大豆根莖過渡區彎曲突變體Mrstz的鑒定與基因定位

苗 龍 舒 闊 李 娟 黃 茹 王業杏 Soltani Muhammad YOUSOF 許競好 吳傳磊 李佳佳 王曉波,* 邱麗娟

大豆根莖過渡區彎曲突變體M的鑒定與基因定位

苗 龍1,**舒 闊1,**李 娟1黃 茹1王業杏1Soltani Muhammad YOUSOF1許競好1吳傳磊1李佳佳1王曉波1,*邱麗娟2,*

1安徽農業大學農學院, 安徽合肥 230036;2中國農業科學院作物科學研究所/ 農業農村部作物基因資源與遺傳改良重大科學工程/ 農業農村部作物基因資源與種質創制重點實驗室, 北京 100081

植物根莖過渡區(root-stem transition zone, RSTZ)將根和莖相互連接, 其發育形態決定了大豆的地上部株型和抗倒伏潛力。本研究通過EMS誘變獲得一個RSTZ彎曲或旋轉的大豆突變體M, 其形態特征能夠穩定遺傳, 是探究大豆莖稈發育規律的特異材料。將該突變體和栽培大豆中黃13雜交構建重組自交系群體, 對群體中直立和彎曲型后代的RSTZ進行解剖結構比較, 發現彎曲型株系比直立型株系的維管形成層較寬、次生木質部細胞層數較多、細胞形狀不規則, 表明維管組織分化可能是導致RSTZ形態發生差異的重要因素之一。進一步對化學組分測定發現, 木質素和粗纖維含量越高越不易彎曲。選取RIL群體中彎曲型和直立型2種極端株系進行BSA-Seq, 采用SNP-index和InDel-index關聯分析方法鑒定到調控RSTZ形態的關聯區域Chr19: 43030943～45849854, 該區間共含有319個基因。結合生物信息學分析、基因注釋信息和表達豐度分析篩選到7個候選基因, 分別為、、、、、、。其中,、和在大豆馴化中潛在影響RSTZ形態建成。本研究為解析大豆RSTZ組織形成及其遺傳基礎提供了材料基礎, 并為挖掘調控大豆莖稈發育基因提供新的見解。

大豆; 根莖過渡區; 突變體; BSA-seq; 候選基因

為了適應外界環境, 植物在不同發育階段會不斷形成新器官, 并通過調整自身的生長方式來維持正常發育[1]。大豆植株可分為地上部和地下部, 地下部分主要由根系構成、地上部主要由莖、葉、花、果莢、種子等構成。在大豆萌發過程中胚芽和胚根逐漸發育為莖和根, 而胚軸是連接胚根和胚芽的部位, 隨著豆苗的不斷形成逐步發育為連接根和莖的根莖過渡區(root-stem transition zone, RSTZ), 根和莖的維管束分化形式存在很大差異, 因此RSTZ也被稱為維管束過渡區。從根到莖的轉變不僅意味著形態上的變化, 而且意味著從運輸和支撐到儲存過程中的功能變化, 因此RSTZ的形態結構是衡量大豆株型的重要依據, 同時與植株對環境的適應性密切相關[2-3]。大豆的根系在吸收土壤水分和其他營養物質的同時也對植株起支撐作用, 同時莖稈的粗細展現了植株的健壯程度, 莖稈粗壯的植株不易發生倒伏, 具有豐產性[4-5]。根據大豆倒伏時期和倒伏程度的不同, 減產程度在10%～60%不等, 倒伏越重、越早, 減產幅度越大, 也間接加大了田間管理和病蟲草害防治的難度, 因而倒伏是制約大豆高產和經濟收入的重要因素[6]。莖倒伏是因為作物植株過高、莖稈細長、基部組織強度差所導致的, 比如遇到外因大風、暴雨, 引起莖稈不同程度的傾斜或彎曲, 也會出現根莖彎曲現象, 導致植物生長不良并造成經濟損失。因此, 探究大豆RSTZ的形態建成及其關鍵調控基因的功能, 對了解大豆植株抗倒伏能力和培育大豆理想株型具有重要意義。

木質部和韌皮部是主要的植物維管組織, 水和溶質礦物的運輸主要通過木質部完成, 而韌皮部負責光合產物和各種信號分子的分配[7-8]。從細胞學角度看, 莖稈的物理結構由機械組織、維管束、木質化薄壁細胞的特征所決定, 這些結構能夠在莖稈的支撐、運輸以及抗倒伏功能中發揮關鍵性作用[9]。一般來說, 根莖過渡區的機械組織、維管束、皮層等解剖結構受外界影響較小, 其中維管形成層的紡錘狀原始細胞通過平周分裂產生新的木質部和韌皮部[10-11]。通常情況下, 朝向木質部一側的平周分裂速率較快, 從而產生較多的木質部細胞, 而韌皮部細胞較少, 如果形成層各處產生的木質部和韌皮部均維持在一個相對恒定的比例, 那么植物莖稈發育基本呈現圓柱型, 即使發生微小的改變, 最終會嚴重影響莖稈形態及植株抗倒伏能力[12-13]。在雙子葉植物中, 頂端分生組織在根、莖的伸長方面發揮重要作用, 而維管形成層主要負責促進莖和根加粗, 其中維管干細胞的增殖分化產生次生木質部和次生韌皮部, 不僅能夠運輸水分和光合產物, 而且起到支撐植物直立生長的作用[14]。前人在不同玉米品種研究中, 發現硬皮組織厚度、單位面積的維管束數目、維管束鞘厚度是玉米莖稈抗倒伏能力的基礎[15-17]。羅茂春等[18]、Duan等[19]和袁新捷等[20]對水稻抗倒伏植株研究也證實了莖稈強度與莖稈組織中的維管束數目存在極顯著正相關。由此可見, 維管組織形態和細胞排列情況是評價植株抗倒伏能力的重要指標之一。

大豆莖稈的主要化學成分為纖維素、半纖維素、木質素、粗纖維等, 這些化學成分的含量與莖稈機械強度以及莖稈形態息息相關。對玉米莖稈化學成分與其形態結構特征的研究中發現木質素、纖維素等物質含量增加時, 莖稈的抗折能力增加, 表明纖維素和木質素含量與莖稈抗倒伏能力呈顯著正相關[21-24]。Silva等[25]研究發現抗倒伏性小麥品種的莖稈木質素含量越高, 抗倒伏能力越強。Vigols等[26]在玉米突變體中證實基因的突變會抑制木質素單體合成, 進而導致植株抗倒伏能力下降。目前, 越來越多的報道表明莖稈的化學組分, 包括木質素含量、纖維素含量對作物抗倒伏性具有重要作用。然而, 關于RSTZ形態及其化學組分變化影響植物的生理及發育研究較少。

隨著新一代測序技術的發展, 前人通過BSA- seq技術對作物抗病性、株型以及高產等農藝性狀開展重要功能基因挖掘, 被廣泛應用于水稻、小麥、大豆等多個物種中。蔣家煥等[27]利用BSA-Seq方法, 在粳稻早衰突變體的F2分離群體中選擇隱性和顯性各100個單株構建混池, 最終定位到影響水稻早衰相關基因。崔彥芹等[28]基于BSA-seq技術對冀航芝1號和DW607的株高性狀進行基因定位, 在NC026152.1和NC026156.1兩條連鎖群上關聯到4個顯著關聯區域, 并鑒定到18個參與生長素響應的候選基因。在大豆中, Zhong等[29]通過該方法在3號染色體上定位到疫霉病抗性基因。本研究利用大豆根莖過渡區彎曲突變體與栽培大豆中黃13雜交構建重組自交系(recombinant inbred lines, RIL)群體, 通過對親本和2個極端表型子代混合池進行BSA全基因組重測序及關聯分析, 結合生物信息學分析、基因注釋信息、基因表達豐度及熒光定量分析, 挖掘調控大豆根莖過渡區形態的遺傳位點及候選基因。本研究為解析大豆RSTZ組織形成及其遺傳基礎提供了理論依據, 并為完善和培育大豆抗倒伏株型品種奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

通過EMS誘變大豆中品661獲得突變體材料M, 該突變體表現為根莖過渡區(RSTZ)長度約為3 cm的組織呈現彎曲或旋轉的特點, 并能夠穩定遺傳。將大豆骨干親本中黃13與M雜交獲得由120個株系構成的重組自交系群體。自2019—2021年連續3年種植于安徽農業大學高新技術產業園和海南南繁基地(F7至F10代), 行播, 行長2 m、行距45 cm、株距15 cm, 常規進行田間管理與表型鑒定。將大豆突變體M雜交后代材料按照不同的莖稈形態進行分類, 主要分為RSTZ部位彎曲型和直立型植株。

1.2 試驗方法

1.2.1 根莖過渡區的解剖結構分析 大豆生育期間, 隨著光合產物的積累和株高增加, 抗倒伏系數呈現U型變化, 在R5～R6期表現為最易發生倒伏, 且R5時期的主根和側根生長最為健壯[30-31]。為比較大豆直立型與彎曲型RSTZ的細胞解剖結構差異, 在R5期分別取2種類型植株的RSTZ組織, 切成1～2 cm小段, 置于FAA固定液中固定并保存。制成石蠟切片后用番紅固綠染色1～2 h, 然后在顯微鏡下觀察次生韌皮部、維管形成層及次生木質部形態結構, 每種性狀類型分別取3 株重復。

1.2.2 大豆M彎曲型和直立型莖稈的化學組分分析 對重組自交系群體分離后代成熟后脫粒, 并保留植株的RSTZ組織部位。采用莖稈切割器(北京昆捷玉成設備有限公司, KQS-400型), 將干燥后的RSTZ組織切成小段, 隨后利用植物秸稈粉碎機(杭州綠博機械設備制造有限責任公司, FSD-100A)研磨粉碎, 通過18目篩子過濾雜質后裝袋。使用DA7200型近紅外成分測定儀測量莖稈中木質素、纖維素、粗纖維的含量。每種類型株系各40份, 每份樣品重復檢測3次, 結果用于后續分析。

1.2.3 BSA-Seq測序 根據在田間對中黃13 (父本)、突變體材料M(母本)以及RIL群體后代表型的鑒定, 選取來自分離群體的30株RSTZ彎曲型和30株RSTZ直立型植株以及2個親本并提取DNA用于文庫構建。利用Illunima Casava 1.8進行堿基識別分析, 采用150 bp雙末端測序, 試驗流程按照南京集思慧遠生物科技有限公司的測序標準執行。根據各樣品混池比對到大豆參考基因組Wm82.a2.v1的結果, 對混池中具有差異性的SNP位點進行匯總。使用GATK軟件工具的HaplotypeCaller (局部單體型組裝)算法進行SNP和InDel變異檢測, 每個樣本先各自生成gVCF, 再進行群體Joint-genotype。過濾并得到最終的變異位點集, 為對基因型數據進行質量控制, 最終保留了最大缺失位點、雜合位點小于20%且最小等位基因頻率大于1%的標記, 利用SnpEff軟件進行變異位點注釋和預測變異效應。

1.2.4 候選基因挖掘 采用SNP-index和InDel- index方法進行全基因組關聯分析, 以置信度99%為篩選閾值, 挖掘調控大豆RSTZ形態的遺傳位點。通過大豆基因組公共數據庫Soybase檢索顯著關聯區間內的所有基因, 并借助BLAST軟件對定位區間內的編碼基因進行多個數據庫(NR、GO、KEGG、COG、Pfam)注釋分析。利用Phytozome數據庫檢索顯著關聯區間內所有基因在大豆各組織中的表達水平, 篩選在根或莖中特異高表達的基因作為候選基因。

1.2.5 熒光定量分析 為比較候選基因在彎曲型和直立型株系中的表達水平, 在突變體M后代分離群體中選取不同類型植株V5時期的RSTZ組織, 分別提取RNA。使用Prime Script RT Master Mix kit (TaKaRa, 日本)作為反轉錄酶合成cDNA, 所有cDNA樣品稀釋至相同濃度后用于qRT-PCR分析。

本試驗使用Primer Premier 5.0設計候選基因熒光定量引物, 并在NCBI (www.ncbi.nlm.nih.gov)網站檢測引物特異性, 選取()作為內參基因, 采用2-DDCt法計算各類型樣品中候選基因的相對表達水平, 每個類型株系進行3個生物學重復。

1.2.6 數據處理與統計分析 利用SPSS 22.0統計軟件進行數據描述性統計分析和檢驗, 差異顯著水平< 0.05。

2 結果與分析

2.1 彎曲型與直立型株系的根莖過渡區解剖學特征比較

將中黃13與突變體M雜交后代按照不同的形態進行分類, 分為RSTZ彎曲型和直立型植株, 其中彎曲型表現為根和莖連接部位彎曲或旋轉等特點(圖1-A)。植物維管組織中, 形成層細胞的分化能夠影響莖稈側向形態建成, 為比較RSTZ維管結構在2種類型株系中的差異, 本研究進一步探究彎曲型和直立型大豆的RSTZ細胞學解剖結構特征, 發現彎曲型株系維管形成層較寬、次生木質部細胞層數較多、細胞形狀不規則(圖1-B), 表明不同類型株系RSTZ維管形成層分化可能是導致形態發生差異的重要因素。

2.2 彎曲型與直立型株系的根莖過渡區化學組分比較

為探究大豆莖稈化學組分與RSTZ形態特征之間的關系, 對2種類型各40份大豆莖稈的粗纖維、纖維素和木質素含量進行檢測。結果表明,M雜交后代中大豆莖稈的粗纖維含量分布于45%～57%, 纖維素含量分布于46%～57%, 木質素含量分布于9%～ 15% (圖2)。將直立型和彎曲型植株的木質素、纖維素、粗纖維按其含量范圍進行劃分, 2種表型RSTZ的粗纖維含量集中分布在49%～55%, 其中直立株系的粗纖維含量較彎曲型植株更高(圖2-A); 77%的直立型RSTZ組織中纖維素含量高于50%, 而70%的彎曲型RSTZ組織中纖維素含量低于50% (圖2-B); 此外, 直立型RSTZ組織中木質素含量高于11%的占77%, 而在彎曲型中僅占32% (圖2-C)。RSTZ部位的直立型與彎曲型莖稈中粗纖維與木質素含量呈現顯著差異, 纖維素沒有明顯差異(圖2-D～F)。表明大豆的RSTZ形態與其莖桿的化學組分密切相關, 且木質素、粗纖維含量高的植株RSTZ不易發生彎曲。

2.3 大豆根莖過渡區形態的遺傳定位

2.3.1 BSA-seq數據質量評估 選取RIL群體中30個直立型和30個彎曲型株系分別提取DNA并構建混池, 與2個親本中黃13和突變體M在Illumina測序平臺進行測序。對初始測序數據進行質量評估, 樣品的測序數據質量評估如表1所示。過濾后的堿基數量為85.53 Gbps, 檢測各樣品的插入片段大小分布情況符合正態分布, 4個混池測序文庫中堿基質量值高于30的百分比分別為94.85%、94.54%、94.54%和94.56%, 即Q30>94.54%, GC含量在35.10%以上, 將獲得的高質量測序數據比對到大豆參考基因組上(Wm82.a2.v1), 平均比對率為97.99%, 基因組覆蓋度為95.00% (至少1個堿基覆蓋)。這些參數說明本次測序得到的數據數量和質量均可達到后續分析的要求, 為進一步開展大豆RSTZ形態性狀候選基因的挖掘提供可靠位點信息。

圖1 根莖過渡區直立型與彎曲型植株及其解剖結構比較

A: VC、V6、R5、R8時期根莖過渡區直立型與彎曲型大豆植株; B: R5時期直立型與彎曲型株系下胚軸解剖結構。Vc: 維管形成層; Sx: 次生木質部; Sp: 次生韌皮部。A圖標尺表示2 cm, B圖標尺表示50 μm。VC: 子葉期; V6: 六葉期; R5: 始粒期; R8: 完熟期。

A: soybean plants with vertical or curved RSTZ at the VC, V6, R5, and R8 stages; B: the anatomical structure of hypocotyl for vertical and curved lines at R5 stage; Vc: vascular cambium; Sx: secondary xylem; Sp: secondary phloem. Bar: 2 cm (A) and 50mm (B). VC: at cotyledon stage; V6: at six leaves stage; R5: at beginning seed stage; R8: at maturity stage.

圖2 彎曲型與直立型根莖過渡區的化學組分分布及比較

A、B、C分別為彎曲型與直立型根莖過渡區中粗纖維、纖維素、木質素化學組分分布圖; D、E、F柱狀圖代表平均值±標準差(*:< 0.05, **:< 0.01,檢驗)。

A, B, and C are the distribution maps of chemical components of crude fiber, cellulose, and lignin in the vertical and curved root-stem transition zone, respectively; D, E, F: histogram represents mean ± SD (*:< 0.05, **:< 0.01,-test).

表1 樣品測序數據的質量評估

2.3.2 大豆根莖過渡區形態的關聯分析 通過GATK軟件獲取不同文庫間的SNP及InDel變異信息, 在親本樣品池中共鑒定到2,116,251個SNP和376,054個Indel; 2個混合池中共鑒定到395,607個SNP和87,769個Indel。采用delta-SNP-index方法進行基因組關聯分析, 以99%置信度為篩選閾值在19號染色體上關聯到1個候選區域, 總長為3.01 Mb (物理位置Chr19: 43,030,943～46,037,125 bp), 共包含346個基因(圖3-A和表2)。采用delta-InDel-index方法進行基因組關聯分析, 以99%置信度為篩選閾值在19號染色體上定位到1個候選區域, 總長為2.87 Mb (物理位置Chr19:42,975,089～45,849,854 bp), 共包含323個基因(圖3-B和表2)。2種關聯分析方法定位到的候選區域與Soybase中已收錄的5個倒伏候選位點重合, 分別是、、、和, 表明該候選區域具有較高的可信度, 可用于候選基因挖掘。

2.4 大豆根莖過渡區形態的候選基因挖掘

使用GO數據庫將一致性區間內319個候選基因按照生物過程(biological process)、細胞成分(cellular component)和分子功能(molecular function)進行基因功能分類。結果顯示, 大部分基因參與細胞壁/膜的生物合成、輔酶的運輸與代謝、碳水化合物的轉運與代謝以及對植物激素激活等信號通路(圖4)。基于基因功能注釋以及生物信息學分析, 篩選參與細胞分化、調控纖維素合成、木質素分解代謝、粗纖維合成相關途徑, 鑒定到4個候選基因, 分別為參與纖維素生物合成過程、向重力性以及正向調節細胞增殖的(GO:0016570); 參與細胞壁大分子代謝過程、木質部發育的(GO:0008152); 參與纖維素代謝過程的(GO:0001557)以及編碼細胞壁果膠酯酶合成基因(GO:0042545)。這些代謝過程已被證明與根莖組織的形態變化以及莖稈的生長習性相關[33], 表明候選基因可能在調控大豆RSTZ形態結構變異中發揮重要作用。

本研究利用Phytozome數據庫中已收錄大豆不同組織部位RNA-Seq數據, 分析一致性關聯區間內319個基因的組織表達特點, 結果顯示6個基因在大豆莖或根中表達高并聚類到相同分枝上(圖5), 它們分別是、、、、、, 也可能是調控RSTZ形態的候選基因。

圖3 SNP-index和InDel-index關聯值在染色體上的分布

RSTZ兩種類型的delta-SNP-index (A)和delta-InDel-index (B)擬合圖; 橫坐標表示染色體的位置, 黑色曲線表示相應的關聯值, 最上側的紅線代表置信度為99%的閾值線, 紅色箭頭指示定位的候選區域。

Delta-SNP-index (A) and delta-InDel-index (B) fitting plots for two types of RSTZ. The abscissa indicates the position of chromosomes and the black curve represents the associated values of each site, while the top red line indicates the threshold line with the confidence level of 99%. The red arrow points to the candidate region for positioning.

表2 BSA-seq關聯分析獲得大豆根莖過渡區形態的候選區域

圖4 候選區域內基因GO注釋分類

橫坐標為GO各分類內容, 縱坐標左邊和右邊分別表示基因數目所占百分比和基因數目。

The horizontal axis indicates the GO classification terms, while the left and right of the vertical axis represent the percentage of genes and the number of genes, respectively.

圖5 一致性關聯區間內所有基因在不同大豆組織中的表達水平聚類熱圖

為進一步鑒定以上候選基因在后代中的表達水平, 取RSTZ組織彎曲型和直立型株系, 通過qRT-PCR分析上述10個候選基因的表達水平(圖6)。以直立型植株中的表達水平作為對照, 結果顯示,、、在彎曲型株系中的表達水平顯著上調。、、、在彎曲型株系中的表達水平顯著下調。綜合以上分析結果, 最終得到7個可能調控大豆RSTZ形態的候選基因, 分別為、、、、、、。

圖6 根莖過渡區彎曲型和直立型株系中候選基因表達水平比較

用作內參, 候選基因在不同株系中的相對表達量進行檢驗(*:< 0.05; **:< 0.01; ***:< 0.001)。

The relative expression levels of candidate genes in different lines were tested by-test (*:< 0.05, **:< 0.01, and ***:< 0.001) usingas the internal reference.

2.5 大豆根莖過渡區形態候選基因的遺傳多樣性分析

利用大豆基因組數據庫(https://yanglab.hzau. edu.cn/SoyGVD/#/)已收錄的588份野生大豆、1253份地方品種和2573份育成品種的變異信息對候選基因進行遺傳多樣性及進化分析[34]。發現來自于全球的4414份大豆材料中,、、、、、、分別具有7種、7種、4種、10種、3種、3種和5種不同單倍型(表3)。其中, 候選基因的hap0單倍型在地方品種中分布頻率為0.737, 在選育品種中分布頻率為0.862, 且hap3單倍型在地方品種和育成品種中均不存在, 而野生大豆中的4種不同單倍型均勻分布, 該基因的核苷酸多態性(π)在野生大豆群體中為0.00373, 栽培大豆群體中為0.00173, 兩群體間的遺傳分化指數(ST)為0.26, 表明可能是大豆早期抗倒伏能力馴化的關鍵事件, 其中hap0為大豆較高抗倒伏能力提升的優異單倍型。候選基因的hap4單倍型在野生大豆中分布頻率為0.811, 在地方品種和育成品種中分布頻率分別為0.002、0.003, 該基因π值在野生大豆群體中為0.00170, 栽培大豆群體中為0.001,07, 野生大豆與栽培大豆群體間的ST值為0.32, 結果分析表明可能是野生大豆RSTZ形態馴化的關鍵事件。候選基因的hap0單倍型在地方和育成品種中分布頻率分別為0.437、0.512, 在野生品種中分布頻率為0.05, 該基因的π值在野生大豆群體中為0.00195, 栽培大豆群體中為0.00123, 兩群體間的ST值為0.28, 該基因和候選基因分析一致, 表明也可能是大豆早期選擇影響RSTZ形態的關鍵事件, 且hap0單倍型植株被選擇性保留。

3 討論

3.1 大豆根莖過渡區形態特征與其解剖結構的關系

維管組織由木質部和韌皮部組成, 在植物整個生命周期中不斷形成新的組織和器官, 并在它們之間運輸各種分子, 對植物的生長和發育至關重要[35-37]。大豆根和莖作為營養物質運輸的主要途徑, 并對植株起支撐作用, 其中銜接植株根和莖的過渡區域(RSTZ)也被稱為維管束過渡區。從根到莖的轉變, RSTZ會伴隨著維管組織的分化, 維管柱變粗, 同時木質部的位置和方向也發生轉變, 經過一系列的細胞分裂和分化, 最終將二者結構緊密連接起來。前人對野生大豆和栽培大豆營養器官和生殖器官進行解剖學結構分析, 發現野生型大豆初生維管組織系統的連接, 以子葉節為中心, 具有一個過渡區和一個連接區, 在面對不同的生長環境和生理條件下, 維管組織中木質部、韌皮部表現較高重塑性[38-39]。因此了解維管組織隨莖稈形態結構的變化, 對其解剖結構進行分析, 有利于預測和維持植株未來的生長和產量情況。本試驗比較大豆根莖過渡區彎曲型與直立型的解剖結構的特點發現, RSTZ表型變化與根莖組織中形成層密度、木質部細胞層數密切相關。

表3 大豆根莖過渡區形態候選基因的遺傳多樣性分析

*表示候選基因不同單倍型分別在野生品種、地方品種和育成品種中的分布頻率。π中表示核苷酸多態性,ST: 遺傳分化指數。

*: the distribution frequency of candidate genes different haplotypes in wild, landraces, and cultivar; π: the nucleotide diversity,ST: genetic differentiation index.

3.2 大豆根莖過渡區形態特征與其化學組分的關系

木質素是一種光敏酚類化合物, 也是植物細胞壁的骨架物質, 能夠提高細胞壁硬度、機械支持力、抗壓強度, 還能促進機械組織形成, 因此木質素含量的增加可顯著增強莖稈抗壓和抗倒伏能力[21-24,40-42]。木質素合成途徑涉及到許多酶促作用, 是一個非常復雜的過程。由于木質素重要的生物學功能, 近年來有關木質素合成途徑中的機制研究越來越多, 不僅研究水平逐漸深入, 而且還涉及植物體內的多條途徑, 有關基因表達調控和基因功能分析的報道逐漸增多。最近一項研究遮蔭對莖稈中木質素代謝的影響表明, 木質素含量減少會導致莖稈變細、較脆弱。遮蔭降低了參與木質素生物合成的苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase, PAL)、過氧化物酶(peroxidase, POD)、4-香豆酸輔酶A連接酶(4-coumaric acid coenzyme aligase, 4-CL)和肉桂醇脫氫酶(cinnamyl alcohol dehydrogenase, CAD)的代謝活性, 莖的維管束和厚壁組織細胞中木質素沉積減少, 引起莖彎曲和生長遲緩, 其中、和為小麥莖稈木質素代謝的關鍵酶基因[43-46];、、、為油菜莖稈木質素代謝的關鍵酶基因, 其表達量與木質素含量呈顯著正相關;、、和為亞麻木質部木質素代謝的關鍵酶基因[45]。通過探究大豆莖稈化學組分與RSTZ形態特征之間的關系, 分析2種類型莖稈中粗纖維、纖維素、木質素的含量。本研究發現RSTZ直立型植株的3種化學組分含量顯著高于彎曲型植株, 表明大豆的RSTZ形態特征與其莖桿的化學組分密切相關。本研究中, 在篩選影響RSTZ形態特征的候選基因中, 其中和主要是參與莖稈次生細胞壁纖維與細胞壁相關組分的合成和代謝過程。結合實時熒光定量結果和化學組分分析可知,、可能在參與木質素、纖維素合成中起到負調控作用。植物細胞壁的強大纖絲網狀結構可為細胞及整個植物體提供機械支持作用, 而且纖維素和木質素是細胞壁的主要成分, 纖維素和木質素對維持莖稈強度具有明顯的促進作用, 進而對保持莖稈形態穩定有一定的優勢, 最終表現出植株對不良環境更強的適應性[39,47]。因此,和候選基因為探究化學組分影響RSTZ形態建成提供新的思路。

3.3 大豆根莖過渡區與倒伏相關候選基因分析

對影響倒伏相關基因的挖掘一直是大豆生物學領域的熱點[48]。Hwang等[48]利用Harosoy和Clark雜交群體進行大豆抗倒伏QTL定位, 結果在大豆遺傳圖譜上鑒定到88個潛在QTL。通過對16個顯著的QTL聚類, 其中14個在2個或2個以上的定位群體中或在不同環境條件下的單個群體中得到了證實,被認為是最穩定的QTL[49]。劉碩等[50]對已經報道過的QTL信息進行整合, 鑒定出了6個重演性較好的QTL區間, 分別位于6號、13號和19號染色體上, 進一步篩選獲得了一個穩定性較高的分子標記Satt277,為大豆抗倒伏分子標記和抗倒伏基因挖掘提供參考。本研究對控制RSTZ彎曲相關基因進行初步定位, 鑒定到19號染色體上與RSTZ彎曲顯著相關的QTL, 并與Soybase中已收錄的多個倒伏候選位點(、、、和)物理位置重合, 進一步鑒定到7個候選基因。其中,和分別功能注釋為參與纖維素生物合成、木質素分解代謝過程, 通過不同類型的RSTZ化學組分分析發現直立型株系中粗纖維與木質素含量顯著高于彎曲型株系, 然而表達水平顯著低于彎曲型株系(圖2和圖6), 表明、可能在參與木質素、纖維素合成中起到負調控作用。編碼果膠甲酯酶(pectin methylesterase, PME), 催化果膠去酯化為果膠酸鹽和甲醇。果膠是植物細胞壁的主要成分之一, 在植物生長、形態和植物防御中具有重要作用[51]。研究發現, PME能夠參與細胞壁的纖維素和果膠加工過程, 通過影響莖的伸長調控植物生長發育[52]。擬南芥突變體中果膠甲酯酶活性降低, 導致莖倒伏, 表明PME活性參與調節植株抗倒伏能力[53]。根據注釋信息,與植物細胞的氧化還原酶活性相關,參與細胞壁大分子代謝過程、木質部發育,潛在參與植物器官形態發生以及分生組織生長,功能注釋與細胞壁生物發生、葡糖醛酸木聚糖代謝過程、木聚糖生物合成過程相關。通過序列比對, 發現上述7個候選基因的啟動子和編碼區在雙親中無變異位點。進一步對自然群體4414份大豆材料的遺傳多樣性分析, 可知、和在大豆馴化中存在選擇性清除現象, 其中的hap0單倍型、的hap4單倍型、的hap0單倍型可能在大豆馴化中參與RSTZ形態建成, 對于大豆抗倒伏能力提升發揮重要作用。

已有研究報道表明miRNAs在次生生長中至關重要, 其中過表達導致木質素沉積減少, 木質部導管和纖維次生細胞壁厚度減小[54]。Zhao等[55]介紹了miR857調控擬南芥轉錄, 進而影響次生木質部細胞壁中木質素的含量。結合細胞學解剖特征分析(圖1), 這些基因可能與miRNAs共同參與木質素的合成代謝, 通過調控單位面積的維管束數目、維管束鞘厚度影響RSTZ的發育, 進而影響大豆生長過程中RSTZ組織的形態變化。

4 結論

本研究對大豆根莖過渡區(RSTZ)進行解剖結構和化學組分鑒定, 并利用BSA-seq技術定位到19號染色體上與其表型顯著相關的2.87 Mb區間。結合生物信息學和轉綠組數據以及熒光定量分析, 最終得到7個可能調控大豆RSTZ形態的候選基因、、、、、和。其中,、和在大豆馴化中潛在影響RSTZ形態建成。本研究結果為解析大豆RSTZ組織形成及其遺傳基礎提供理論依據, 并為完善大豆抗倒伏株型提供新的見解。

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Identification and gene mapping of soybean mutantMin root-stem transition zone

MIAO Long1,**, SHU Kuo1,**, LI Juan1, HUANG Ru1, WANG Ye-Xing1, Soltani Muhammad YOUSOF1, XU Jing-Hao1, WU Chuan-Lei1, LI Jia-Jia1, WANG Xiao-Bo1,*, and QIU Li-Juan2,*

1College of Agriculture, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, Anhui, China;2Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / the National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement (NFCRI), the Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Crop Gene Resource and Germplasm Enhancement, the Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Beijing 100081, China

Root-stem transition zone (RSTZ) connects roots and stems, and its morphology modifies the structure of aerial part and lodging resistance potential in soybean. In this study, a soybean mutantM,appearing with curved or rotated RSTZ, was obtained by EMS mutagenesis. Its morphological characteristics were stably inherited and could provide specific sources for exploring the development patterns of soybean stems. Therefore, this mutant was crossed with Zhonghuang 13 to construct a recombinant inbred line population. By comparing the anatomical structure of vertical RSTZ and curved RSTZ, the wider vascular cambium, more secondary xylem cell layers and irregular cell shape were identified in curved lines, indicating that vascular cambium differentiation may be one of the important factors leading to the difference of RSTZ morphology. Subsequently, the chemical compositions of lines with vertical RSTZ or curved RSTZ were determined, respectively. It was found that the higher lignin and crude fiber content in the RSTZ, the more difficult to bend. The RSTZ with curved or vertical lines were further selected for BSA-seq. SNP-index and InDel-index methods were employed to mine a significant association region, Chr. 19: 43,030,943-45,849,854 containing 319 genes, which may regulate RSTZ morphology. Combined bioinformatics analysis, gene annotation information and expression abundance analysis, seven candidate genes (,,,,,,) were screened. Among them,,, andpotentially affected RSTZ morphogenesis in soybean domestication. This study not only provides germplasm resources for the understanding of soybean RSTZ tissue formation and its genetic basis, but also provides new insights for further exploration of genes regulating soybean stalk development.

soybean; root and stem transition zone; mutant; BSA-seq; candidate genes

10.3724/SP.J.1006.2024.34142

本研究由國家重點研發計劃項目(2021YFD1201605), 安徽省自然科學基金項目(2308085MC88, 2108085QC114)和安徽農業大學自然科學基金項目(k2031005)資助。

This study was supported by the National Key Research and Development Program of China (2021YFD1201605), the Natural Science Foundation of Anhui Province (2308085MC88, 2108085QC114), and the Natural Science Foundation Project of Anhui Agricultural University (k2031005).

王曉波, E-mail: wxbphd@163.com; 邱麗娟, E-mail: qiulijuan@caas.cn

**同等貢獻(Contributed equally to this work)

苗龍, E-mail: lmiao5@163.com; 舒闊, E-mail: 1125974604@qq.com

2023-07-20;

2024-01-12;

2024-02-08.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240205.1150.004

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