代的意義。具有特殊性肺癌生物樣本庫的建立，如早期肺癌生物樣本庫、轉(zhuǎn)移性肺癌樣本庫和肺癌瘤旁樣本庫等，有助于研究早期肺癌的演化機制、肺癌的轉(zhuǎn)移特性、肺癌和瘤旁組織的生物學(xué)特性等，有助于指導(dǎo)患者的個體化治療，推動臨床前藥物研發(fā)、肺癌發(fā)生、進一步演化和轉(zhuǎn)移的機制研究。

目前，肺癌類器官樣本庫建設(shè)需求旺盛。2020年起，每年涌現(xiàn)出超過50家類器官腫瘤藥敏檢測服務(wù)公司。但是，由于缺乏標(biāo)準化的肺癌類器官培養(yǎng)方法，各個實驗室的試驗操作步驟和技術(shù)指標(biāo)要求不同，造成檢測結(jié)果出現(xiàn)偏差。目前，《人源肺癌類器官培養(yǎng)技術(shù)規(guī)范》（T/SHSYCXH 12-2022）在基于《腫瘤類器官診治平臺的質(zhì)量控制標(biāo)準中國專家共識（2022年版）》（以下簡稱《腫瘤標(biāo)準共識》）、《用于藥物篩選的人源癌癥類器官的建立方法》（以下簡稱《藥物篩選方法》）、相關(guān)標(biāo)準等研究基礎(chǔ)上，結(jié)合此類器官的特點，反復(fù)驗證后完成制定，并已發(fā)布實施。為進一步推進、規(guī)范行業(yè)內(nèi)肺癌類器官培養(yǎng)技術(shù)，降低由于試驗操作不同而引起的培養(yǎng)結(jié)果偏差，助力不同實驗室間的數(shù)據(jù)比對分析，推動肺癌類器官培養(yǎng)技術(shù)的發(fā)展，擴大其在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用范圍，本文對T/SHSYCXH 12-2022中的培養(yǎng)關(guān)鍵技術(shù)要求展開解析。

二、主要技術(shù)要求

T/SHSYCXH 12-2022對醫(yī)學(xué)和研究用途的肺癌類器官的培養(yǎng)所涉及的術(shù)語、相關(guān)設(shè)備、耗材和試劑、倫理要求、操作步驟、技術(shù)要求和檢測方法等方面進行了規(guī)范。

T/SHSYCXH 12-2022涉及的主要技術(shù)要求有肺癌類器官的原代培養(yǎng)條件、肺癌類器官的傳代培養(yǎng)條件、肺癌類器官的凍存與復(fù)蘇條件、類器官尺寸、形態(tài)學(xué)特征、病理標(biāo)志物表達和基因突變等。

1.肺癌組織樣本的獲取與運輸

肺癌組織樣本的獲取與運輸要求比對見表1。

表1 肺癌組織樣本的獲取與運輸要求比對

如何在最少取樣量的同時保證試驗效果？肺癌組織樣本體積要求的確定是在研究人員對《腫瘤標(biāo)準共識》和DB4403/T 122-2020（見表1）的研究基礎(chǔ)上，經(jīng)過反復(fù)實驗驗證，最終將肺癌組織樣本的取樣量確定為＞10 mm3，為成功培養(yǎng)肺癌類器官的最小樣本量。

腫瘤組織樣本質(zhì)量的好壞（新鮮度）直接影響類器官培養(yǎng)成功率的高低，故肺癌組織樣本的運輸溫度和運輸時間的確定是基于《腫瘤標(biāo)準共識》中推薦的溫度與國外專家推薦的培養(yǎng)溫度保持一致，以保證樣本質(zhì)量，降低污染風(fēng)險。

2.肺癌類器官的原代培養(yǎng)

① 消化溫度與消化時間

該指標(biāo)比對見表2。

表2 肺癌類器官的原代培養(yǎng)消化溫度與消化時間指標(biāo)比對

肺癌類器官的原代培養(yǎng)消化充分，是能夠從組織中獲得足量細胞的基礎(chǔ)。肺癌類器官的原代培養(yǎng)若要消化充分，消化溫度與消化時間很關(guān)鍵。本研究的培養(yǎng)溫度與DB4403/T 122-2020、《藥物篩選方法》一致，且經(jīng)驗證消化溫度為此時膠原蛋白酶的最快反應(yīng)溫度，消化時間能夠保證組織消化充分。

② 細胞存活率

肺癌組織消化后分離獲得的細胞存活率指標(biāo)，《腫瘤標(biāo)準共識》要求其細胞存活率通過細胞自動計數(shù)儀檢測并且應(yīng)＞90%，《人腸癌類器官》（T/CSCB 0006-2022）團體標(biāo)準要求其新復(fù)蘇的類器官存活率應(yīng)≥50%。經(jīng)過反復(fù)的實驗驗證，肺癌類器官在消化后細胞存活率只要保持在80%以上，就可成功構(gòu)建，故TSHSYCXH 12-2022要求細胞存活率指標(biāo)優(yōu)于T/CSCB 0006-2022，略低于《腫瘤標(biāo)準共識》，即消化后的細胞存活率應(yīng)＞80%。

3.肺癌類器官的傳代培養(yǎng)

肺癌類器官的傳代培養(yǎng)主要指標(biāo)見表3。

表3 肺癌類器官的傳代培養(yǎng)指標(biāo)比對

① 肺癌類器官大小

由于過早傳代會降低類器官的存活率，因此T/SHSYCXH 12-2022中傳代培養(yǎng)的肺癌類器官大小指標(biāo)的確定是在比對《腫瘤標(biāo)準共識》與T/CMCB 020-2023相關(guān)要求的基礎(chǔ)上，并經(jīng)過驗證，確定了可以進行傳代培養(yǎng)的類器官平均直徑，數(shù)值更加精確，要求更高。

② 肺癌類器官的消化時間

若肺癌類器官的消化時間過短，消化會不完全；消化時間過長，則會影響細胞狀態(tài)。故T/SHSYCXH 12-2022根據(jù)DB4403/T 122-2020和《藥物篩選方法》，通過比對和反復(fù)驗證，提出了不同狀態(tài)下的該類器官的消化時間，以保證類器官狀態(tài)。

④ 肺癌類器官的傳代次數(shù)

由于不同來源的癌細胞和組織在培養(yǎng)過程中生長速度存在差異，因此T/SHSYCXH 12-2022在T/CSCB 0006-2022要求基礎(chǔ)上，對其中設(shè)定的傳代次數(shù)已進行多次試驗驗證，即首次進行傳代培養(yǎng)的該類器官，應(yīng)能傳代兩代以上，且維持生長一個月以上可滿足試驗需求。

4.肺癌類器官的凍存與復(fù)蘇后培養(yǎng)

① 人源該類器官的大小

《腫瘤標(biāo)準共識》要求：一般7 d內(nèi)可見類器官基本形態(tài)，14 d內(nèi)可見類器官明顯生長趨勢，被認為狀態(tài)佳。T/SHSYCXH 12-2022基于表3的相應(yīng)要求，規(guī)定當(dāng)原代培養(yǎng)的人源該類器官生長至平均直徑＞50 μm 時，即可進行傳代培養(yǎng)。

② 肺癌類器官的傳代次數(shù)

T/CSCB 0006-2022要求：從腸癌患者來源的人腸癌組織或細胞，初次在體外培養(yǎng)成人腸癌類器官后，應(yīng)能在體外維持培養(yǎng)2個月，且應(yīng)能傳代至少3代。由于不同來源的癌細胞和組織在培養(yǎng)過程中的生長速度存在差異，T/SHSYCXH 12-2022設(shè)定的傳代次數(shù)經(jīng)多次試驗驗證，可滿足試驗需求，規(guī)定首次進行凍存后，復(fù)蘇培養(yǎng)的人源該類器官，應(yīng)能傳代2代以上，且維持生長1個月以上。

5.肺癌類器官培養(yǎng)的檢測

肺癌類器官培養(yǎng)的形態(tài)檢測方法的確定是在《腫瘤標(biāo)準共識》研究的基礎(chǔ)上，研究人員提出當(dāng)肺癌類器官培養(yǎng)2周后的直徑＞50 μm，具有持續(xù)生長能力。該要求擴展了肺癌類器官培養(yǎng)成功的檢測要求，以滿足后續(xù)的傳代與試驗需求。

蘇木精-伊紅染色法常被用于觀察正常組織和病變組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)。肺癌組織表現(xiàn)出的核畸形，細胞質(zhì)變化應(yīng)在對應(yīng)類器官上表現(xiàn)出相同形態(tài)。研究人員在經(jīng)反復(fù)驗證后，肺癌類器官組織形態(tài)學(xué)特征和細胞形態(tài)學(xué)特征鑒定方法采用此染色法。

肺癌類器官病理標(biāo)志物表達鑒定方法是在《腫瘤標(biāo)準共識》、T/CSCB 0006-2022和反復(fù)試驗驗證的基礎(chǔ)上，研究人員規(guī)定了病理表達標(biāo)志物，并在類器官培養(yǎng)后進行標(biāo)志物表達鑒定和基因突變檢測，以確保類器官的成功培養(yǎng)。

基因突變特征鑒定方法是在T/CSCB 0006-2022的研究基礎(chǔ)上確定的，等同采用了該方法。

三、應(yīng)用展望

T/SHSYCXH 12-2022提供了完備的類器官培養(yǎng)流程和鑒定方法，希望能夠有效提高肺癌類器官培養(yǎng)成功率，提升實驗室的培養(yǎng)技術(shù)，為跨批次、跨實驗室和跨平臺的技術(shù)交流提供一個完善的技術(shù)依據(jù)，助力我國引領(lǐng)國內(nèi)外肺癌類器官培養(yǎng)技術(shù)，提高國際技術(shù)互認。

肺癌類器官的培養(yǎng)是將肺癌分離的組織在特定的3D 培養(yǎng)基里面進行培養(yǎng)，模擬體內(nèi)實際的腫瘤微環(huán)境，進行一系列臨床研究。故本文希望該標(biāo)準能促進生物學(xué)和疾病模型等方面的研究，肺癌類器官的培養(yǎng)可用于研究生物學(xué)，也可用于模擬治病過程，包括退行性疾病、傳染性和遺傳性疾病模型。

類器官是接近生理的結(jié)構(gòu)，保留了來源樣本的特定功能，并能準確地再現(xiàn)藥物反應(yīng)，故類器官培養(yǎng)技術(shù)填補了基于傳統(tǒng)細胞系的藥物篩選與臨床試驗之間的空白。T/SHSYCXH 12-2022目前已在國內(nèi)一些新興生物醫(yī)藥企業(yè)得到應(yīng)用，為加快肺癌臨床藥物研究和開發(fā)提供了標(biāo)準支撐。

由于肺癌類器官培養(yǎng)采用人工操作模式，人為因素參與過多、自動化程度低，導(dǎo)致了系統(tǒng)偶然性造成的誤差較大，存在可重復(fù)性和一致性較差的情況，限制了類器官向臨床研究和商業(yè)應(yīng)用轉(zhuǎn)化。本文希望該標(biāo)準能有助于解決現(xiàn)階段肺癌類器官培養(yǎng)技術(shù)成本高、數(shù)據(jù)一致性和可重復(fù)性差等迫切問題，實現(xiàn)全流程的標(biāo)準化、智能化、自動化操作，有助于推動肺癌類器官技術(shù)商業(yè)化應(yīng)用。

T/SHSYCXH 12-2022提供的肺癌類器官培養(yǎng)流程和檢測方法，可以大大提高肺癌類器官的培養(yǎng)成功率，為臨床研究提供技術(shù)保障。目前，針對肺癌有效的藥物較其他癌種多，故在肺癌的耐藥機制的探究、耐藥后二線用藥的選擇方面，類器官有很大的發(fā)揮空間。同時，肺癌的可治靶點相對較多，結(jié)合類器官可以在信號通路方面進一步解讀肺癌耐藥性，大幅度提高肺癌的診療效果，推動精準醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的高質(zhì)量發(fā)展。