?黑紫色葉紫薇品種‘赤紅’葉片轉(zhuǎn)錄組測序及注釋分析?

摘要： 對黑紫色葉紫薇品種‘赤紅’葉片進行高通量測序，并利用Trinity（2.8.6）對測序數(shù)據(jù)進行從頭組裝，共獲得23 791條unigene，其中91.86%的序列在NR、GO、COG、KEGG等5大數(shù)據(jù)庫中得到注釋；NR數(shù)據(jù)庫比對到的unigene數(shù)量最多，占比91.93%，隨后依次為SWISS（67.95%）、COG（60.43%）、GO（51.37%）和KEGG（35.43%）。在NR數(shù)據(jù)庫中，‘赤紅’紫薇所有的unigene僅比對到1個物種——石榴（Punica granatum L.），表明同屬于千屈菜科的紫薇和石榴親緣關(guān)系較近。從轉(zhuǎn)錄組中共篩選到4 775個SSR位點，包括6種核苷酸重復(fù)類型，其中A/T和AG/CT類型占比最高。對色素合成相關(guān)通路基因進行分析，共挖掘到18個與類黃酮和花青素相關(guān)的基因，其中花青素合成通路中的UGT79B1、BZ1、UGT75C1可能是‘赤紅’紫薇形成紫黑色葉的關(guān)鍵基因。

關(guān)鍵詞：紫薇品種‘赤紅’；轉(zhuǎn)錄組；基因注釋；色素合成關(guān)鍵基因

中圖分類號：Q943 文獻標識碼：A 文章編號：1006-060X（2024）01-0001-06

Sequencing and Annotation of the Leaf Transcriptome of Lagerstroemia indica 'Ebony Fire'

LIU Yu-jun1，QIN Bo2，LI Mei1，HUANG Yao-heng2，LIU Fang1，HUANG Xin2，LIU Li1

（1. Nanning Arboretum， Nanning 530031， PRC; 2. Guangxi Forestry Research Institute， Guangxi Key Laboratory of Special Non-Wood Forest Cultivation and Utilization， Nanning 530002， PRC）

Abstract： The high-throughput transcriptome sequencing for the leaves of Lagerstroemia indica 'Ebony Fire' yielded 23 791 unigenes after de novo assembly by Trinity （2.8.6）. Among them， 91.86% of the unigenes were annotated in NR， SWISS， COG， GO， and KEGG. The NR database annotated the largest number of unigenes， which accounted for 91.93%， followed by SWISS （67.95%）， COG （60.43%）， GO （51.37%）， and KEGG （35.43%）. Only one species of Punica granatum L. was compared in the NR database， indicating the high sequence homology between L. indica L. and P. granatum L.. A total of 4 775 SSR loci were screened out from the transcriptome， involving six nucleotide repeat types， of which A/T and AG/CT accounted for the largest proportion. The mining of genes involved in pigment synthesis revealed 18 genes associated with flavonoids and anthocyanin. UGT79B1， BZ1， and UGT75C1 in the anthocyanin synthesis pathway may be the key genes for L. indica 'Ebony Fire' to produce purple black leaves.

Key words： Lagerstroemia indica 'Ebony Fire'; transcriptome; gene annotation; key genes in pigment synthesis

紫薇（Lagerstroemia indica L.）為千屈菜科紫薇屬植物[1]，是重要的夏季觀花木本植物，具有花期長、花色艷麗、適應(yīng)性強的特點，在世界范圍內(nèi)廣泛栽培。長期以來，紫薇育種者們經(jīng)過不斷的改良，已培育形成了觀賞性狀變異豐富的品種群[2-3]。葉色是重要的觀賞性狀，通過雜交、誘變等方法培育的紫薇彩葉品種就算不開花時也具有較高的觀賞價值，有效增強了紫薇產(chǎn)業(yè)核心競爭力，帶動了產(chǎn)業(yè)發(fā)展[4]。目前，對彩色葉紫薇的研究主要集中在觀賞性狀評價和生理研究方面，例如品種介紹[5-6]、光合特性[7-9]、色澤研究[10]等。邵雯雯[11]的研究表明，紫薇紫色葉形成的過程中，以葉綠素為主要基調(diào)色素，其中花色素苷含量越高，其葉色越偏紫。在轉(zhuǎn)錄組研究方面，王淑安等[12]對金葉紫薇突變體進行了轉(zhuǎn)錄組測序，鑒定得到22條葉綠素代謝相關(guān)基因和17條類胡蘿卜素代謝相關(guān)基因，其中DRV基因及其同源基因的缺失可能與金色葉形成有直接關(guān)系。王瑩等[13]對紫色葉紫薇新品種‘紫晶1號’進行轉(zhuǎn)錄組測序研究，篩出與葉綠素代謝相關(guān)候選基因9個，其中2個候選基因共同參與了葉綠素兼類黃酮代謝的調(diào)控，2個候選基因可能參與類黃酮代謝過程，它們主要經(jīng)氧化還原反應(yīng)、物質(zhì)能量代謝、植物激素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等機制介入紫薇葉色調(diào)控。

該研究通過對黑紫色葉紫薇品種‘赤紅’的葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，獲得轉(zhuǎn)錄組注釋信息，并對色素合成相關(guān)通路的基因進行篩選，以期獲得與花色形成相關(guān)的關(guān)鍵基因，為紫薇葉色性狀形成的分子機制解析奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為紫薇品種‘赤紅’（Lagerstroemia indica ‘Ebony Fire’），種植在廣西林科院紫薇種質(zhì)資源圃，采集成熟健康葉片，葉色為RHS N186A（英國皇家園林協(xié)會RHS植物比色卡），液氮速凍后置于-80℃冰箱保存。

1.2 紫薇cDNA文庫構(gòu)建及測序

使用Trizol法提取葉片RNA，對提取的RNA進行瓊脂糖凝膠電泳，并使用NanoPhotometer spectrophotometer、Qubit2.0 Fluorometer、Agilent 2100 bioanalyzer等檢測其質(zhì)量，對合格的RNA樣品進行建庫。用Illumina TruseqTM RNA sample prep Kit（Illumina，美國）構(gòu)建‘赤紅’葉片RNA文庫，使用帶有Oligo（dT）的磁珠進行有polyA尾巴mRNA的富集，并超聲使其碎片化，以隨機寡核苷酸為引物，在逆轉(zhuǎn)錄酶的作用下進行第一條鏈的合成，然后清除反應(yīng)中的mRNA，進行cDNA第二條鏈的合成。合成后的雙鏈進一步純化、末端修復(fù)、添加A尾和末端接頭，篩選出200 bp左右的片段，進一步純化后的產(chǎn)物即為最終的文庫。測序過程中加入4種不同標記的dNTP，在測序鏈延伸時會發(fā)出不同的熒光，測序儀根據(jù)不同的熒光信號獲得序列信息。該試驗的文庫構(gòu)建及測序均由上海凌恩生物科技有限公司完成。

1.3 轉(zhuǎn)錄組組裝及分析

使用Trimmomatic（0.36）對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，利用Trinity（2.8.6）進行有效數(shù)據(jù)的拼接，使用Salmon對轉(zhuǎn)錄組拼接結(jié)果作進一步比對，檢測拼接的完整性，之后對拼接結(jié)果進行NR（OG）GO和KEGG注釋，掌握序列的功能信息。

2 結(jié)果與分析

2.1 ‘赤紅’紫薇的轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果及組裝

試驗結(jié)果顯示，‘赤紅’葉片經(jīng)轉(zhuǎn)錄組測序共獲得17 551 546條reads，堿基數(shù)量為2 632 731 900個。為了獲得clean date，對原始數(shù)據(jù)中的接頭序列進行去除，并篩選掉質(zhì)量較低的堿基和短序列，最終獲得clean reads 17 445 972條，共計2 608 482 278個堿基，Q20%高達98.82%，Q30%高達95.87%，GC含量占比為52.21%，表明獲得的紫薇品種‘赤紅’轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，可進行序列分析。

對于沒有參考基因組的物種，采用無參的方式進行測序，并對測序結(jié)果進行組裝。利用Trinity（2.8.6）對‘赤紅’測序數(shù)據(jù)進行從頭組裝，共獲得23 791條unigene，總長度為26 571 634 bp，最長unigene長度為7 123 bp，unigene平均長度為1 116.88 bp，N50為1 440 bp，并將獲得的拼接序列與clean data進行比對，比對率達到91.49%。該結(jié)果說明‘赤紅’轉(zhuǎn)錄組的拼接效果較好。對拼接序列的長度進行分析，其中401～600 bp長度的序列占比最高，其次是601～800 bp的序列（圖1）。

2.2 ‘赤紅’紫薇的unigene在各大數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果

為了掌握基因的功能，利用NR、GO、COG、KEGG、SWISS這5大數(shù)據(jù)庫對獲得的23 791條unigene進行注釋，共有21 878條基因獲得了注釋信息，占所有unigene的91.96%（圖2）。其中，NR數(shù)據(jù)庫比對到的序列數(shù)量最多，達到21 872條，占比91.93%；其次在SWISS數(shù)據(jù)庫比對到16 166條unigene，占比67.95%；第三在COG數(shù)據(jù)庫注釋到14 378條（占比60.43%）；第四在GO數(shù)據(jù)庫注釋到12 222條（占比51.37%）；在KEGG數(shù)據(jù)庫注釋到的unigene最少，為8 430條（占比35.43%）。另外，有5 517條unigene在所有數(shù)據(jù)庫中均比對到，占比為23.19%。

2.2.1 NR數(shù)據(jù)庫注釋 NR數(shù)據(jù)庫的注釋結(jié)果可以幫‘赤紅’紫薇找到近緣物種，從而從同源序列的角度分析基因的功能。在NR數(shù)據(jù)庫中，‘赤紅’紫薇所有的unigene僅比對到1個物種——石榴（Punica granatum L.），表明同屬于千屈菜科的紫薇和石榴親緣關(guān)系較近，在后續(xù)的序列功能驗證中，具有較高程度的可參考性。

2.2.2 COG數(shù)據(jù)庫注釋 在COG數(shù)據(jù)庫中，14 378條unigene注釋到25個類別中（圖3），其中翻譯后修飾、蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)換、伴侶蛋白（O）等比對到的基因數(shù)量最多，表明‘赤紅’葉片在蛋白作用的路徑中表達活躍；其次，功能未知（S）的基因占比也較高，表明‘赤紅’葉片中有一定比例的基因還未得到驗證；信號傳導(dǎo)機制（T），轉(zhuǎn)錄（K），翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)與生物發(fā)生（J）排在KOG預(yù)測的前5位，說明‘赤紅’葉片中信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和蛋白翻譯活動比較活躍。

2.2.3 GO數(shù)據(jù)庫注釋 對‘赤紅’葉片轉(zhuǎn)錄本進行GO注釋，有12 222條unigene比對到相應(yīng)功能，包括生物過程、細胞組分和分子功能3個大類和42個功能亞類（圖4）。生物過程中注釋到的unigene最多，特別是其中的細胞進程和代謝過程，而碳利用、氮素利用和生物礦化比對到的基因相對較少；其次是分子功能，其中催化活性和結(jié)合比對到的基因數(shù)量最多，蛋白標簽、養(yǎng)分庫活性和小分子傳感器活性比對到的數(shù)量相對較少；在細胞組分中比對到4個亞類，基因數(shù)量最多的是細胞解刨學(xué)實體，基因數(shù)量最少的是其他器官部分。

2.2.4 KEGG數(shù)據(jù)庫注釋 在KEGG通路分析中，將‘赤紅’轉(zhuǎn)錄組中的unigene按照功能分為5大類和21個亞類（圖5和圖6），占比最多的大類是代謝，包括11個亞類；其中，全局和概述圖譜比對上4 554條unigene，其次是碳水化合物代謝，比對到996條，氨基酸代謝比對到526條，能量代謝比對到459條，酯類代謝比對到439條，表明在‘赤紅’紫薇葉片中進行著活躍的代謝活動。第二大類是遺傳信息處理，包括5個亞類，翻譯過程中比對到的unigene最多，達到806條，其次是折疊、分類和降解，比對到691條，病毒信息中比對到的數(shù)量最少，為33條。第三大類為細胞過程，包括2個亞類，分別為運輸和分解代謝（比對到449條）和細胞運動（比對到156條）。第四大類為環(huán)境信息處理，包括2個亞類，分別為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（比對到475條）和膜轉(zhuǎn)運（比對到34條）。最后一類為有機系統(tǒng)，比對到247條unigene，注釋到的通路為環(huán)境適應(yīng)。

2.3 SSR分析

‘赤紅’紫薇葉片轉(zhuǎn)錄組中共有4 775個SSR位點被檢測到，包括6種核苷酸重復(fù)類型（圖7）。雙核苷酸重復(fù)位點最多，為1 938個，占比達到40.59%，AG/CT類型數(shù)量最多；其次為單核苷重復(fù)位點，為966個，占比為 20.23%，A/T重復(fù)占據(jù)比例最高；三核苷酸重復(fù)位點有1 771個，占比為37.09%，包括10種類型；四核苷酸位點重復(fù)為66個，占1.38%；五核苷酸位點重復(fù)為20個，占比為0.42%，六核苷酸位點重復(fù)數(shù)最少為14個，占比0.29%。

2.4 葉片色素代謝相關(guān)基因鑒定

對紫黑色葉形成的分子機理進行探究，分析KEGG注釋flavonoid biosynthesis、flavone and flavonol"biosynthesis、isoflavonoid biosynthesis和anthocyanin biosynthesis通路中的基因。在flavonoid biosynthesis通路中，注釋到的基因包括CHS、FLS、CYP73A、DFR、F3H、CYP98A、CYP75B1、LAR、caffeoyl-CoA"O-methyltransferase、HCT、chalcone isomerase、caffeoyl-CoA O-methyltransferase。在flavone and flavonol"biosynthesis通路中僅注釋到CYP75B1這1個基因；isoflavonoid biosynthesis通路中注釋到CYP81E、7-IOMT這2個基因。在紅、紫主要顯色的通路anthocyanin biosynthesis中注釋到UGT79B1、BZ1、UGT75C1這3個基因，推測是紫薇葉片中紫色形成的關(guān)鍵基因。

3 討論與結(jié)論

對黑紫色葉紫薇品種‘赤紅’葉片進行高通量測序，最終獲得clean reads 17 445 972條，共計2 608 482 278個堿基，Q20%高達98.82%，Q30%高達95.87%，GC含量占比為52.21%，表明獲得的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)質(zhì)量較高，測序結(jié)果有效。利用Trinity（2.8.6）對‘赤紅’測序數(shù)據(jù)進行從頭組裝，共獲得23 791條unigene，其中91.86%的序列在NR、GO、COG、KEGG等5大數(shù)據(jù)庫中得到注釋。在NR數(shù)據(jù)庫中，‘赤紅’紫薇所有的unigene僅比對到1個物種——石榴（Punica granatum L.），表明同屬于千屈菜科的紫薇和石榴親緣關(guān)系較近[14]。從COG注釋結(jié)果可以看出，紫薇葉片中蛋白作用和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)活動比較活躍。

功能注釋的最終目的是為了定位到相關(guān)基因，前人對紫薇黃葉突變體進行轉(zhuǎn)錄組測序，獲得了葉綠體合成和分解途徑的關(guān)鍵基因，并證實其在葉片黃化中起關(guān)鍵作用[15]。Qiao等[16]研究發(fā)現(xiàn)，紫色葉色素合成的關(guān)鍵基因主要富集在類黃酮–花青素合成通路中。同時也有研究認為，F(xiàn)3’5’ H 和F3’H在紫薇花色多樣性中起到了關(guān)鍵作用[17-18]。該研究中共篩選到18個與色素合成代謝相關(guān)的基因，其中與花青素相關(guān)的基因有3個，分別為UGT79B1、BZ1、UGT75C1，推測這些基因可能是‘赤紅’葉片的紫黑色呈現(xiàn)的關(guān)鍵基因。SSR分析能夠評估品種間的親緣關(guān)系[19]，且有研究表明紫薇的SSR類型主要集中在雙核苷酸、三核苷酸和單核苷酸重復(fù)[20]，主要的重復(fù)類型為A/T和AG/CT，該研究也得到了類似的結(jié)果。

研究通過對紫薇品種‘赤紅’葉片進行轉(zhuǎn)錄組測序和分析，獲得了葉片轉(zhuǎn)錄組中大量的注釋信息，并對色素合成相關(guān)通路的基因進行篩選，得到與花青素合成相關(guān)的關(guān)鍵基因UGT79B1、BZ1、UGT75C1，推測其在‘赤紅’葉片紫黑色呈現(xiàn)上起關(guān)鍵作用。

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（責任編輯：成平）