耐亞磷酸鹽除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的創(chuàng)建和抗性評(píng)價(jià)

鐘 元 朱天宇 戴 成 馬朝芝

耐亞磷酸鹽除草劑轉(zhuǎn)基因油菜的創(chuàng)建和抗性評(píng)價(jià)

鐘 元 朱天宇 戴 成 馬朝芝*

華中農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳改良全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 / 國(guó)家油菜工程技術(shù)研究中心 / 洪山實(shí)驗(yàn)室, 湖北武漢 430070

在油菜的生產(chǎn)過(guò)程中, 大量伴生的雜草嚴(yán)重影響了其產(chǎn)量和品質(zhì)。由于近年來(lái)田間抗除草劑雜草數(shù)量的增加, 除草劑的選擇正在迅速減少, 這影響了未來(lái)農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。植物可以通過(guò)正磷酸鹽(Pi)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收亞磷酸鹽(Phi), 但Phi不能被代謝為作物的磷肥料, 導(dǎo)致植物生長(zhǎng)受到抑制。此前, 從羅爾斯通菌屬(sp. strain 4506)中分離出了(phosphite dehydrogenase)基因, 其139位的酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０?Y139Q)的突變蛋白ptxDQ催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的活性顯著提高。為了評(píng)價(jià)ptxD/Phi系統(tǒng)對(duì)甘藍(lán)型油菜雜草的防治效果, 本研究獲得了帶有密碼子優(yōu)化的(Y139Q,ptxD)基因的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜。在以Phi為單一磷元素的條件下,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜可以正常生長(zhǎng), 體內(nèi)Pi含量顯著提高, 且Pi饑餓響應(yīng)基因(和等)的表達(dá)水平被顯著抑制, 說(shuō)明ptxD在油菜體內(nèi)可以促使Phi轉(zhuǎn)化為Pi。此外,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜具有比野生型油菜和單子葉雜草(狗尾草)更強(qiáng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)。綜上所述,ptxD/Phi是一種有效的油菜磷利用和雜草控制系統(tǒng), 既可以抑制雜草的生長(zhǎng), 又可以為作物提供充足的Pi營(yíng)養(yǎng), 從而提高了農(nóng)業(yè)的可持續(xù)性。

甘藍(lán)型油菜; 除草劑; 亞磷酸鹽;

油菜是十字花科蕓薹屬植物, 主要有油用、菜用和觀賞等用途[1]。在油菜整個(gè)生長(zhǎng)周期中, 田間常會(huì)有大量的雜草伴生, 對(duì)油菜的產(chǎn)量和品質(zhì)產(chǎn)生影響, 雜草會(huì)與油菜爭(zhēng)奪肥、光、水和生存空間等, 造成油菜減產(chǎn)10%～15%, 嚴(yán)重的甚至?xí)p產(chǎn)50%以上[2]。為了保障和穩(wěn)定油菜安全生產(chǎn), 必須提高對(duì)草害的防治效率。目前, 化學(xué)防治是農(nóng)業(yè)現(xiàn)代化進(jìn)程中應(yīng)用最為廣泛的雜草防治方法。相較于人工除草、輪作、生物防治、淺耕滅草等傳統(tǒng)技術(shù), 化學(xué)除草效果顯著、人工成本低且不改變土層結(jié)構(gòu)。然而農(nóng)藥的大量使用不僅會(huì)破壞土壤中的生物多樣性, 還會(huì)危害人體健康[3]。現(xiàn)階段, 除草劑被廣泛用于控制雜草。乙胺磺隆、苯唑啉乙基和喹唑磷乙基(苯磺隆、草甘膦、草銨膦)都是油菜地常用的除草劑[4-6]。然而化學(xué)除草劑長(zhǎng)期過(guò)量使用, 會(huì)導(dǎo)致農(nóng)田中抗除草劑雜草數(shù)量急劇增加。因此, 迫切需要開(kāi)發(fā)能夠有效治理雜草的新工具, 特別是非除草工具, 以有效地管理雜草。

磷(P)是一種必需的常量營(yíng)養(yǎng)素, 它通過(guò)被吸收成重要的細(xì)胞成分而起著至關(guān)重要的作用, 是所有生物體所必需的[7-9]。磷酸鹽主要有2種形式, 正磷酸鹽(Pi)和亞磷酸鹽(Phi)[10-12]。Phi是Pi的一種簡(jiǎn)化形式, 其中一個(gè)氧原子被氫原子取代[13], 它被廣泛用于控制卵菌病原菌引起的植物真菌病害[14-16]。雖然植物可以通過(guò)Pi轉(zhuǎn)運(yùn)體吸收Phi, 但Phi不能被代謝為作物的磷肥[17-19]。亞磷酸酯脫氫酶()基因來(lái)源于細(xì)菌(如WM88), 它編碼一種催化Phi氧化成Pi的酶[18,20]。轉(zhuǎn)基因株系使植物將Phi作為磷的唯一來(lái)源進(jìn)行發(fā)育[21-23],/Phi系統(tǒng)作為雜草控制的非除草劑工具, 已成功應(yīng)用于許多作物中, 如水稻、玉米和棉花等[19,23-24]。此外,/Phi系統(tǒng)在不使用抗生素/除草劑抗性基因的轉(zhuǎn)基因植物中具有很大的潛力[25-26]。

從sp. 4506(PtxDR4506)中分離到基因[27], 通過(guò)定向進(jìn)化獲得了第139位酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０返膒txD突變蛋白(Y139Q, ptxDQ), 其催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的效率比PtxDR4506提高了5.8倍[27]。在此基礎(chǔ)上, 我們優(yōu)化了ptxD的密碼子, 構(gòu)建了轉(zhuǎn)化油菜的雙元載體pCambia1300-ptxD, 將載體轉(zhuǎn)化到油菜, 獲得了ptxD轉(zhuǎn)基因油菜株系。轉(zhuǎn)基因株系可以在只有Phi存在的情況下正常生長(zhǎng), 且在提供Phi的條件下可抑制Pi饑餓誘導(dǎo)的基因的表達(dá)水平, 表明ptxD轉(zhuǎn)基因油菜可以將Phi轉(zhuǎn)化為Pi, 從而提供其生長(zhǎng)所需的Pi。此外, 當(dāng)P以Phi的形式供給時(shí),ptxD轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜在人工基質(zhì)中的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)超過(guò)了狗尾草()這類單子葉雜草。以上結(jié)果表明,ptxD/Phi技術(shù)是一種較好的油菜雜草抑制系統(tǒng)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料和生長(zhǎng)條件

以甘藍(lán)型油菜‘Westar’為材料進(jìn)行植株轉(zhuǎn)化。所有野生型(Westar、B409和Damor)和轉(zhuǎn)基因植株均在20～23℃、光照強(qiáng)度為100 μmol m–2s–1、相對(duì)濕度為60%的溫室中生長(zhǎng)(光照/暗時(shí)間16 h/8 h)。

1.2 載體構(gòu)建

本研究以pcb11-P139Q為模板(華中農(nóng)業(yè)大學(xué)植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院吳高兵老師惠贈(zèng)), 用ptxD基因特異性引物進(jìn)行片段PCR擴(kuò)增, 跑膠確認(rèn)目的基因ptxD擴(kuò)增產(chǎn)物。再與線性化后的載體進(jìn)行重組, 轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α, 挑取單克隆進(jìn)行PCR檢測(cè), 陽(yáng)性菌株送公司經(jīng)測(cè)序確認(rèn), 提取質(zhì)粒并保存于–20℃, 得到植物表達(dá)載體-ptxD。進(jìn)一步用電轉(zhuǎn)法將新構(gòu)建的植物表達(dá)載體p1300-ptxD轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌, 28℃培養(yǎng)36～48 h后挑選單菌落, 用引物ptxD-F、ptxD- R進(jìn)行陽(yáng)性鑒定。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

1.3 甘藍(lán)型油菜轉(zhuǎn)基因植株的產(chǎn)生與篩選

在獲得-ptxD載體后, 通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的油菜遺傳轉(zhuǎn)化獲得轉(zhuǎn)基因株系。農(nóng)桿菌介導(dǎo)的甘藍(lán)型油菜的轉(zhuǎn)化過(guò)程參考實(shí)驗(yàn)室先前的研究方法[28]:將構(gòu)建的載體轉(zhuǎn)農(nóng)桿菌后侵染油菜受體材料Westar的下胚軸, 經(jīng)過(guò)組織培養(yǎng)的繼代轉(zhuǎn)化方式獲得陽(yáng)性苗。用Hygromycin B (120 μg mL–1)、Phi (1 mmol L–1)或Phi + Pi (1.5 mmol L–1+ 0.5 mmol L–1)篩選陽(yáng)性愈傷組織和轉(zhuǎn)基因植株。其中M2是愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基, M3、M4分別是芽分化與根誘導(dǎo)的培養(yǎng)基。利用ptxD基因特異性引物對(duì)T0代轉(zhuǎn)基因系進(jìn)行PCR擴(kuò)增。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

1.4 RNA提取和qRT-PCR分析

葉片組織收集自ptxD的轉(zhuǎn)基因系和有或無(wú)Phi處理的野生型油菜。利用RNA Prep Pure Plant Kit (Cat. No. LS1040, Promega, 美國(guó))試劑盒提取植物組織RNA, 利用Transcript RT kit (Cat. No. AE311, TransGen Biotech, 中國(guó))反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA, 反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物稀釋100倍作為模板。為內(nèi)參基因。qRT-PCR反應(yīng)體系為2×SYBR Green Master Mix 5 μL, 包含上下游引物各0.4 μL、cDNA模板4.2 μL。qRT-PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 5 min; 95℃ 30 s, 59℃ 1 min, 72℃ 10 min, 30個(gè)循環(huán)。每個(gè)處理3個(gè)生物學(xué)重復(fù), 依照2–ΔΔCt方法分析基因相對(duì)表達(dá)量。相關(guān)引物見(jiàn)表1。

1.5 油菜磷元素含量的測(cè)定

將ptxD的T1代轉(zhuǎn)基因系和甘藍(lán)型油菜‘Westar’在Hoagland培養(yǎng)基中萌發(fā)1周, 然后使用無(wú)P、Pi (KH2PO4)和不同Phi (KH2PO3)濃度的營(yíng)養(yǎng)液中再萌發(fā)2周。將0.2～0.3 g完全干燥的樣品磨成粉末, 加入30 mL去離子水轉(zhuǎn)移到50 mL容量瓶中。然后加入2滴2,6二硝基苯酚指示劑, 用6 mol L–1NaOH調(diào)節(jié)pH至黃色, 加入10 mL鉬酸釩銨溶液混合均勻,最后用水定容。采用分光光度計(jì)(UV2100, UNICO, 中國(guó))在440 nm波長(zhǎng)處測(cè)定無(wú)機(jī)Pi的濃度。以適當(dāng)濃度的KH2PO4作為標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)公式計(jì)算磷含量: P (μg g–1葉鮮重) = C × (V/W)。式中: C為提取液的磷含量(μg mL–1); V為提取液的體積(mL); W為樣品鮮重(g)。

1.6 轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的生長(zhǎng)

以無(wú)磷MS培養(yǎng)基(不含KH2PO4, 貨號(hào)PM1011- P)為基礎(chǔ), 添加不同濃度的KH2PO3(1 mmol L–1、2 mmol L–1、4 mmol L–1和8 mmol L–1)和1 mmol L–1的KH2PO4, 將油菜種子播種到這些培養(yǎng)基上, 生長(zhǎng)7 d后, 觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)。

營(yíng)養(yǎng)液水培: 將生長(zhǎng)7 d左右的幼苗用海綿固定在穴盤(pán)上面, 使用無(wú)P、1 mmol L–1Pi和4 mmol L–1Phi的營(yíng)養(yǎng)液水培, 在溫室(16 h光照, 8 h黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)。

營(yíng)養(yǎng)液土培: 將T1子代培養(yǎng)在沙子︰蛭石=1︰1的塑料托盤(pán)中, 并用含無(wú)P、1 mmol L–1Pi、4 mmol L–1Phi和8 mmol L–1Phi的營(yíng)養(yǎng)液澆灌, 在溫室進(jìn)行培養(yǎng)。

在播種后2周測(cè)量其鮮重、株高和根長(zhǎng), 用SPAD-502儀測(cè)定葉片葉綠素含量。每次加入的所有分析至少重復(fù)3次。在一個(gè)重復(fù)中, 每組數(shù)量為15～20株。

1.7 雜草的競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)

為了檢驗(yàn)ptxD/Phi系統(tǒng)對(duì)雜草(狗尾草)的防治效果, 將T1子代、野生型Westar油菜和雜草播種在塑料托盤(pán)中, 用沙子︰蛭石=1︰1, 用含有8 mmol L–1Phi或1 mmol L–1Pi的營(yíng)養(yǎng)液作為P源澆灌3周。在競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)中, 在試驗(yàn)結(jié)束當(dāng)天, 對(duì)每個(gè)處理的代表性托盤(pán)進(jìn)行拍照, 并確定植物的生長(zhǎng)參數(shù)。所有參數(shù)采用SPSS Statistics Base (version 22)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用單因素方差分析和檢驗(yàn)評(píng)估顯著差異。

表1 本研究中使用的引物

2 結(jié)果與分析

2.1 創(chuàng)建ptxDQ轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜

由于缺乏Phi分解代謝酶, 植物的生長(zhǎng)發(fā)育會(huì)受到Phi的抑制[29-30]。本研究首先考察了甘藍(lán)型油菜Westar對(duì)Phi處理是否敏感。以無(wú)磷MS培養(yǎng)基(不含KH2PO4)為基礎(chǔ), 添加不同濃度的KH2PO3(1 mmol L–1、2 mmol L–1、4 mmol L–1和8 mmol L–1)和1 mmol L–1的KH2PO4, 將Westar種子播種到這些培養(yǎng)基上, 生長(zhǎng)7 d后, 觀察其生長(zhǎng)表現(xiàn)。與無(wú)P條件下生長(zhǎng)的Westar植株相比, 在1 mmol L–1Pi條件下的幼苗生長(zhǎng)良好, 下胚軸長(zhǎng)度約為無(wú)P條件下長(zhǎng)度的1.4倍(圖1-a, b)。在Phi條件下, 甘藍(lán)型油菜Westar的根長(zhǎng)和鮮重受到抑制, 且與Phi的濃度呈正相關(guān)關(guān)系, 當(dāng)Phi濃度為8 mmol L–1時(shí), 其鮮重和根長(zhǎng)分別下降了約49%和65% (圖1-c, d), 說(shuō)明甘藍(lán)型油菜Westar對(duì)Phi處理敏感。為了分析Phi是否對(duì)不同生態(tài)型油菜都具有抑制作用, 本研究分析了3種油菜品系Westar、Damor和B409在水培條件下對(duì)Phi的敏感度。將在正常條件下萌發(fā)7 d的油菜幼苗轉(zhuǎn)移到含有4 mmol L–1Phi或1 mmol L–1Pi的Hoagland培養(yǎng)液中(附圖1-a), 生長(zhǎng)2周后發(fā)現(xiàn), 與Pi處理相比, 在Phi處理下的Westar、Damor和B409生長(zhǎng)都受到了嚴(yán)重的抑制(附圖1-b), 其中根長(zhǎng)下降了25%左右(附圖1-c), 鮮重下降了62.5%左右(附圖1-d), 表明Phi對(duì)不同的油菜品系都有抑制作用。

在此之前, 從sp. 4506菌株中克隆了基因(PtxD), 蛋白序列分析結(jié)果表明, PtxDR4506與假單胞桿菌來(lái)源的PtxD蛋白(PtxDWM88)同源性為54 % (附圖2)。在PtxD基礎(chǔ)上, 通過(guò)定向進(jìn)化獲得了第139位酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０返膒txD突變蛋白(Y139Q, ptxDQ), 其催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的效率比PtxDR4506提高了5.8倍[27]。為檢測(cè)ptxDQ在油菜中是否具有生物學(xué)功能, 我們將ptxD的基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化, 進(jìn)一步擴(kuò)增ptxD基因片段, 構(gòu)建到pCambia1300載體中, 獲得載體p1300- ptxDQ(圖1-e)。其中35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)ptxD基因表達(dá)(圖1-e), 此外該載體還包含一個(gè)潮霉素抗性基因的位點(diǎn)(HygR) (圖1-e)。

/Phi系統(tǒng)在多個(gè)植物中已經(jīng)證明可以用于轉(zhuǎn)基因植株的篩選[17,19,22-23,25-26]。為了驗(yàn)證/Phi系統(tǒng)是否可以用于轉(zhuǎn)基因油菜的篩選, 本研究將p1300-ptxD載體轉(zhuǎn)化至油菜受體Westar中, 分別以HygB (120 μg mL–1)、Phi (1 mmol L–1)和Phi + Pi (1.5 mmol L–1+0.5 mmol L–1)為篩選劑篩選陽(yáng)性愈傷。在HygB為篩選劑的條件下, 油菜愈傷可以正常膨大并分化出芽(圖1-f)。在以Phi為單一磷元素的條件下, 油菜愈傷雖然可以分化, 但是在芽分化培養(yǎng)基上(M3), 愈傷不能正常膨大, 且沒(méi)有分化出芽(附圖3-a), 說(shuō)明在Phi為單一磷元素的篩選條件下, 不能獲得油菜轉(zhuǎn)基因株系。在Phi + Pi (1.5 mmol L–1+ 0.5 mmol L–1)篩選條件下, 愈傷組織和芽均生長(zhǎng)良好(圖1-f, g)。其中, 81.47%～90.32 %的外植體在Phi + Pi篩選條件下轉(zhuǎn)化為愈傷, 29.23%～49.07%的外植體在HygB條件下轉(zhuǎn)化為愈傷(表2)。0.64%～1.73%外植體在Phi + Pi篩選條件下分化出正常生長(zhǎng)的植株; 3.22%～4.17%外植體在HygB篩選條件下分化出正常生長(zhǎng)的植株(表2)。最終獲得了油菜轉(zhuǎn)化再生苗共41株, 其中基于Pi+Phi篩選得到了11株, 基于HygB篩選得到了30株(表2)。

為了進(jìn)一步驗(yàn)證篩選所獲得的植株是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系, 本研究設(shè)計(jì)了特異性擴(kuò)增ptxD基因片段的引物。PCR結(jié)果顯示, 通過(guò)HygB篩選所獲得的30株再生苗均擴(kuò)增出1009 bp大小的特異性條帶(附圖3-b), 而通過(guò)Pi+Phi篩選得到的11株再生苗未擴(kuò)增出目的條帶(附圖3-b)。說(shuō)明, 目前的組培篩選條件(Phi + Pi: 1.5 mmol L–1+ 0.5 mmol L–1)不適用于油菜轉(zhuǎn)基因株系的篩選。進(jìn)一步通過(guò)RT-PCR鑒定ptxD基因在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平。與野生型對(duì)照(Westar)相比, 6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(L1、L4、L5、L10、L22和L24)均檢測(cè)到ptxD基因的表達(dá)(圖1-h)。進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR驗(yàn)證上述6個(gè)轉(zhuǎn)基因株系中ptxD基因的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,ptxD基因在5個(gè)轉(zhuǎn)基因株系(L1、L4、L5、L10和L22)中的表達(dá)水平均顯著高于野生型對(duì)照(Westar) (圖1-i), 其中L5和L10的表達(dá)量最高。此外, 我們檢測(cè)了ptxD基因在L10株系各個(gè)組織中的表達(dá)水平, RT-PCR結(jié)果顯示L10植株的根、莖、葉樣品均擴(kuò)增出216 bp的目的條帶(附圖3-c), 說(shuō)明ptxD基因在L10轉(zhuǎn)基因油菜植株的根、莖、葉中都有表達(dá)。最終選擇表達(dá)量較高的2個(gè)轉(zhuǎn)基因油菜株系L5和L10進(jìn)行后續(xù)研究。

圖1 含有密碼子優(yōu)化ptxDQ的轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜的產(chǎn)生

(a) 甘藍(lán)型油菜Westar在Pi和不同Phi濃度處理7 d后的生長(zhǎng)情況。標(biāo)尺為2 cm。(b) 生長(zhǎng)7 d后下胚軸長(zhǎng)度的統(tǒng)計(jì)情況。(c) 生長(zhǎng)7 d后根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)情況。(d) 生長(zhǎng)7 d后鮮重的統(tǒng)計(jì)情況。(e) 植物轉(zhuǎn)化載體p1300-ptxD示意圖。(f)和(g)以120 μg mL–1Hygromycin B和0.5 mmol L–1Pi +1.5 mmol L–1Phi為篩選劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化。標(biāo)尺為2 cm。(h) 油菜再生苗RNA水平的PCR鑒定。(i) 油菜再生苗ptxD基因相對(duì)表達(dá)量分析。數(shù)字編號(hào)為不同的油菜再生苗單株, M為marker,為油菜內(nèi)參基因。使用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn), *、**、***分別表示在0.05、0.01、0.001概率水平差異顯著。

(a): the growth ofWestar treated with Pi and Phi at different concentrations for 7 days. Scale bar: 2 cm. (b): statistics of hypocotyl length after 7 days of growth. (c): statistics on root length after 7 days of growth. (d): Statistics on fresh weight after 7 days of growth. (e): Schematic diagram of the plant transformation vectorp1300-ptxD. (f) and (g): 120 μg mL–1hygromycin B and 0.5 mmol L–1Pi + 1.5 mmol L–1Phi were used as the screening agents for transformation. Scale bar: 2 cm. (h): PCR identification of RNA levels inseedlings. (i): the relative expression level ofptxDgene inregenerated seedlings. The numbers are differentregenerated seedling monocots, M is marker, andisinternal gene. The significance is analyzed by t-test. *, **, and *** mean significant difference at the 0.05, 0.01, and 0.001 probability levels, respectively.

表2 同一載體(pCMBIA1300-PtxDQ)不同篩選劑的轉(zhuǎn)化情況統(tǒng)計(jì)

2.2 ptxDQ轉(zhuǎn)基因油菜可以利用亞磷酸鹽作為磷的唯一來(lái)源

為了研究ptxD過(guò)表達(dá)的甘藍(lán)型油菜是否可以利用亞磷酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿猁}來(lái)供油菜的生長(zhǎng)發(fā)育, 本研究將對(duì)照(Westar)和T1代轉(zhuǎn)基因植株(L5和L10)分別培養(yǎng)在塑料托盤(pán)中, 其中沙子和蛭石的比例為1︰1。分別用含無(wú)磷(No P)、4 mmol L–1Phi和1 mmol L–1Pi的Hogland營(yíng)養(yǎng)液處理。播種14 d后, 在無(wú)磷和1 mmol L–1Pi條件下, 對(duì)照(Westar)和ptxD過(guò)表達(dá)株系的生長(zhǎng)差異不明顯(圖2-a); 在Phi處理下, 對(duì)照(Westar)長(zhǎng)勢(shì)較弱, 而ptxD過(guò)表達(dá)株系(L5和L10)長(zhǎng)勢(shì)相對(duì)正常(圖2-a)。播種后56 d時(shí), 與1 mmol L–1Pi處理?xiàng)l件相比, 對(duì)照(Westar)在不含P和Phi處理下的生長(zhǎng)受到非常強(qiáng)的抑制(圖2-b);ptxD過(guò)表達(dá)株系(L5和L10)在不含磷和1 mmol L–1Pi處理?xiàng)l件下和對(duì)照無(wú)顯著差異, 而在外施4 mmol L–1Phi的條件下,ptxD過(guò)表達(dá)株系可以正常生長(zhǎng)(圖2-b)。此外, 對(duì)照材料和ptxD過(guò)表達(dá)株系在Pi處理下在第68天左右開(kāi)花, 而在Phi處理下,ptxD過(guò)表達(dá)株系在第76天開(kāi)花, 對(duì)照材料Westar第89天時(shí)才開(kāi)花(圖2-c)。

SPAD-502儀測(cè)定葉片葉綠素含量結(jié)果顯示, 不含P和Pi處理下的對(duì)照材料Westar和T1代ptxD過(guò)表達(dá)株系的SPAD值沒(méi)有顯著差異(圖2-d); 但外施Phi后, 轉(zhuǎn)基因植株L5和L10的葉綠素水平高于野生型植株Westar (圖2-d)。進(jìn)一步測(cè)定了對(duì)照株系Westar和ptxD過(guò)表達(dá)株系在不同處理?xiàng)l件下植物體內(nèi)的Pi含量, 結(jié)果表明, 對(duì)照材料Westar在無(wú)P和Pi處理?xiàng)l件下, Pi含量分別為0.25 mg g–1DW和0.90 mg g–1DW,ptxD過(guò)表達(dá)株系L5和L10在無(wú)P和Pi處理?xiàng)l件下, Pi含量也分別在0.25 mg g–1DW和0.95 mg g–1DW, 兩者之間并無(wú)顯著差異(圖2-e)。在Phi處理?xiàng)l件下, 對(duì)照(Westar)體內(nèi)Pi含量為0.25 mg g–1DW, 而ptxD轉(zhuǎn)基因植株的Pi水平為2.0～2.2 mg g–1DW, 顯著高于對(duì)照植株(圖2-e)。表明ptxD轉(zhuǎn)基因株系可以有效地將Phi轉(zhuǎn)變?yōu)镻i, 從而提高轉(zhuǎn)基因油菜的生物量和葉綠素相對(duì)含量。

已有研究結(jié)果表明, 擬南芥磷轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(、和)和磷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子()編碼基因在植物缺P(pán)或低P條件下會(huì)顯著上調(diào)[31-33]。本研究進(jìn)一步檢測(cè)對(duì)照株系(Westar)和T1代ptxD過(guò)表達(dá)株系(L5和L10)在無(wú)P、含有Phi或Pi培養(yǎng)2周后, 磷饑餓誘導(dǎo)基因的表達(dá)水平。在對(duì)照(Westar)材料中,、、和基因的表達(dá)水平在無(wú)P和Phi處理下與Pi處理相比顯著提高(圖3), 說(shuō)明油菜、、和同源基因也受到低磷的誘導(dǎo)。在ptxD過(guò)表達(dá)株系中,等基因的表達(dá)水平在無(wú)P的條件下被顯著誘導(dǎo); 而Phi處理后,等基因的表達(dá)水平與Pi處理后的表達(dá)水平無(wú)顯著差異(圖3)。進(jìn)一步說(shuō)明ptxD可以將Phi轉(zhuǎn)變?yōu)镻i, 抑制低磷響應(yīng)基因的表達(dá)水平。

2.3 ptxDQ油菜在Phi處理下比雜草競(jìng)爭(zhēng)力強(qiáng)

為了檢測(cè)Phi作為除草劑的可行性, 我們將對(duì)照材料(Westar)、T1代ptxD過(guò)表達(dá)株系(L5和L10)和單子葉雜草(狗尾草)分別培養(yǎng)在塑料托盤(pán)中, 分別用含無(wú)磷(No P)、8 mmol L–1Phi和1 mmol L–1Pi的Hogland營(yíng)養(yǎng)液處理。添加Pi后, 狗尾草、野生型植株Westar和兩個(gè)轉(zhuǎn)基因品系L5和L10生長(zhǎng)旺盛(圖4-a, b)。與Pi處理相比, 在Phi處理下野生型植株Westar和狗尾草的生長(zhǎng)受到了顯著的抑制, 而ptxD轉(zhuǎn)基因株系L5和L10無(wú)顯著的差異(圖4-a, b)。經(jīng)Phi處理后, 狗尾草的鮮重顯著降低, 約為Pi處理?xiàng)l件下的54% (圖4-c);ptxD轉(zhuǎn)基因植株幼苗的鮮重也降低, 約為Pi處理?xiàng)l件下的26%, 與降低了84%的Westar相比, 顯著高于野生型植株Westar和狗尾草(圖4-d)。Phi處理過(guò)的ptxD轉(zhuǎn)基因植株的株高和根長(zhǎng)度也沒(méi)有受到抑制, 它們比Phi處理過(guò)的野生型植株Westar更長(zhǎng)(圖4-d), 這表明Phi具有作為苗期前除草劑殺死或抑制田間雜草的潛力。有意思的是, T1代ptxD過(guò)表達(dá)株系中有部分植株在外施Phi條件下, 植株生長(zhǎng)顯著被抑制(圖4-e), 進(jìn)一步利用ptxD基因特異性引物檢測(cè)部分株系(圖4-e中紅框標(biāo)記)的基因組中是否插入了ptxD基因片段, 通過(guò)PCR結(jié)果顯示, 生長(zhǎng)受抑制的株系均不能擴(kuò)增ptxD基因特異性條帶(圖4-e), 推測(cè)T1代ptxD過(guò)表達(dá)株系中出現(xiàn)了分離。我們后續(xù)會(huì)擴(kuò)大群體, 通過(guò)Southern blot等其他方法來(lái)檢測(cè)其拷貝數(shù)和計(jì)算分離比。

圖2 沙培水培法研究Phi對(duì)野生型和ptxDQ轉(zhuǎn)基因甘藍(lán)型油菜植株生長(zhǎng)的影響

(a)～(c)野生型植株和2個(gè)ptxD轉(zhuǎn)基因系(L5和L10, T1代)在沙培養(yǎng)(沙 : 蛭石=1:1)中分別生長(zhǎng)14 d (a)、56 d (b)和76 d (c), 分別用無(wú)P、Pi或Phi營(yíng)養(yǎng)液處理。(a)～(c)中比例尺分別為3 cm、7 cm、7 cm。(d) 柱狀圖為不含P、Pi或Phi營(yíng)養(yǎng)液灌溉2周后野生型植株和2個(gè)ptxD轉(zhuǎn)基因品系的SPAD值。(e)柱狀圖為不加P、Pi或Phi營(yíng)養(yǎng)液灌溉2周后野生型植株和2個(gè)ptxD轉(zhuǎn)基因品系的Pi含量。使用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn): 當(dāng)≤ 0.05時(shí), 如果用不同的小寫(xiě)字母標(biāo)注, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a)–(c): the image shows the Westar plants and twoptxDtransgenic lines (L5 and L10, T1generation) grown in sand culture (sand : vermiculite = 1:1) for 14-day (a), 56-day (b) and 76-day (c) by irrigating no P, Pi, or Phi nutrient solutions. In (a)–(c), the scale bar was 3, 7, and 7 cm, respectively. (d): bar graph shows the SPAD values of Westar and twoptxDtransgenic lines irrigated by no P, Pi, or Phi nutrient solutions for two weeks. (e): bar graph shows the Pi contents of Westar and twoptxDtransgenic lines irrigated by no P, Pi, or Phi nutrient solutions for two weeks. Different lowercase letter indicates significant difference at≤ 0.05 by-test.

(a)的相對(duì)表達(dá)量; (b)的相對(duì)表達(dá)量; (c)的相對(duì)表達(dá)量; (d)的相對(duì)表達(dá)量。使用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn): 當(dāng)≤ 0.05時(shí), 如果用不同的小寫(xiě)字母標(biāo)記, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a): the relative expression level of; (b): the relative expression level of; (c): the relative expression levels of; (d): the relative expression of. Different lowercase letter indicates significant difference at≤ 0.05 by-test.

(圖4)

(a)和(b) Westar、狗尾草和轉(zhuǎn)基因植株在Pi和Phi處理3周后的生長(zhǎng)發(fā)育情況, Pi濃度為1 mmol L-1, Phi濃度為8 mmol L-1。(a) 標(biāo)尺為5 cm; (b) 標(biāo)尺為2 cm。(c) 柱狀圖為(a)所示43株狗尾草的鮮重。使用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn): ***,< 0.0001。(d) Westar和轉(zhuǎn)基因植株在Pi和Phi處理3周后的鮮重、株高、根長(zhǎng)的情況。(e) T1代轉(zhuǎn)基因株系中的ptxD特異性條帶的PCR分析。1～5, 表示L10的不同轉(zhuǎn)基因植株。使用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn): 當(dāng)≤ 0.05時(shí), 如果用不同的小寫(xiě)字母標(biāo)記, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a) and (b): growth and development of Westar, Setaria, and transgenic plants after 3 weeks of Pi and Phi treatment, Pi concentration was 1 mmol L-1, Phi concentration was 8 mmol L-1, (a) Scale bar: 5 cm; (b) Scale bar: 2 cm. (c): bar graph shows fresh weight ofrepresenting in (a).The significance is analyzed by-test: ***:< 0.0001.(d): fresh weight, plant height, and root length of Westar and transgenic plants after 3 weeks of Pi and Phi treatment. (e):ptxDspecific band in T1transgenic lines by PCR.1-5, indicated different transgenic plants of L10. Different lowercase letter indicates significant difference at≤ 0.05 by-test.

3 討論

油菜田間常伴生著大量的雜草, 嚴(yán)重影響了油菜的生產(chǎn), 加上除草劑(如草甘膦等)過(guò)量使用, 油菜田間抗除草劑雜草的數(shù)量逐年增加[34-36]。已有研究表明,/Phi系統(tǒng)可以有效控制棉花和煙草中的雜草[19,22], 但是該系統(tǒng)在油菜中的應(yīng)用還未見(jiàn)報(bào)道。本研究將來(lái)源于羅爾斯通菌中的ptxD基因轉(zhuǎn)化到甘藍(lán)型油菜,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜能夠在以亞磷酸為唯一磷源的條件下正常生長(zhǎng), 且與雜草相比具有顯著的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì), 為解決磷利用和控制油菜田間雜草提供了一條新途徑。

由于除草劑在農(nóng)業(yè)中的持續(xù)大量使用, 抗除草劑雜草的數(shù)量急劇增加, 因此需要尋找新的除草劑資源。常規(guī)除草劑針對(duì)特定的代謝酶, 如草甘膦可以抑制莽草酸途徑(shikimate pathway)中的關(guān)鍵酶 5-烯醇式丙酮莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)的活性[37]。此前已經(jīng)有很多報(bào)道, 將EPSPS不同位點(diǎn)的脯氨酸突變可以顯著降低草甘膦與EPSPS的結(jié)合[38-40]。其原理是隨著氨基酸種類的改變, EPSPS的結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生變化, 從而使其與底物的親和力增加, 導(dǎo)致草甘膦無(wú)法再占據(jù)PEP結(jié)合位點(diǎn), 植物因此形成對(duì)草甘膦的抗性[41]。但是, 持續(xù)使用相同的除草劑加速了雜草的進(jìn)化。Gaines等[42]發(fā)現(xiàn)了一種高度抗草甘膦的雜草, 其中基因擴(kuò)增了100倍, 導(dǎo)致過(guò)表達(dá)40倍。植物的生長(zhǎng)依賴于Pi的持續(xù)供應(yīng), 然而, 大部分Pi會(huì)與土壤中的金屬離子(如Ca2+、Fe3+和Al3+)結(jié)合形成不溶性磷酸鹽, 并且Pi被細(xì)菌迅速轉(zhuǎn)化為不能被植物直接吸收和利用的有機(jī)形式[16,18,43]。磷肥的過(guò)量使用還會(huì)導(dǎo)致水系富營(yíng)養(yǎng)化[44-45]。因此, 尋找能夠替代磷的新型肥料成為農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展的迫切需要。與Pi相比, Phi具有獨(dú)特的生化特性, 有更高的溶解度, 但與金屬離子的化學(xué)反應(yīng)性較低, 大多數(shù)微生物無(wú)法利用[44,46-47]。Phi在結(jié)構(gòu)上類似于Pi, 植物能夠通過(guò)Pi轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白吸收Phi[13]。植物自身不能直接代謝Phi, 外施Phi顯著抑制植物的生長(zhǎng)發(fā)育[17-19], 表明Phi可以作為單子葉和雙子葉植物的苗前和苗后除草劑。在自然界中, Phi可以被少數(shù)土壤和海洋細(xì)菌利用[14,26], 通過(guò)NAD依賴性亞磷酸酯氧化還原酶(PTXD)將Phi轉(zhuǎn)化為Pi[47-49]。我們之前從sp. 4506(PtxDR4506)中克隆了基因, 通過(guò)定向進(jìn)化將139位的酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０? 脫氫酶的催化活性顯著提高[27]。ptxD轉(zhuǎn)基因品系可以通過(guò)將Phi轉(zhuǎn)化為Pi來(lái)緩解Phi對(duì)油菜的生長(zhǎng)抑制(圖2), 并通過(guò)提供Phi來(lái)減弱ptxD轉(zhuǎn)基因品系的磷饑餓反應(yīng)(圖3)。這些結(jié)果表明, 我們可以利用ptxD基因建立以Phi為磷肥和除草劑的植物磷利用與雜草控制相結(jié)合的體系。此外我們可以看到, Phi可以抑制非轉(zhuǎn)基因油菜和狗尾草的生長(zhǎng), 因此我們推測(cè)Phi對(duì)雙子葉雜草可能也有同樣的作用效果, 因?yàn)楸狙芯克玫碾s草為狗尾草, 在后續(xù)在試驗(yàn)過(guò)程中, 我們會(huì)在田間進(jìn)行外施Phi觀察其對(duì)雙子葉雜草的防控效果。此外也會(huì)選擇一些抗性雜草進(jìn)行驗(yàn)證。

在組織培養(yǎng)中, 抗生素和除草劑抗性基因常被用作篩選轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的選擇性標(biāo)記。然而, 這些抗性基因有可能會(huì)轉(zhuǎn)移到可共存的其他雜草中, 從而產(chǎn)生“超級(jí)雜草”和10種抗生素耐藥性[50-51]。此外, 很少有選擇性藥物對(duì)植物細(xì)胞增殖和分化有負(fù)面影響[17,52]。由于可以作為植物遺傳轉(zhuǎn)化的新型選擇性標(biāo)記, 因此在植物生物技術(shù)發(fā)展過(guò)程中顯示出巨大的潛力[25]。基因與以Phi為唯一磷源的選擇性培養(yǎng)基結(jié)合, 作為一種有效的系統(tǒng)來(lái)選擇多種植物的轉(zhuǎn)化細(xì)胞[17,19,23]。我們發(fā)現(xiàn)Phi強(qiáng)烈抑制愈傷組織再生(附圖2), 與煙草的研究結(jié)果一致[22]。在Phi培養(yǎng)基中添加了Pi后, 油菜愈傷可以進(jìn)行再分化(圖1-f), 并最終獲得了再生苗, 但這些再生植株并不是陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系, 推測(cè)可能是使用的Phi濃度過(guò)低, 加上轉(zhuǎn)化的外植體數(shù)量不足等原因?qū)е挛覀兾茨芡ㄟ^(guò)Phi篩選到陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系,接下來(lái)我們將繼續(xù)驗(yàn)證其作為油菜轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的可能性。

4 結(jié)論

本研究首先使用含有不同濃度的亞磷酸鹽處理甘藍(lán)型油菜, 結(jié)果表明, 隨著亞磷酸濃度的升高, 油菜的生長(zhǎng)被顯著抑制, 表明亞磷酸對(duì)油菜幼苗的生長(zhǎng)具有較強(qiáng)抑制作用。前期研究發(fā)現(xiàn), 羅爾斯通菌屬(sp. strain 4506)中ptxD蛋白139位的酪氨酸突變?yōu)楣劝滨０?Y139Q)后能夠提高其催化Phi轉(zhuǎn)化為Pi的活性。在此基礎(chǔ)上, 通過(guò)遺傳轉(zhuǎn)化將ptxD轉(zhuǎn)入到甘藍(lán)型油菜并獲得陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系。與對(duì)照植株相比,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜可以明顯減輕亞磷酸鹽對(duì)油菜生長(zhǎng)的抑制作用, 且體內(nèi)正磷酸鹽含量在ptxD轉(zhuǎn)基因株系中顯著提高, 表明轉(zhuǎn)基因油菜能將Phi氧化成Pi供油菜生長(zhǎng)發(fā)育。此外,p1300- ptxD轉(zhuǎn)基因油菜比狗尾草具有更強(qiáng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì), 表明ptxD/Phi系統(tǒng)可以有效控制雜草生長(zhǎng)。綜上所述,ptxD轉(zhuǎn)基因油菜具有將Phi轉(zhuǎn)化為Pi的能力, 從而賦予其在Phi條件下比野生型油菜和雜草更強(qiáng)的生長(zhǎng)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì), 表明ptxD/Phi是有效的油菜磷利用和雜草控制系統(tǒng), 為有效解決油菜磷利用和雜草控制提供了全新的可行方案。

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附圖1 不同生態(tài)型油菜在Pi和Phi下的水培試驗(yàn)

Fig. S1 Hydroponics experiments of different ecotypes ofunder Pi and Phi

(a)和(b) 處理2周后不同油菜的生長(zhǎng)狀況。Pi濃度為1 mmol L–1, Phi濃度為4 mmol L–1。標(biāo)尺為2 cm。(c) 處理2周后不同油菜根長(zhǎng)的統(tǒng)計(jì)。(d) 處理2周后不同油菜鮮重的統(tǒng)計(jì)。使用檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn): 當(dāng)≤ 0.05時(shí), 如果用不同的小寫(xiě)字母標(biāo)注, 則條形圖代表的值存在顯著差異。

(a) and (b) growth of differentafter 2 weeks of treatment. The Pi concentration is 1 mmol L–1and the Phi concentration is 4 mmol L–1. Scale bar: 2 cm. (c) statistics of differentroot length after 2 weeks of treatment. (D) statistics of differentfresh weight after 2 weeks of treatment. The significance is analyzed at≤ 0.05 by-test. The values represented by the bars chart are significantly different if marked with different lowercase.

附圖2 ptxD蛋白序列分析

Fig. S2 Protein sequence analysis ofptxD

PtxDR4506、PtxDR4506(Y139Q)和PtxDWM88氨基酸序列比對(duì)。相同的殘基用黑色表示, 相似的殘基用灰色表示。

Alignment of PtxDR4506, PtxDR4506(Y139Q), and PtxDWM88amino acid sequence. The identical residues were shaded by black, and the similar residues were shaded by gray.

附圖3 潮霉素B和Phi對(duì)愈傷組織再生的影響

Fig. S3 Callus regeneration with Hygromycin B or Phi selection on shoot initiation media

(a) 以120 μg mL–1Hygromycin B和1 mmol L–1Phi為篩選劑進(jìn)行轉(zhuǎn)化。標(biāo)尺為2 cm。(b) 油菜再生苗DNA水平的PCR分析。數(shù)字編號(hào)為不同的油菜再生苗單株, M為marker。(c) 轉(zhuǎn)基因油菜L10株系的根、莖、葉的RT-PCR分析。為油菜內(nèi)參基因。

(a) 120 μg mL–1Hygromycin B and 1 mmol L–1Phi were used as screening agents for transformation. Scale bar: 2 cm. (b) PCR identification ofseedlings at DNA level. The numbers are differentregenerated seedling monocots, M is marker. (c) RT- PCR analysis of roots, stems, and leaves of L10 strain of transgenic rapeseed.isinternal gene.

Developing and resistance assessing of phosphite-tolerant herbicide transgenicL.

ZHONG Yuan, ZHU Tian-Yu, DAI Cheng, and MA Chao-Zhi*

National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University / National Engineering Research Center of Rapeseed / Hongshan Laboratory, Wuhan 430070, Hubei, China

During the production of, the yield and quality of the crop are seriously affected by a large number of accompanying weeds. Herbicide control options are rapidly diminishing due to the recent increase in the number of herbicide-resistant weeds in fields, which affects the sustainable development of agriculture in the future. Plants can take up phosphite (Phi) via orthophosphate (Pi) transporters, but the Phi cannot be metabolized and used as a phosphorus fertilizer for crops, resulting in plant growth inhibition. Previously, agene isolated fromsp. 4506, and the mutant protein ptxDQat position 139, which had tyrosine mutation to glutamine (Y139Q), significantly improved the conversion activity of Phi to Pi. To evaluate the efficacy ofptxD/Phi-based weed control system in, we generated transgenicplants with a codon-optimized(Y139Q,ptxD) gene. Ectopic expression ofptxDconfered the ability to convert Phi to Pi, resulting in improving plant growth in the presence of Phi. Pi-starvation-induced genes (e.g.and) were suppressed in theptxDtransgenic lines by supplying Phi, indicating thatptxDcan transform Phi into Pi in rapeseed. In addition,ptxDtransgenichad a greater competitive growth advantage over wild-typeand monocotyledonous weeds (). In conclusion, theptxD/Phi system provided an effective alternative for suppressing the weed growth while providing adequate Pi nutrition to the crops, which in turn improved the sustainability of agriculture.

; herbicide; phosphite;

10.3724/SP.J.1006.2024.34110

本研究由國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目(32072105)資助。

This study was supported by the National Natural Science Foundation of China (32072105).

馬朝芝, E-mail: yuanbeauty@mail.hzau.edu.cn

E-mail: zy14745140090623@163.com

2023-07-03;

2023-10-23;

2023-12-13.

URL: https://link.cnki.net/urlid/11.1809.S.20231212.1648.002

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