上轉換熒光納米材料免疫層析法快速檢測恩諾沙星的研究

朱凡君 韋何雯 郭躍平 費建楓

摘 要：本研究旨在開發一種基于上轉換熒光納米材料的免疫層析法，以快速檢測水產品中的恩諾沙星含量。上轉換熒光納米材料具備特殊的光學性質，能夠提升方法的靈敏度和準確性。在抗體偶聯pH值、標記熒光納米粒徑、檢測線包被蛋白濃度達到最佳條件時，該技術方法的檢出限為12.01 ng·mL-1，加標回收率為95.73%～115.03%，變異系數為7.78%～22.17%，檢測過程約10 min。本方法為水產品中恩諾沙星的檢測提供了參考，為檢驗方法的擴展提供了依據。

關鍵詞：上轉換發光納米材料；免疫層析法；恩諾沙星；快速檢測

Rapid Detection of Metronidazole by Immunochromatography with Upconversion Nanoparticles

Abstract： The purpose of this study was to develop an immunochromatography method based on upconversion fluorescent nanomaterials to rapidly detect the content of enrofloxacin in aquatic products. Upconversion fluorescent nanomaterials have special optical properties which can improve the sensitivity and accuracy of detection. Upconverted immunochromatography strips were prepared under optimal conditions by optimizing the antibody-conjugated pH， screening the labeled particle size， and determining the coating concentration. The detection limit of this technical method is 12.01 ng·mL-1， the recovery rate of spike is 95.73%～115.03%， the coefficient of variation is 7.78%～22.17%， and the detection process can only take about 10 minutes. This method provides a reference for the determination of enrofloxacin in aquatic products， and provides a basis for the expansion of the test method.

Keywords： up-conversion nanomaterials; immunochromatography; enrofloxacin; rapid detection

恩諾沙星屬喹諾酮類抗生素，是一種廣譜抗菌藥物，具有殺菌作用，主要用于治療動物的感染性疾病，其作用原理為抑制細菌的DNA回旋酶，從而阻止細菌的DNA復制和轉錄，起到殺菌作用[1-2]。常用于水產品感染性疾病及臨床上細菌感染性疾病的防治，以保障動物的健康和生產性能[3]。而恩諾沙星會通過食物鏈進入人體，可能對人體健康產生潛在風險[4]。因此，對于恩諾沙星殘留的檢測顯得尤為重要。目前，恩諾沙星殘留的檢測方法主要有高效液相色譜法[5]、液相色譜-質譜聯用法[6]，這些方法雖然重復性好、檢出限低，但樣品前處理麻煩，且整個檢測周期長、檢測儀器昂貴、對操作人員要求高，不適于大批量樣本和現場快速檢測[7-8]。免疫層析技術是一種基于抗原-抗體特異性結合的快速檢測技術，具有檢測周期短、操作簡便、靈敏高、特異強、成本低等優點，可適用于大批量樣本和現場快速檢測[9-10]。而時間分辨、量子點、上轉換發光材料在免疫層析技術中得到了廣泛發展和開發應用。免疫層析產品也從定性檢測發展成了用設備定量檢測，避免了因人眼觀察檢測線的有無或深淺帶來的人為主觀判讀誤差，使檢測結果更加可靠、準確。本研究以鑭系上轉換發光材料為免疫標記物，采用近紅外光作為激發光源，具有穿透能力強、避免生物樣品的自體干擾等特點，開發一種靈敏度高、特異性好、抗干擾性強、可實現現場檢測水產品中恩諾沙星的免疫層析試紙條。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

蔗糖、海藻糖、牛血清白蛋白（BSA）、羊抗兔IgG、兔IgG、恩諾沙星抗原、Tween-20、Triton X-100，生工生物工程（上海）股份有限公司；三羥甲基氨基甲烷、酪蛋白酸鈉，N-羥基丁二酰亞胺（NHS）和1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺（EDC），上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

硝酸纖維素膜（NC膜），德國賽多利斯公司；玻璃纖維，上海杰一生物技術有限公司；上轉換發光納米材料，杭州勝行生物科技有限公司；DNA混合儀，寧波新芝生物科技股份有限公司；高速離心機，塞洛捷克公司；熒光免疫分析儀，上海沫亙科技中心。

1.2 檢測原理

免疫層析將納米材料或熒光物質標記在檢測抗體/抗原上，樣本中的待測物質可與標記抗體（或抗原）、檢測線上的抗體（或抗原）發生特異性反應，形成復合物并固定在檢測線上，在特定波長的激發光照射下吸收能量，電子從基態躍遷到激發態，當其回到基態時，以發射光的形式釋放能量，檢測器檢測發射光強度，而發光強度與檢測物質的量相關，從而到達定量檢測的目的。

1.3 實驗方法

1.3.1 條件優化

（1）納米材料標記pH值篩選。取3個離心管分別加入0.5 mg上轉換發光納米材料溶液，在超聲條件下，使其充分分散。隨后將其離心（12 000 r·min-1，10 min）并去除上清液。通過加入1 mL嗎啉乙磺酸溶液（MES，50 mmol·L-1，pH=6.5）并在超聲條件下使其重懸。重復上述步驟1次。加入一定量EDC和NHS于上述重懸溶液中，使其表面羧基活化。接著放入DNA旋轉混合儀，離心去除上清液，用水混勻。再同樣步驟離心1次。接著加入不同pH值（pH=5.0、pH=7.0、pH=9.0）的緩沖溶液，超聲重懸。在離心管中加入恩諾沙星抗體，偶聯2～4 h或4 ℃過夜。加入適量的BSA以封閉空白位點，40 min后放入離心機離心（12 000×g，5 min），加入保存液，超聲重懸，重復上次步驟2～3次，最后得到修飾抗體后的熒光納米顆粒溶液，4 ℃保存備用。

（2）標記納米材料粒徑篩選。取顆粒直徑不同的熒光納米材料（30 nm、60 nm和100 nm），在超聲條件下，使其充分分散，隨后將其離心（12 000 r·min-1，10 min）并去除上清液，加入1 mL MES溶液（50 mmol·L-1，pH=6.5）并在超聲條件下使其重懸，重復1次上述步驟。加入一定量EDC和NHS于上述重懸溶液中，使其表面羧基活化。接著放入DNA旋轉混合儀，離心去除上清液，用水混勻。再同樣步驟離心1次。在離心管中加入恩諾沙星抗體，偶聯2～4 h或4 ℃過夜。加入適量的BSA以封閉空白位點，40 min后放入離心機離心（12 000 r·min-1，5 min），加入保存液，超聲重懸，重復上次步驟2～3次，最后得到修飾抗體后的熒光納米顆粒溶液，4 ℃保存備用。

（3）檢測線包被濃度確定。用緩沖液配制得到不同濃度的恩諾沙星抗原（0.5 mg·mL-1、1.0 mg·mL-1、1.5 mg·mL-1和2.0 mg·mL-1），并分別將其包被于檢測線，同時將濃度為1.0 mg·mL-1羊抗兔IgG包被到NC膜上，在37 ℃條件下過夜孵育。將標記抗體的復合物噴于結合墊上，用熒光免疫分析儀檢測結果，以陰性樣本和陽性樣本響應差值作為區分條件，差值越大，說明該條件下的檢測效果越好。

1.3.2 樣本處理及檢測方法

（1）樣本處理。取10 g牛蛙腿肉樣本搗碎或攪碎，稱取5 g于離心管中，加入5 mL樣本提取液，充分搖勻振蕩，并放入離心機離心（3 000 r·min-1，5 min），取上清液備用。

（2）檢測方法。測試前，先將該樣品的標準曲線錄入熒光免疫分析儀中。取100 ?L上清液與200 ?L樣本稀釋液充分混合搖勻，取100 ?L滴加于免疫層析試紙條上，測定其恩諾沙星含量。

1.3.3 試紙成品性能分析

（1）準確性。取10 g牛蛙腿肉陰性樣本進行加標回收試驗，在相同檢測條件下檢測5次，計算平均加標回收率和變異系數（Coefficient of Variation，CV）。

（2）精密度。取一確認陽性的牛蛙樣本，進行檢測，通過檢測結果計算精密度。

（3）檢出限。檢出限=20次空白樣本平均值+3倍標準偏差。

2 結果與分析

2.1 標記抗體pH值確定

由表1可知，當抗體標記pH值為7.0時，陰性樣本和陽性樣本之間的差值最大，說明該條件下的檢測性能最為可靠。因此選擇pH值為7.0作為最優標記抗體pH值條件。

2.2 標記納米材料粒徑確定

將粒徑為30 nm、60 nm、100 nm的上轉換發光材料使用掃描電鏡進行表征，結果如圖1所示。在相同條件下標記恩諾沙星抗體，對比檢測結果如表2所示，隨著納米材料粒徑增大，陰性樣本和陽性樣本之間的差值也變大。在本方案中，納米材料粒徑在100 nm時為最優。

2.3 檢測線包被蛋白濃度確定

由表3可知，陰性樣本和陽性樣本之間的差值在包被濃度為1.0 mg·mL-1時最大，故選擇包被濃度1.0 mg·mL-1為最優實驗條件。

2.4 精密度、準確性

取相同批次生產的免疫試紙條，在同一牛蛙腿肉樣本中添加不同濃度的恩諾沙星（20 ng·mL-1，50 ng·mL-1，100 ng·mL-1）進行檢測。由表4可知，該方法的加標回收率為95.73%～115.03%，變異系數為7.78%～22.17%，說明該檢測方法具有良好的精密度及準確性。

2.5 檢出限

取20次空白樣本進行檢測，根據檢測結果進行計算，該方法檢出限為12.01 ng·mL-1。

3 結論

恩諾沙星作為一種獸藥，因其高效、廣譜和低毒等優點被廣泛應用，但由于使用不規范，在食品、環境中造成藥物殘留，給消費者健康帶來隱患，引起了各方面的重視。而準確、可靠的檢測產品可滿足快速精準的實時大批量現場檢測的實際需求。本研究將上轉換發光材料應用于免疫層析檢測技術中，采用競爭法，對恩諾沙星進行定量檢測分析，在最佳實驗條件下，該方法檢測限可達12.01 ng·mL-1，加標回收率為95.73%～115.03%，變異系數為7.78%～22.17%，檢測時間僅為10 min，為水產品中恩諾沙星的檢測提供了參考，為檢驗方法的擴展提供了依據。

參考文獻

[1]楊瑩瑩，李宇涵，侯亞婷，等.恩諾沙星在獸醫臨床上的應用[J].天津科技，2023，50（增刊1）：119-122.

[2]劉麗貞，周婉蘋，薛冰.高效液相色譜-熒光檢測法同時測定魚肉組織中的諾氟沙星、環丙沙星和恩諾沙星殘留[J].中國衛生檢驗雜志，2008，18（7）：1296-1297.

[3]韋偉，劉付祥，王文濤.高效液相色譜-熒光法檢測雞蛋中氟喹諾酮類藥物的殘留量[J].山地農業生物學報，2022，41（6）：82-86.

[4]李倩，王甲，張玉潔，等.動物性食品中喹諾酮類藥物殘留檢測方法研究進展[J].食品安全質量檢測學報，2021，12（8）：3016-3022.

[5]張富生，王宇宸，盧禮生，等.量子點微球免疫層析試紙條檢測雞蛋中恩諾沙星的性能評價[J].食品與機械，2023，39（9）：32-37.

[6]孟麗華，史艷偉，時彥民，等.高效液相色譜法測定淡水漁業用水中諾氟沙星、環丙沙星、恩諾沙星殘留[J].水產養殖，2019，40（1）：5.

[7]董旭旭，孫威，曹攀，等.膠體金免疫層析試紙條技術在病毒檢測領域的應用研究現狀[J].生物工程學報，2022，38（9）：3243-3254.

[8]舒友琴，魏榮.免疫層析試紙條在食品安全檢測中的應用[J].現代牧業，2023，7（2）：11-17.

[9]趙雪.基于上轉發光系統的嗎啡檢測[D].成都：電子科技大學，2021.

[10]富青，李川江.膠體金免疫層析半定量檢測方法的研究[J].湖北預防醫學雜志，2002（5）：18.