水稻雄性不育突變體tpa1的表型鑒定與精細(xì)定位

萬應(yīng)春 班義結(jié) 蔣鈺東 王亞欣 劉晶晶 劉曉晴 程育林 王 楠 馮 萍

水稻雄性不育突變體的表型鑒定與精細(xì)定位

萬應(yīng)春1,**班義結(jié)1,**蔣鈺東2,**王亞欣1劉晶晶1劉曉晴1程育林1王 楠1,*馮 萍1,*

1西南大學(xué)水稻研究所 / 轉(zhuǎn)基因植物與安全控制重慶市市級(jí)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 南方山地農(nóng)業(yè)教育部工程研究中心, 重慶 400716;2四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院德陽分院), 國家水稻改良中心四川瀘州分中心 / 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南水稻生物學(xué)與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 四川德陽 618000

雄性不育材料是雜交水稻育種的關(guān)鍵。本研究通過甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)誘變優(yōu)良秈稻保持系西農(nóng)1B, 篩選得到一個(gè)雄性不育突變體。在營養(yǎng)生長階段與野生型無差異, 生殖生長階段表現(xiàn)雄配子不育, 雌配子發(fā)育正常。表型觀察發(fā)現(xiàn),花粉完全破碎消失, 花藥外壁角質(zhì)層異常, 花藥內(nèi)壁烏式體排列異常, 胼胝質(zhì)合成異常, 絨氈層凋亡異常, 且花粉外壁缺失柱狀層。遺傳分析表明該突變性狀受1對(duì)隱性核基因控制, 利用突變體與縉恢10號(hào)構(gòu)建遺傳群體, 最終將基因定位于4號(hào)染色體引物標(biāo)記N9和N11之間, 物理距離為74 kb, 該區(qū)間共15個(gè)預(yù)測(cè)基因, 通過重測(cè)序僅發(fā)現(xiàn)在的外顯子上發(fā)生了單堿基替換, 導(dǎo)致了翻譯的提前終止, 隨后對(duì)野生型和突變體該位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序證實(shí)了這一突變, 因此將該基因確定為的候選基因,是一個(gè)未被報(bào)道過的新的雄性不育基因。本研究將為基因的功能研究奠定基礎(chǔ)。

水稻(L.); 雄性隱性核不育;; 精細(xì)定位

水稻是世界上主要糧食作物, 也是我國最重要的糧食作物之一, 同時(shí)水稻也是單子葉植物生物學(xué)研究的模式植物, 因此, 對(duì)于水稻的研究具有極為重要的應(yīng)用價(jià)值和科學(xué)價(jià)值。雜種優(yōu)勢(shì)是指雜交后代表現(xiàn)出優(yōu)于親本性狀的現(xiàn)象, 在植物中廣泛存在, 將雜種優(yōu)勢(shì)用于育種中能顯著提高作物的抗逆性和產(chǎn)量[1], 雄性不育材料是雜種優(yōu)勢(shì)育種的關(guān)鍵。雄性不育是指不能產(chǎn)生可育雄配子, 而雌配子正常, 將雄性不育突變體應(yīng)用于雜種優(yōu)勢(shì)育種中, 可極大的提高育種效率, 目前在多種作物的育種中都有應(yīng)用。

植物的育性涉及很多基因表達(dá)調(diào)控, 擁有極為復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[2], 目前已克隆的不育基因中雄性不育基因占大多數(shù)[3]。已克隆的雄性不育基因涉及到的生物學(xué)過程包括花粉減數(shù)分裂、絨氈層降解、花粉壁形成、花藥開裂、花粉管伸長等, 其中又以核基因?yàn)橹鱗4-5]。絨氈層是水稻花藥4層中的最內(nèi)層, 它為花粉粒的發(fā)育提供保護(hù)和必需的營養(yǎng), 并為花粉外壁的形成提供前體[6]。絨氈層在花粉母細(xì)胞形成早期初步開始形成, 在花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂初期開始啟動(dòng)細(xì)胞程序性死亡(programmed cell death, PCD), 絨氈層細(xì)胞逐步降解, 細(xì)胞質(zhì)濃縮, 在成熟花粉時(shí)期完全消失, 絨氈層的PCD過程是小孢子發(fā)育所必須的, 它為小孢子提供胼胝質(zhì)酶、孢粉素前體、同化物等[7]。在水稻中, 絨氈層的發(fā)育與降解十分重要, 絨氈層發(fā)育相關(guān)基因的異常會(huì)導(dǎo)致水稻小孢子的發(fā)育異常, 水稻中影響絨氈層形成的基因有OsMADS3、OsMADS8、MSP1、UDT1等[8-11], 這些基因的隱性突變會(huì)導(dǎo)致絨氈層的不完全發(fā)育, 最終導(dǎo)致雄性不育。而影響絨氈層降解的基因有TDR[12]、PTC1[13]、EAT1[14]、GAMYB[15]、OsUGE1[16]等, 這些基因的隱性突變會(huì)讓絨氈層PCD開始時(shí)期提前或延后, 不能在正確的時(shí)期為小孢子的發(fā)育提供所需物質(zhì), 最終導(dǎo)致小孢子發(fā)育異常。EAT1是一種在陸地植物中保守的基本螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子, 正調(diào)節(jié)水稻花藥絨氈層細(xì)胞的程序性細(xì)胞死亡,突變體的絨氈層PCD過程出現(xiàn)延遲,與互作, 調(diào)控絨氈層功能和花粉發(fā)育[14]。花粉粒被花粉壁包圍, 這可以保護(hù)雄性配子體免受各種環(huán)境壓力和微生物的攻擊, 也有利于授粉[17]。花粉壁是植物中最復(fù)雜的細(xì)胞壁, 由花粉外壁和花粉內(nèi)壁兩部分組成, 花粉外壁和花粉內(nèi)壁都有各種不同的組織模式[18]。花粉壁的形成是一個(gè)復(fù)雜的過程, 涉及大量基因的生物學(xué)事件發(fā)生, 已報(bào)道的OsC6[19]、DPW[20]、DPW2[21]、DPW3[22]均參與了花粉壁的形成, 其中DPW3編碼一種保守的新的膜相關(guān)α整合素蛋白,參與初生外壁形成、花粉外壁形成、烏氏體發(fā)育和花藥角質(zhì)層形成,植物的花藥表現(xiàn)出花藥表皮輪廓不均衡、烏氏體異常、胼胝質(zhì)沉積和花粉壁形成缺陷, 導(dǎo)致花粉敗育和完全雄性不育[22]。由此可見, 植物育性發(fā)育過程的每個(gè)環(huán)節(jié)均有由多個(gè)基因組成的復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò), 而對(duì)新的雄性不育基因的發(fā)掘?qū)⒂兄谖覀兘馕鲞@些復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

本研究通過EMS誘變秈稻保持系西農(nóng)1B, 獲得了一個(gè)可以穩(wěn)定遺傳的雄性不育突變體(tapetum and pollen abnormal 1)對(duì)突變體進(jìn)行表型鑒定, 發(fā)現(xiàn)該突變體的絨氈層和花粉壁發(fā)育異常, 進(jìn)一步對(duì)其遺傳分析和分子定位, 最終將定位在4號(hào)染色體上引物標(biāo)記為N9和N11之間。對(duì)定位區(qū)間的基因進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)該區(qū)間范圍內(nèi)尚未有已報(bào)道的雄性不育基因, 因此, 本研究結(jié)果將為水稻雄性不育和育種提供理論依據(jù)和種質(zhì)資源。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

水稻(L.)背景材料為秈稻保持系西農(nóng)1B(L.), 通過EMS誘變得到突變體, 經(jīng)過多代自交, 突變性狀穩(wěn)定遺傳。用秈稻恢復(fù)系縉恢10號(hào)與突變體雜交, 種植F1并收獲F2種子。本研究所用材料均由西南大學(xué)水稻研究所提供, 種植于西南大學(xué)歇馬試驗(yàn)基地和海南南繁基地。

1.2 表型鑒定和花粉育性觀察

對(duì)野生型和突變體的全生育期的植株表型進(jìn)行觀察, 并對(duì)成熟期的植株小穗、花藥進(jìn)行照相, 對(duì)成熟花粉使用1% I2-KI溶液(0.6% KI, 0.3% I2, w/w)進(jìn)行染色分析, 使用Eclipse E600561顯微鏡對(duì)花粉育性進(jìn)行觀察并照相。

1.3 掃描電鏡概觀察

在前人的研究中將水稻花藥發(fā)育分為14個(gè)時(shí)期[23]。隨機(jī)取野生型與突變體花粉已完成填充的第13期的小穗, 輕輕用鑷子剝開穎殼暴露其花藥,借助顯微鏡用鑷子剝開花藥, 暴露其花藥內(nèi)壁及花粉粒, 同時(shí)保留完整花藥。利用SU3500掃描電子顯微鏡(日立, 日本)在–20℃和5.0 kV的加速電壓下觀察整體花藥、花藥外壁、花藥內(nèi)壁和花粉粒形態(tài)并照相。

1.4 半薄切片觀察

為了觀察野生型和突變體的花藥發(fā)育情況,我們選取第8～12期的花藥并包埋。將花藥置于由0.1 mol L–1PBS (pH 7.4)配置的2.5%戊二醛中4℃中固定24 h, 然后用1%四氧化鋨在0.1 mol L–1PBS (pH 7.4)中滲透2 h。隨后, 樣品用梯度乙醇(50%、70%、85%、95%、100%、100%和100%)脫水, 并包埋在SPI-PON 812樹脂中。使用EM-UC6切片機(jī)制備半薄切片(2 μm), 用0.5%甲苯胺藍(lán)染色, 并用Eclipse E600顯微鏡照相。

1.5 透射電鏡觀察

選取野生型和突變體第10期的花藥用半薄切片所述包埋方法包埋進(jìn)樹脂中。使用EM-UC6切片機(jī)獲得超薄切片, 用醋酸鈾和檸檬酸鉛溶液染色, 并使用H-7500TEM進(jìn)行觀察和照相。

1.6 石蠟切片與胼胝質(zhì)染色

取第7～10期的野生型和突變體花藥置于FAA固定液中固定, 樣品用梯度乙醇(50%、70%、85%、95%、100%、100%和100%)脫水, 分別處理40 min; 將脫水完畢的花藥依次置于3∶1、1∶1、1∶3的無水乙醇和二甲苯的混合液中透明, 分別處理40 min; 逐漸加入石蠟進(jìn)行替換, 直至完全替換為石蠟, 并使石蠟完全浸透材料。將包埋完成的材料用石蠟切片機(jī)切片以獲得石蠟切片。用純二甲苯脫去石蠟切片的蠟, 并用梯度乙醇(100%、95%、85%、70%和50%)和磷酸緩沖液進(jìn)行復(fù)水, 用0.1%苯胺藍(lán)溶液對(duì)復(fù)水的材料進(jìn)行染色, 用熒光顯微鏡觀察并照相。

1.7 遺傳分析與精細(xì)定位

利用突變體與縉恢10號(hào)雜交獲得F1代, F1代自交獲得F2代分離群體, 統(tǒng)計(jì)F2代不育性狀分離情況并分析, 選取F2代中不育單株進(jìn)行初步定位與精細(xì)定位。利用CTAB法提取定位群體葉片DNA[24]。利用公開的水稻數(shù)據(jù)庫Gramene (http://www.gramene.org/)和水稻基因組研究計(jì)劃(http://rgp.dna.afrc.go. jp/E/publicdata/caps/index.html)開發(fā)多態(tài)性SSR (Simple Sequence Repeats)標(biāo)記(表1), 對(duì)定位群體進(jìn)行分子鑒定。PCR總體系為12.6 μL, 含1.25 μL 10×PCR buffer、1 μL 50 ng μL–1DNA模板、0.75 μL 25 mmol L–1MgCl2、0.5 μL 2.5 mmol L–1dNTPs、8.0 μL ddH2O、1.0 μL 10 μmol L–1引物、0.1 μL 5 U μL–1DNA聚合酶。PCR程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min; 94℃變性30 s, 55℃退火30 s, 72℃復(fù)性30 s, 35個(gè)循環(huán); 72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)10%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳, 快速銀染后觀察[25]。利用親本和突變體群體構(gòu)建基因池進(jìn)行全基因組重測(cè)序, 使用MutMap進(jìn)行分析, 比對(duì)親本與突變體在定位區(qū)間內(nèi)的序列差異, 隨后對(duì)突變位點(diǎn)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物對(duì)野生型與突變體進(jìn)行測(cè)序比對(duì)(表1)。

1.8 相關(guān)基因表達(dá)分析

用植物總RNA提取試劑盒(普洛麥格(北京)生物技術(shù)有限公司)提取野生型抽穗期各部位、野生型和突變體花藥第6～9期的RNA, 再用UeIris RT mix with DNase (All-in-One) (蘇州宇恒生物科技有限公司)反轉(zhuǎn)錄得到對(duì)應(yīng)的cDNA。根據(jù)中國國家水稻中心數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)(https://ricedata.cn/)設(shè)計(jì)定量引物(表1), 利用ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix (南京諾唯贊生物科技股份有限公司)進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR, 檢測(cè)候選基因在野生型各部位的表達(dá)水平, 檢測(cè)、、、、、、和基因在野生型和突變體中表達(dá)量的變化。

全世界槭樹科植物超過200 種，我國已知分布有151種,占全世界槭樹種類的75%。河南自然分布的槭樹共有2 屬、23種、2亞種、9變種, 約占全國槭樹科植物種類的15%，但擴(kuò)散成分豐富，過渡特征明顯[2]。其中既有華北五角楓、茶條槭等景觀價(jià)值很高的種類，也有河南杈葉槭、小杈葉槭等河南特有分布種類。

表1 本研究使用的部分引物

(續(xù)表1)

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體tpa1的表型分析

在田間對(duì)野生型和突變體進(jìn)行整個(gè)生育期的表型觀察, 發(fā)現(xiàn)突變體與野生型在營養(yǎng)生長階段沒有明顯差異, 而在生殖生長階段, 與野生型相比, 突變體表現(xiàn)出完全不能結(jié)實(shí)的表型(圖1-A, B)。為了觀察花藥整體形態(tài), 將第13期花藥置于體視鏡下觀察, 野生型花藥顏色呈黃色, 每顆的4個(gè)花藥室飽滿, 而突變體花藥較野生型更為細(xì)小, 干癟, 顏色呈暗黃色(圖1-C, D, F, G)。為對(duì)花粉活性進(jìn)行觀察, 我們利用1% I2-KI溶液對(duì)花粉進(jìn)行染色, 發(fā)現(xiàn)野生型花粉圓潤飽滿, 被染色為黑褐色, 而突變體完全無花粉(圖1-E, H), 表明突變體的花粉發(fā)育異常。進(jìn)一步通過掃描電鏡對(duì)后期花藥進(jìn)行觀察, 與野生型相比, 突變體花藥更短, 花藥室更干癟(圖1-I, J)。野生型花藥外壁可觀察到網(wǎng)格狀的蠟質(zhì)層結(jié)構(gòu), 突變體的花藥外壁較野生型更為光滑, 網(wǎng)格狀角質(zhì)層不明顯(圖1-K, N)。對(duì)花藥內(nèi)壁進(jìn)行觀察, 野生型的花藥內(nèi)壁有致密的排列整齊的烏氏體, 而突變體的花藥內(nèi)壁烏氏體數(shù)量減少, 排布混亂(圖1-L, O)。剝開花藥, 野生型可見大量圓形飽滿的花粉粒, 而突變體只有少量干癟破碎花粉(圖1-M, P)。以上結(jié)果表明突變體花藥外壁角質(zhì)層和內(nèi)壁烏氏體都出現(xiàn)了異常, 并且最終不能形成花粉。

2.2 突變體tpa1花藥切片分析

為了進(jìn)一步探究突變體花藥發(fā)育異常的原因, 對(duì)第8～12期的野生型和突變體花藥進(jìn)行了半薄切片觀察。在第8b期, 野生型小孢子正在進(jìn)行減數(shù)分裂的最后步驟, 形成四分體小孢子, 絨氈層開始變得濃縮, 此時(shí)突變體與野生型并無明顯差異(圖2-A, F)。在第9期時(shí), 野生型絨氈層繼續(xù)降解, 進(jìn)一步濃縮, 細(xì)胞變得不規(guī)則, 而突變體的絨氈層整體形態(tài)平整, 且比野生型更厚(圖2-B, G); 在第10期時(shí), 野生型的絨氈層進(jìn)一步發(fā)生降解, 明顯濃縮變窄, 小孢子開始變大空泡化, 而突變體的絨氈層開始降解, 出現(xiàn)不規(guī)則的形態(tài), 依然比野生型更厚, 小孢子也開始空泡化, 但小孢子壁較野生型更為明顯(圖2-C, H)。在第11期時(shí), 野生型和突變體的絨氈層降解程度增加, 野生型小孢子呈鐮刀形, 而突變體小孢子部分出現(xiàn)鐮刀形, 且小孢子壁更明顯(圖2-D, I)。在第12期時(shí), 野生型小孢子開始正常填充淀粉, 而突變體不能正常進(jìn)行填充, 小孢子逐漸破碎, 發(fā)生敗育(圖2-E, J)。以上結(jié)果表明突變體絨氈層降解異常且小孢子壁發(fā)育異常。為進(jìn)一步觀察在絨氈層與小孢子壁的變化, 對(duì)第10期時(shí)野生型和的花藥進(jìn)行超薄切片并在透射電鏡下進(jìn)一步觀察。在第10期, 野生型的絨氈層細(xì)胞核結(jié)構(gòu)基本消失, 細(xì)胞器減少, 小孢子外壁具備明顯的外壁外層、柱狀層、外壁內(nèi)層3層結(jié)構(gòu)(圖2-K～M)。而的絨氈層中也出現(xiàn)了降解的現(xiàn)象, 細(xì)胞質(zhì)濃縮, 細(xì)胞器消失, 但還能觀察到擁有清晰核膜的細(xì)胞核和少量線粒體, 進(jìn)一步觀察此時(shí)突變體的小孢子外壁可以發(fā)現(xiàn), 由于缺少了柱狀層外壁外層與外壁內(nèi)層貼合在一起(圖2-N～ P)。該結(jié)果表明突變體的絨氈層降解延遲, 且小孢子外壁柱狀層缺失, 最終導(dǎo)致了花粉的敗育。

圖1 野生型西農(nóng)1B與突變體tpa1育性觀察與掃描電鏡觀察

A, B: 野生型和突變體植株; C, D: 野生型和突變體小穗; E: 野生型花粉碘染; F: 野生型去殼后小花; G: 突變體去殼后小花; H: 突變體花粉碘染; I～P: 掃描電鏡觀察; I, J: 野生型和突變體花藥; K: 野生型花藥外壁; L: 野生型花藥內(nèi)壁; M: 野生型花藥剝開露出花粉; N: 突變體花藥外壁; O: 突變體花藥內(nèi)壁; P: 突變體花藥剝開露出花粉。標(biāo)尺: 10 cm (A, B); 1 mm (C, F); 0.5 mm (D, G); 0.1 mm (E, H); 100 μm (I, J); 10 μm (K～P)。

A, B:plants of wild type and mutant; C, D: spikelet of wild type and mutant;E: pollen iodine staining of wild type; F: spikelet of wild type; G: spikelet of mutant; H: pollen iodine staining of mutant; I–P: SEM observation; I, J: anthers of wild type and mutant; K: outer wall of wild type anther; L: inner wall of wild type anther; M: wild type anthers peeled out pollen; N: anther outer wall of mutant; O: the inner wall of anther of mutant; P: the anther of mutantpeeled and exposed pollen. Bar: 10 cm (A, B), 1 mm (C, F), 0.5 mm (D, G), 0.1 mm (E, H), 100 μm (I, J), 10 μm (K–P).

(圖2)

A～E: 野生型st8b～st12期花藥半薄切片橫切; F～J: 突變體st8a～st12期花藥半薄切片橫切; K～M: 野生型st10期花藥超薄切片透射電鏡觀察; N～P: 突變體st10期花藥超薄切片透射電鏡觀察。Ba: 柱狀層; BP: 雙核花粉; dMsp: 異常小孢子母細(xì)胞; Dy: 二分體細(xì)胞; E: 表皮; En: 內(nèi)皮; ML: 中間層; MP: 成熟花粉; Msp: 小孢子母細(xì)胞; N: 細(xì)胞核; Ne: 外壁內(nèi)層; Nm: 核膜; T: 絨氈層; Tds: 四分體; Ub: 烏式體。標(biāo)尺: 200 μm (A～J); 2 μm (K, N); 1 μm (L, O); 0.5 μm (M, P)。

A–E: section-thin sections of wild type anthers from st8b–st12; F–J: section-thin sections ofanthers from st8b–st12; K–M: TEM of wild type st10 anther ultra-thin sections; N–P: TEM ofst10 anther ultra-thin sections. Ba: bacula; BP: binuclear pollen; dMsp: abnormal microspore mother cells; Dy: dyad cells; E: epidermis; En: endothelium; ML: middle layer; MP: mature pollen; Msp: microspore mother cells; N: nucleus; Ne: nexine; Nm: nuclear membrane; T: tapetum; Tds: tetrad; Ub: Ubisch body. Bar: 200 μm (A–J); 2 μm (K, N); 1 μm (L, O); 0.5 μm (M, P).

2.3 tpa1胼胝質(zhì)染色

胼胝質(zhì)是小孢子在有絲分裂前包裹在小孢子外的一類物質(zhì), 具有保護(hù)小孢子的作用, 有研究表明, 胼胝質(zhì)的異常也會(huì)導(dǎo)致小孢子的敗育[26]。用0.1%苯胺藍(lán)對(duì)野生型和突變體胼胝質(zhì)進(jìn)行染色觀察。在第7期時(shí), 野生型胼胝質(zhì)信號(hào)集中在小孢子中間, 突變體的胼胝質(zhì)信號(hào)較野生型更弱(圖3-A, E); 第8a期, 野生型胼胝質(zhì)信號(hào)包裹著二分體小孢子, 突變體只能觀察到少量的微弱胼胝質(zhì)信號(hào)(圖3-B, F); 第8b期, 二分體進(jìn)一步分裂形成四分體小孢子,此時(shí)野生型中胼胝質(zhì)信號(hào)存在于2個(gè)四分體小孢子的中間, 而突變體胼胝質(zhì)信號(hào)較野生型更弱(圖3-C, G); 在第9期, 野生型胼胝質(zhì)降解完全, 四分體小孢子完成釋放, 野生型與突變體都不能觀察到胼胝質(zhì)信號(hào)(圖3-D, H)。以上結(jié)果表明胼胝質(zhì)代謝出現(xiàn)異常。

2.4 TPA1基因的精細(xì)定位

用縉恢10號(hào)與突變體雜交得到F1代, F1代全部正常結(jié)實(shí), 表明不育性狀受隱性基因控制。F1代自交得到F2代群體, F2代群體中出現(xiàn)明顯的分離。分別表現(xiàn)雙親性狀, 其中有1202株可育單株, 422株不育突變體, 遺傳分析表明可育表型與不育表型符合3∶1分離比, 表明的突變性狀受隱性單基因控制(表2)。選取F2代中10株正常株和30株突變株的DNA作為正常基因池和突變基因池, 利用本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的平均分布于12條染色體的SSR引物對(duì)正常株和不育株的基因池進(jìn)行連鎖及多態(tài)性分析。結(jié)果表明, 在4號(hào)染色體的分子標(biāo)記R7和R8與突變位點(diǎn)連鎖, 通過突變單株驗(yàn)證及分析, 將突變位點(diǎn)定位在R7和R8之間(圖4)。進(jìn)一步在R7和R8之間開發(fā)多態(tài)性分子標(biāo)記, 利用F2群體中422株突變體進(jìn)行進(jìn)一步精細(xì)定位, 最終突變位點(diǎn)定位在引物N9和N11之間, 物理距離為74 kb的范圍內(nèi), 根據(jù)谷類比較圖譜資源數(shù)據(jù)庫(http:// www.gramene.org/microsat)以及國家水稻數(shù)據(jù)中心(http://www.ricedata.cn/)的數(shù)據(jù)查閱得知, 該區(qū)間內(nèi)有15個(gè)預(yù)測(cè)基因(圖4-A)。對(duì)這15個(gè)預(yù)測(cè)基因進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)無已報(bào)道的育性相關(guān)基因, 表明可能是一個(gè)從未被發(fā)現(xiàn)報(bào)道過參與育性調(diào)控的基因(表3)。為了進(jìn)一步確定突變位點(diǎn)所在基因, 利用基于基因組重測(cè)序技術(shù)的Mut-map方法, 對(duì)區(qū)間內(nèi)的基因進(jìn)行突變位點(diǎn)篩選, 僅在的一個(gè)外顯子處發(fā)現(xiàn)了一個(gè)堿基替換, 由“G”堿基突變?yōu)椤癟”堿基, 對(duì)應(yīng)氨基酸由谷氨酸變?yōu)榱私K止密碼子, 導(dǎo)致了翻譯的提前終止(圖4-A, B)。為驗(yàn)證該結(jié)果, 設(shè)計(jì)了該突變位點(diǎn)的檢測(cè)引物, 從親本中分別選取了10株野生型和10株突變體進(jìn)行測(cè)序, 發(fā)現(xiàn)野生型均為AA或Aa基因型, 突變體均為aa基因型(圖4-C)。因此將定為的候選基因。

圖3 野生型與突變體tpa1胼胝質(zhì)染色

A～D: 野生型st7～st9期胼胝質(zhì)染色; E～H:突變體st7～st9期胼胝質(zhì)染色。標(biāo)尺: 200 μm (A～H)。

A–D: callose staining of wild type anthers from stages st7 to st9; E–H: callose staining of mutantanthers from stages st7 to st9. Bar: 200 μm (A–H).

表2 突變體tpa1的遺傳分析

表3 精細(xì)定位區(qū)間預(yù)測(cè)基因

(續(xù)表3)

圖4 TPA1基因的精細(xì)定位

A:初步定位與精細(xì)定位; B: 野生型與突變體重測(cè)序結(jié)果分析; C: 野生型與突變體突變位點(diǎn)測(cè)序結(jié)果。

A: preliminary positioning and fine positioning of; B: the resequencing results of wild type and mutant; C: wild type and mutantmutation site sequencing results.

2.5 相關(guān)基因表達(dá)分析

為探究在水稻各部位中的表達(dá)水平, 通過RT-qPCR分析了在水稻抽穗期各部位以及第6～11期的小穗中的表達(dá)水平, 結(jié)果表明,在葉、鞘和花藥中有較高水平表達(dá), 而在花藥發(fā)育第6～12期中,的表達(dá)水平幾乎一致, 并沒有在某個(gè)時(shí)期特異高表達(dá)(圖5-A)。在表型分析中, 我們發(fā)現(xiàn)了突變體在絨氈層的發(fā)育上存在缺陷, 為了探究與哪些基因可能在同一途徑發(fā)揮功能, 對(duì)突變體中絨氈層發(fā)育相關(guān)基因做了RT-qPCR分析。結(jié)果表明,、和在野生型與突變體中表達(dá)量無明顯差異,、、在突變體第9期中表達(dá)量較野生型有明顯下降,在突變體中第7、8期表達(dá)量都明顯低于野生型。推測(cè)可能是與、、共同參與了絨氈層發(fā)育的調(diào)控, 且在調(diào)控過程中可能與有更緊密的聯(lián)系, 還有待進(jìn)一步的探索(圖5-B)。

A:在野生型水稻抽穗期各部位以及第6～12期的小穗中的表達(dá)水平; B: 絨氈層發(fā)育相關(guān)基因在野生型與突變體第6～9期的表達(dá)水平。

A: the relative expression level ofgenes in different parts of heading stage and spikelets of st6–st12 in wild-type rice; B: the relative expression level of tapetum development-related genes in wild type and mutantat st6–st9 stage.

3 討論

3.1 TPA1影響水稻育性

突變體在營養(yǎng)生長階段與野生型無明顯差異, 而生殖生長階段表現(xiàn)出完全不能結(jié)實(shí), 進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn),的花藥外壁存在缺陷, 花藥內(nèi)壁烏氏體不明顯且排布不規(guī)則, 花藥絨氈層凋亡延遲, 胼胝質(zhì)合成異常, 且花粉外壁缺失柱狀層, 這些綜合表現(xiàn)最終導(dǎo)致了的花粉敗育。絨氈層是植物花藥最內(nèi)部的一層細(xì)胞, 它不光為小孢子的發(fā)育提供了保護(hù), 也會(huì)在適當(dāng)?shù)臅r(shí)機(jī)提供營養(yǎng)物質(zhì)和酶, 以保障小孢子的正常發(fā)育[27]。在花藥發(fā)育早期, 胼胝質(zhì)依賴絨氈層進(jìn)行合成, 而減數(shù)分裂時(shí)期, 絨氈層又通過分泌胼胝質(zhì)酶調(diào)控胼胝質(zhì)的正常降解, 以在合適的時(shí)候釋放四分體小孢子[28]。在突變體中, 在第7期胼胝質(zhì)發(fā)生了異常, 胼胝質(zhì)的含量明顯減少, 之后在第8a期和8b期時(shí)突變體中胼胝質(zhì)含量都低于野生型, 表明突變體胼胝質(zhì)的合成存在異常,的絨氈層可能在早期就出現(xiàn)了物質(zhì)合成方面的異常。烏氏體是絨氈層上的一種細(xì)胞器, 參與了花粉外壁的合成, 主要包括孢粉素, 致密電子的轉(zhuǎn)運(yùn)[29], 突變體中烏式體的減少且花粉外壁缺失柱狀層, 推測(cè)絨氈層的異常導(dǎo)致孢粉素等物質(zhì)的合成與運(yùn)輸出現(xiàn)了異常, 綜合因素導(dǎo)致了突變體花粉外壁柱狀層的缺失, 進(jìn)而導(dǎo)致了花粉無法正常填充, 最終發(fā)生敗育。

3.2 TPA1是一個(gè)新基因

通過精細(xì)定位, 我們最終將定位于4號(hào)染色體上引物標(biāo)記N9和N11之間, 物理距離約為74 kb, 在該區(qū)間共有預(yù)測(cè)基因15個(gè), 隨后利用重測(cè)序技術(shù)在一個(gè)未被報(bào)道的基因的外顯子上發(fā)現(xiàn)了一處堿基替換, 該突變導(dǎo)致了翻譯的提前終止, 并且通過對(duì)野生型和突變體該位點(diǎn)進(jìn)行測(cè)序, 證實(shí)了這一突變結(jié)果, 因此我們將定為的候選基因。通過對(duì)的注釋信息進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn), 該基因全長12,594 bp, CDS序列長度為7848 bp, 共有14個(gè)外顯子, 突變體的突變位點(diǎn)位于第14外顯子上。對(duì)蛋白結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析, 共發(fā)現(xiàn)3個(gè)結(jié)構(gòu)域, 包含1個(gè)位于N端的Npa1結(jié)構(gòu)域和2個(gè)連續(xù)的位于C端的NopRA1結(jié)構(gòu)域, 這些結(jié)構(gòu)域都被注釋在60S核糖體大亞基發(fā)生過程中發(fā)揮重要功能。為了探究TPA1在水稻中可能的功能, 對(duì)TPA1同家族基因在其他物種中研究結(jié)果進(jìn)行了分析, 在釀酒酵母中, IVA′NV等發(fā)現(xiàn)Npa1p在60S核糖體早期成熟過程中發(fā)揮重要作用[30]; Shan等[31]發(fā)現(xiàn)URB1在核仁中3′ETS rRNA的去除過程發(fā)揮功能, 缺失URB1會(huì)影響斑馬魚和小鼠的胚胎發(fā)育; He等[33]還發(fā)現(xiàn)URB1還通過影響核糖體的組裝進(jìn)而影響了斑馬魚消化器官的發(fā)育[32]; 玉米中的突變體60S核糖體與40S核糖體積累出現(xiàn)異常, 導(dǎo)致籽粒長度減少。此外, 在已有的研究中, 核糖體合成相關(guān)蛋白的異常也可能會(huì)導(dǎo)致根、葉、育性以及胚胎發(fā)育的異常[34-37]。根據(jù)RT-qPCR結(jié)果,在葉、鞘和花藥中有較高水平表達(dá), 而突變體僅出現(xiàn)了花粉發(fā)育的異常, 推測(cè)在水稻花藥中該基因的功能是保守的, 而在其余部位, 可能存在相同功能的基因。

3.3 TPA1影響花藥絨氈層發(fā)育

通過RT-qPCR結(jié)果我們發(fā)現(xiàn), 在突變體中,的表達(dá)水平較野生型有大幅度下降, 根據(jù)Uzair等的研究, 突變體表現(xiàn)為絨氈層凋亡延遲,且花粉外壁外層不連續(xù), 柱狀層缺失[38], 突變體與具有相似的絨氈層與花粉外壁表型, 但突變體絨氈層與花粉壁異常程度要弱于突變體, 因此推測(cè)與可能位于同一途徑參與調(diào)控絨氈層與花粉外壁的發(fā)育。同時(shí)我們也發(fā)現(xiàn)在突變體中第9期有明顯下降的基因還有和, 這2個(gè)基因均屬于BHLH轉(zhuǎn)錄因子家族, 都是參與絨氈層降解的重要轉(zhuǎn)錄因子[12,14], 且在之前的報(bào)道中認(rèn)為,與和在同一途徑共同參與影響絨氈層, 但并不直接受這2個(gè)轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控, 因此可能作為連接或與中間的途徑參與絨氈層的發(fā)育。

4 結(jié)論

本研究鑒定了一個(gè)水稻雄性不育突變體, 相較于野生型, 其花藥外壁角質(zhì)層減少, 烏氏體發(fā)育異常, 絨氈層凋亡延遲, 胼胝質(zhì)減少, 花粉外壁柱狀層缺失, 表現(xiàn)出完全的雄性不育, 遺傳分析表明突變表型受1對(duì)隱性核基因控制, 分子定位將確定在4號(hào)染色體上引物標(biāo)記N9和N11之間, 物理距離為74 kb, 該區(qū)間內(nèi)共包含15個(gè)預(yù)測(cè)基因,通過測(cè)序?qū)⒁粋€(gè)從未被報(bào)道的基因確定為的候選基因, 表明是一個(gè)新的水稻育性發(fā)育基因,可能與處于同一途徑, 參與絨氈層與花粉壁的發(fā)育。

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Phenotypic identification and fine mapping of male sterile mutantin rice

WAN Ying-Chun1,**, BAN Yi-Jie1,**, JIANG Yu-Dong2,**, WANG Ya-Xin1, LIU Jing-Jing1, LIU Xiao-Qing1, CHENG Yu-Lin1, WANG Nan1,*, and FENG Ping1,*

1Rice Research Institute of Southwest University / Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops / Engineering Research Center of South Upland Agriculture, Ministry of Education, Chongqing 400716, China;2Key Laboratory of Southwest Rice Biology and Genetic Breeding, Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Luzhou Branch of National Rice Improvement Center, Rice and Sorghum Research Institute, Sichuan Academy of Agricultural Sciences (Deyang Branch of Sichuan Academy of Agricultural Sciences), Deyang 618000, Sichuan, China

Male sterile material is the key to hybrid rice breeding. In this study, a male sterile mutantwas screened by ethyl methane sulfonate (EMS) mutagenesis of excellentcultivar Xinong 1B. There was no difference betweenand wild type at vegetative growth stage. At reproductive stage, male gametes were sterile and female gametes developed normally. Phenotypic observation showed that the pollen ofwas completely broken and disappeared, the stratum corneum of the outer wall of the anther was abnormal, the Ubisch body of the inner wall of the anther was abnormal, the callose synthesis was abnormal, the tapetum apoptosis was abnormal, and the outer wall of the pollen was missing bacula layer. Genetic analysis showed that the mutant trait was controlled by a pair of recessive nuclear genes. A genetic population was constructed using themutant and Jinhui 10. Finally,gene was located between the markers N9 and N11 on chromosome 4, with a physical distance of 74 kb. There were 15 predicted genes in this interval. Resequencing identified that only a single base substitution occurred in the exon of, leading to an early termination of translation. Subsequent sequencing of the wild-type and mutantconfirmed this mutation, thus identified the gene as a candidate gene for, indicating thatwas a new male sterile gene. This study will lay a foundation for the functional study ofgene.

rice (L.); male recessive nuclear infertility;; fine mapping

10.3724/SP.J.1006.2024.32043

本研究由重慶市研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目(CYS22224)和重慶市技術(shù)創(chuàng)新與應(yīng)用發(fā)展專項(xiàng)重點(diǎn)項(xiàng)目(CSTB2022TIAD-KPX0014)資助。

This study was supported by the Chongqing Graduate Research and Innovation Project (CYS22224) and the Chongqing Technology Innovation and Application Development Special Key Project (CSTB2022TIAD-KPX0014).

馮萍, E-mail: 554180353@qq.com; 王楠, E-mail: wangnan_xndx@126.com

**同等貢獻(xiàn)(Contributed equally to this work)

萬應(yīng)春, E-mail: wanyc1221@126.com; 班義結(jié), E-mail: 2263889500@qq.com; 蔣鈺東, E-mail: 289482100@qq.com

2023-10-17;

2024-01-12;

2024-02-08.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20240206.1442.006

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